一种用于替代韩信草制备宫颈癌治疗药物的组合物及其测定方法

摘要

本发明公开了一种用于替代韩信草制备宫颈癌治疗药物的组合物及其测定方法。由野黄芩苷、粗毛豚草素、汉黄芩苷、白杨素和芹菜素组成的组合物基本可以等效替代韩信草对p62基因表达的抑制效应，二者强度相当；该组合物可以用于等效替代韩信草制备p62基因表达抑制剂；本领域技术人员知道，抑制p62基因表达可以有效抑制宫颈癌细胞的增殖(RNA干扰抑制p62基因表达对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响，蚌埠医学院学报2018年1月第43卷第1期)，因此，该组合物可以用于等效替代韩信草制备宫颈癌治疗药物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于替代韩信草制备肿瘤治疗药物的组合物及其测定方法。

背景技术

韩信草为唇形科黄芩属植物韩信草Scutellaria indica L.的带根全草，具有清热解毒，活血止痛的功效，广泛分布于我国浙江、江苏、河南、广西、广东、湖南、福建、安徽、云南、四川等地。韩信草始载于《生草药性备要》，民间常用其治疗痈肿疔毒、蛇伤、肺热咳喘、牙痛、咽喉疼痛、咯血、吐血、筋骨疼痛、跌打损伤、创伤出血、皮肤瘙痒等症状。

以全草入药存在成分复杂、药效成分不明确、质量不易控制的缺陷。如果能够找到可以替代韩信草入药的组合物，就可以用化学勾兑品替代韩信草入药，成分清楚、质量可控。

韩信草中主要含有野黄芩苷、粗毛豚草素、汉黄芩苷、白杨素、芹菜素、汉黄芩素等。目前，并不知道这些成分中哪几种组合可以基本替代韩信草的药效。

发明内容

本发明第一目的在于提供一种用于替代韩信草制备肿瘤治疗药物的组合物；

本发明第二目的在于提供上述组合物的测定方法。

本发明的目的通过下面的技术方案实现：

第一部分：宫颈癌等效组合物

一种用于等效替代韩信草制备p62基因表达抑制剂的组合物：

由野黄芩苷、粗毛豚草素、汉黄芩苷、白杨素和芹菜素组成。

上述组合物在等效替代韩信草制备p62基因表达抑制剂方面的应用。

一种用于等效替代韩信草制备宫颈癌治疗药物的组合物：

由野黄芩苷、粗毛豚草素、汉黄芩苷、白杨素和芹菜素组成。

上述组合物在等效替代韩信草制备宫颈癌治疗药物方面的应用。

一种测定上述组合物中各化学成分在韩信草中含量的HPLC方法，包括如下色谱参数：

色谱柱：C18填料色谱柱；

流动相：乙腈(A)-0.3％冰乙酸溶液(B)；

洗脱程序：0～20min，10％～20％A；20～30min，20％～30％A；30～50min，30％～50％A；50～60min，50％A。

优选地，采用Agilent 1100液相色谱仪。

优选地，采用Kromasil 100-5-C18液相色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)。

更优选地，色谱柱规格为250mm×4.6mm，5μm。

优选地，柱温为35℃。

优选地，检测波长为280nm。

优选地，流动相流速为1.0mL/min。

优选地，进样量为20μL。

第二部分：卵巢癌等效组合物

一种用于等效替代韩信草制备LSD1基因表达抑制剂的组合物：

由野黄芩苷、粗毛豚草素、白杨素、芹菜素和汉黄芩素组成。

上述组合物在等效替代韩信草制备LSD1基因表达抑制剂方面的应用。

一种用于等效替代韩信草制备卵巢癌治疗药物的组合物：

由野黄芩苷、粗毛豚草素、白杨素、芹菜素和汉黄芩素组成。

上述组合物在等效替代韩信草制备卵巢癌治疗药物方面的应用。

一种测定上述组合物中各化学成分在韩信草中含量的HPLC方法，包括如下色谱参数：

色谱柱：C18填料色谱柱；

流动相：乙腈(A)-0.3％冰乙酸溶液(B)；

洗脱程序：0～20min，10％～20％A；20～30min，20％～30％A；30～50min，30％～50％A；50～60min，50％A。

优选地，采用Agilent 1100液相色谱仪。

优选地，采用Kromasil 100-5-C18液相色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)。

更优选地，色谱柱规格为250mm×4.6mm，5μm。

优选地，柱温为35℃。

优选地，检测波长为280nm。

优选地，流动相流速为1.0mL/min。

优选地，进样量为20μL。

有益效果：

(1)由野黄芩苷、粗毛豚草素、汉黄芩苷、白杨素和芹菜素组成的组合物基本可以等效替代韩信草对p62基因表达的抑制效应，二者强度相当；该组合物可以用于等效替代韩信草制备p62基因表达抑制剂；本领域技术人员知道，抑制p62基因表达可以有效抑制宫颈癌细胞的增殖(RNA干扰抑制p62基因表达对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响，蚌埠医学院学报2018年1月第43卷第1期)，因此，该组合物可以用于等效替代韩信草制备宫颈癌治疗药物；

(2)由野黄芩苷、粗毛豚草素、汉黄芩苷、白杨素和芹菜素组成的组合物中，粗毛豚草素对p62基因表达的独立抑制率是9％，其他4种成分对p62基因表达的独立抑制率是15％，二者之和(9％+15％＝24％)显著小于5种成分对p62基因表达的组合抑制率42％，这种1+1＜2的现象体现了该组合物中粗毛豚草素与其他4种成分存在明显的协同抑制p62基因表达的效应；

(3)由野黄芩苷、粗毛豚草素、白杨素、芹菜素和汉黄芩素组成的组合物基本可以等效替代韩信草对LSD1基因表达的抑制效应，二者强度相当；该组合物可以用于等效替代韩信草制备LSD1基因表达抑制剂；本领域技术人员知道，抑制LSD1基因表达可以有效抑制卵巢癌细胞的增殖(沉默LSD1基因的表达可抑制卵巢癌HO8910细胞的增殖并诱导其凋亡，肿瘤2016年5月第36卷第5期)，因此，该组合物可以用于等效替代韩信草制备卵巢癌治疗药物；

(4)由野黄芩苷、粗毛豚草素、白杨素、芹菜素和汉黄芩素组成的组合物中，粗毛豚草素对LSD1基因表达的独立抑制率是10％，其他4种成分对LSD1基因表达的组合抑制率是19％，二者之和(10％+19％＝29％)显著小于5种成分对LSD1基因表达的组合抑制率45％，这种1+1＜2的现象体现了该组合物中粗毛豚草素与其他4种成分存在明显的协同抑制LSD1基因表达的效应。

附图说明

图1为韩信草药物及组合物对HeLa细胞p62基因的表达水平的影响；

图2为韩信草药物及组合物对HO-8910人卵巢癌细胞LSD1基因的表达水平的影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。

一、实验材料

韩信草药材购于亳州药材市场，产地为四川，粉碎后55℃烘干过夜，干燥保存备用。

Agilent 1100液相色谱仪；Sartorius BS210S型电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；Sartorius CP225D型电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)购自美国天地(TEDIA)；水为娃哈哈纯净水。

RNAiso plus试剂、SYBRGreen PCRMaster Mix和PrimeScript RT试剂盒购自TaKaRa。

二、实验方法

1、野黄芩苷、粗毛豚草素、汉黄芩苷、白杨素、芹菜素、汉黄芩素在韩信草中含量测定

HPLC方法包括如下色谱参数：

色谱仪：Agilent 1100液相色谱仪

色谱柱：Kromasil 100-5-C18液相色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；

流动相：乙腈(A)-0.3％冰乙酸溶液(B)；

洗脱程序：0～20min，10％～20％A；20～30min，20％～30％A；30～50min，30％～50％A；50～60min，50％A；

柱温：35℃。

检测波长：280nm。

流动相流速：1.0mL/min。

进样量：20μL。

供试品溶液的制备：将韩信草药材粉碎，过40目筛，精密称取10g，置圆底烧瓶中，加入70％乙醇40mL，水浴回流2h，滤过，取滤液，重复3次。合并滤液，蒸去乙醇后干燥，得粉末。将粉末溶于250mL甲醇，过微孔滤膜，即得。

精密量取供试品溶液20μL注入液相色谱仪，用标准品外标法测定野黄芩苷、粗毛豚草素、汉黄芩苷、白杨素、芹菜素、汉黄芩素在韩信草中的含量。

2、细胞培养

宫颈腺癌HeLa细胞、HO-8910人卵巢癌细胞分别在含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中，37℃、5％CO₂条件下传代培养。取对数生长期细胞用于实验。

3、药物制备

韩信草药物：将韩信草药材粉碎，过40目筛，精密称取10g，置圆底烧瓶中，加入70％乙醇40mL，水浴回流2h，滤过，取滤液，重复3次。合并滤液，蒸去乙醇后干燥，得粉末。

组合物药物所含成分种类如下表，各成分按照在韩信草的含量比例用标准品勾兑制得。

序号数量所含成分种类组合物药物15野黄芩苷、粗毛豚草素、汉黄芩苷、白杨素、芹菜素组合物药物25野黄芩苷、粗毛豚草素、白杨素、芹菜素、汉黄芩素组合物药物34野黄芩苷、汉黄芩苷、白杨素、芹菜素组合物药物44野黄芩苷、白杨素、芹菜素、汉黄芩素组合物药物51粗毛豚草素

4、分组及给药

将浓度为5.5×10⁴/mL的HeLa细胞悬液接种于96孔板中，培养24h后，分别加入韩信草药物、组合物药物1、组合物药物3、组合物药物5使其终浓度相当于韩信草药材1500μg/mL，同时设阴性对照组，每组6个平行孔，37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养72h后，离心弃上清液，PBS洗涤、收集细胞，备用。

将浓度为5.5×10⁴/mL的HO-8910人卵巢癌细胞悬液接种于96孔板中，培养24h后，分别加入韩信草药物、组合物药物2、组合物药物4、组合物药物5使其终浓度相当于韩信草药材1500μg/mL，同时设阴性对照组，每组6个平行孔，37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养72h后，离心弃上清液，PBS洗涤、收集细胞，备用。

5、qRT-PCR测定HeLa细胞p62基因和HO-8910人卵巢癌细胞LSD1基因的表达水平

收集上述细胞，用PBS洗涤细胞3次，按照RNAiso Plus试剂盒操作手册提取细胞总RNA，并用紫外分光光度法行定量分析。采用PrimeScript RT试剂盒将RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用SYBR-Green PCR Master Mix试剂盒进一步行PCR扩增。

p62基因上游引物序列为5’-TTTTCACTGTCAATTCACTGCA-3’；

p62基因下游引物序列为5’-GGAGGCGAGGATGGAGGAA-3’；

LSD1基因上游引物序列为5’-CAAGTGTCAATTTGTTCGGG-3’；

LSD1基因下游引物序列为5’-TTCTTTGGGCTGAGGTACTG-3’；

内参GAPDH基因上游引物序列为5’-GCAAATTCCATGGCACCGTC-3’；

内参GAPDH基因下游引物序列为5’-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3’。

PCR反应条件：90℃ 30s，1个循环；95℃ 5s、60℃ 30s，共40个循环。以2^-ΔΔCt值(Ct代表循环阈值)表示p62>

6、统计学方法

采用Graph PadPrism 5软件进行数据的统计和分析。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

三、实验结果

1、野黄芩苷、粗毛豚草素、汉黄芩苷、白杨素、芹菜素、汉黄芩素在韩信草中的含量

野黄芩苷、粗毛豚草素、汉黄芩苷、白杨素、芹菜素、汉黄芩素在韩信草中含量如下表。

化合物名称含量(mg/g)化合物名称含量(mg/g)野黄芩苷1.78白杨素0.031粗毛豚草素0.065芹菜素0.16汉黄芩苷0.29汉黄芩素0.13

2、韩信草药物及组合物对HeLa细胞p62基因的表达水平的影响

韩信草药物、组合物药物1、组合物药物3、组合物药物5对HeLa细胞p62基因的表达水平的影响如下表和图1所示。

组别p62 mRNA/GAPDH mRNA抑制率阴性对照组1.00/韩信草药物(相当于韩信草药材1500μg/mL)0.5644％组合物药物1(相当于韩信草药材1500μg/mL)0.5842％组合物药物3(相当于韩信草药材1500μg/mL)0.8515％组合物药物5(相当于韩信草药材1500μg/mL)0.919％

上述实验结果说明：

(1)由野黄芩苷、粗毛豚草素、汉黄芩苷、白杨素和芹菜素组成的组合物基本可以等效替代韩信草对p62基因表达的抑制效应，二者强度相当；该组合物可以用于等效替代韩信草制备p62基因表达抑制剂；本领域技术人员知道，抑制p62基因表达可以有效抑制宫颈癌细胞的增殖(RNA干扰抑制p62基因表达对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响，蚌埠医学院学报2018年1月第43卷第1期)，因此，该组合物可以用于等效替代韩信草制备宫颈癌治疗药物；

(2)由野黄芩苷、粗毛豚草素、汉黄芩苷、白杨素和芹菜素组成的组合物中，粗毛豚草素对p62基因表达的独立抑制率是9％，其他4种成分对p62基因表达的独立抑制率是15％，二者之和(9％+15％＝24％)显著小于5种成分对p62基因表达的组合抑制率42％，这种1+1＜2的现象体现了该组合物中粗毛豚草素与其他4种成分存在明显的协同抑制p62基因表达的效应。

3、韩信草药物及组合物对HO-8910人卵巢癌细胞LSD1基因的表达水平的影响

韩信草药物、组合物药物2、组合物药物4、组合物药物5对HO-8910人卵巢癌细胞LSD1基因的表达水平的影响如下表和图2所示。

组别LSD1 mRNA/GAPDH mRNA抑制率阴性对照组1.00/韩信草药物(相当于韩信草药材1500μg/mL)0.5743％组合物药物2(相当于韩信草药材1500μg/mL)0.5545％组合物药物4(相当于韩信草药材1500μg/mL)0.8119％组合物药物5(相当于韩信草药材1500μg/mL)0.9010％

上述实验结果说明：

(1)由野黄芩苷、粗毛豚草素、白杨素、芹菜素和汉黄芩素组成的组合物基本可以等效替代韩信草对LSD1基因表达的抑制效应，二者强度相当；该组合物可以用于等效替代韩信草制备LSD1基因表达抑制剂；本领域技术人员知道，抑制LSD1基因表达可以有效抑制卵巢癌细胞的增殖(沉默LSD1基因的表达可抑制卵巢癌HO8910细胞的增殖并诱导其凋亡，肿瘤2016年5月第36卷第5期)，因此，该组合物可以用于等效替代韩信草制备卵巢癌治疗药物；

(2)由野黄芩苷、粗毛豚草素、白杨素、芹菜素和汉黄芩素组成的组合物中，粗毛豚草素对LSD1基因表达的独立抑制率是10％，其他4种成分对LSD1基因表达的组合抑制率是19％，二者之和(10％+19％＝29％)显著小于5种成分对LSD1基因表达的组合抑制率45％，这种1+1＜2的现象体现了该组合物中粗毛豚草素与其他4种成分存在明显的协同抑制LSD1基因表达的效应。