一株m5-2佩立金平脐蠕孢Bipolaris peregianensis及其应用

摘要

本发明涉及一株m5‑2佩立金平脐蠕孢

说明书

技术领域

本发明属于生物防治领域，具体涉及一株m5-2佩立金平脐蠕孢Bipolaris>peregianensis及其应用。

背景技术

化学除草剂因其作用迅速、使用简便等特性，在我国得到了迅速发展，然而，随着化学药剂的广泛使用使得环境巨大污染和农药残留问题严重影响了农业生态的可持续发展。因此，生物农药的开发与利用在环保农业及杂草综合治理 (IPM)中扮演了重要的角色。微生物除草剂是一类以微生物活体及其代谢产物为原料研制而成的除草剂，因其对环境危害小而成为除草剂领域一个重要的研究方向。近来研究发现，植物病原真菌活体及其分泌的次生代谢产物具有除草活性。利用杂草病原真菌活体及其次生代谢产物开发微生物除草剂，一般具有作用位点和作用方式多样性的特点，杂草不易产生抗药性、开发成本低、对环境无害，显示出良好的开发应用前景。

狗牙根 (Cynodon> (Linn.) Pers.) 又名百慕大草，其广泛分布于世界各地区。为多年生草本植物，是良好的固堤保土植物，常用以铺建草坪或球场；但当生长于果园或农田时，则为难除灭的有害杂草。狗牙根繁殖能力强、生长速度快、生长期长、适应性强，在各种土壤环境中均可生长。农田的狗牙根还常与农作物竞争水份和养份，严重影响作物生长发育和品质产量，严重时甚至可形成优势种群密被田间，造成作物严重减产。

对狗牙根杂草的防除办法目前主要还是依靠人工或化学方法，人工除草费工费时，而化学除草又造成环境污染并导致杂草种群抗性的产生，所以寻求除以上两种方法以外的防除狗牙根的方法已经变得愈加迫切。目前生物除草剂的研究和开发日益受到重视，利用微生物控制杂草危害正在成为一条有效的新途径，也具有巨大的市场前景。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中狗牙根杂草的防除费工费时，易造成环境污染并导致杂草种群抗性的产生的缺陷，提供一株m5-2>Bipolaris>peregianensis。本发明提供的m5-2>Bipolaris>可有效防除禾本科杂草。

本发明的另一目的在于提供该m5-2>Bipolaris>在除杂草中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种除草剂。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一株m5-2>Bipolaris>，所述菌株于2016年7月11日，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号：GDMCC.NO:60057。

本发明的新菌株m5-2（Bipolaris>）已于2016年7月11日，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号：GDMCC.NO:60057。该菌株经形态学和分子生物学鉴定为佩立金平脐蠕孢，隶属于旋孢腔菌属(Cochliobolus>Drechsler ) [无性阶段:平脐蠕孢属(Bipolaris>

发明人是通过以下途径获得该菌株并进行鉴定的，对我国多个地区禾本科病害进行调查，发现狗牙根病害后，详细记录病害症状并拍摄田间为害症状，采集发病的杂草叶片和茎秆，带回实验室后进行镜检。

病原菌的分离与纯化过程如下：

发病狗牙根染病叶片上出现褐色至暗紫色的椭圆形、梭形的斑点，随着斑点扩大，叶鞘、茎、根部也受到感染。潮湿的条件下叶片表面生成黑色霉状物，即为分生孢子梗，当发病较为严重时，多数植株枯萎死亡，并形成黑褐色的枯草斑。选择病斑典型的发病杂草叶片冲洗干净后，从发病部位的病健交界处切取3 mm × 3 mm的小块组织，样本剪取完成后置于2.5%的次氯酸钠溶液中消毒1 min，之后再用无菌水换洗3 次，移入马铃薯葡萄糖琼脂［PDA，添加庆大霉素(1mL/L) 以抑制细菌生长］培养基上，25℃恒温培养。病原菌经纯化后保存于PDA斜面培养基上，置于4℃冰箱贮存备用。

优选地，所述菌株的rDNA-ITS序列如SEQ ID NO：1所示。

优选地，所述菌株为在PDA培养基上培养5d后形成的菌落直径为70 mm，黑色，毡状，菌落背面灰褐色；所述菌株的菌丝黄褐色，有分枝，多隔膜，分生孢子梗单生，少数集生，圆筒状或屈膝状，褐色，长达94.5~147 μm，宽4~9 μ m；分生孢子弯曲，纺锤形，宽椭圆形，暗褐色，具6~10个假隔膜，大小58.5~84.5×13.5~18.5 μm。

该病原菌的形态学鉴定如下：

对分离获得的真菌进行单孢纯化和培养，将菌株接种在PDA培养基上，25 ℃恒温培养5d之后观察记录各菌落形态。持续观察病原菌菌落分生孢子的产生情况，并在光学显微镜下观察其形态及产孢结构特征，测量50个病原菌孢子和孢子梗大小等，查阅相关专著文献进行鉴定。在PDA培养基上25℃下生长5 d后，培养的菌落直径达70 mm，黑色，毡状，菌落背面灰褐色。菌落在PDA培养基上不易产孢，菌丝黄褐色，有分枝，多隔膜，分生孢子梗单生，少数集生，圆筒状或屈膝状，褐色，长达94.5~147 μm，宽4~9 μ m。分生孢子弯曲，纺锤形，宽椭圆形，暗褐色，具6~10个假隔膜，多数9个，大小58.5~84.5×13.5~18.5 μm。通过形态学和培养性状观测，并查考文献 [Manamgoda, D. S., Rossman, A. Y., Castlebury, L. A.,Crous, P. W., Madrid, H., Chukeatirote, E., & Hyde, K. D. (2014). The genusbipolaris.>79,>Bipolaris>)。

该病原菌的分子生物鉴定如下：

将供试菌株转移至新鲜的PDA培养基上培养10天，用灭菌的接种针将菌丝刮下，参照DNA secure新型植物基因组DNA提取试剂盒说明书（Takara, 大连）对病原菌基因组进行提取。利用White等设计rDNA-ITS 区通用引物ITS-1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS-4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）（上海生工生物有限公司合成），以分离自狗牙根病原菌基因组为模板进行PCR扩增，预期产物约580 bp。PCR扩增体系：2×Taq PCR MasterMix 25 μL（Takara, 大连），20μ mol/Ｌ引物各1μL，模板DNA 1μL，加灭菌双蒸水至50μL。PCR 反应条件：94℃预热4min；94℃ 40s，62℃ 45s，72℃ 1min，共32个循环；72℃延伸10 min。将所有PCR 产物分别加入0.1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，经溴化乙锭染色后，于凝胶成像仪检测，将PCR产物上海生工有限公司（生工, 上海）进行DNA测序。将分离所得病原菌的ITS序列与Gen-Bank核酸数据库进行比对，根据病菌的形态特征、培养性状和致病性，结合序列分析，对病原菌进行鉴定。并用MEGA5.0进行系统发育分析和进化树构建，用Neighbor-joining法构建进化树，自展次数为1000次。对病原菌菌株m5-2的r DNA-ITS序列进行扩增后，将PCR产物纯化后测序，测序分别获得580 bp左右的r DNA-ITS序列片段，与期望片段大小相符。利用NCBI 网站中的BLAST软件，对所测菌株的序列进行同源性比对：该菌株病原菌与佩利金平脐蠕孢的同源性均达到了99 %。通过序列比对结果辅助证明狗牙根致病菌是B.>peregianensis。从构建的系统发育树可知，分离自狗牙根的佩利金平脐蠕孢和NCBI数据库已有B.>聚在同一分类单元，而平脐蠕孢属 (Bipolaris)不能聚在一个分支，从而证明从本发明菌株是佩利金平脐蠕孢。

本发明还请求保护上述m5-2>Bipolaris>在除杂草中的应用。

优选地，所述杂草为禾本科杂草。

更为优选地，所述禾本科杂草为狗牙根、牛筋草、马唐或硬骨草。

该m5-2>Bipolaris>可适用于非禾本科种植区的农田和园林中，优选用于双子叶植物、果园以及园林环境中防除禾本科杂草。

一种除草剂，所述除草包括上述菌株m5-2>Bipolaris>peregianensis的粗毒素、活体细胞菌丝和分生孢子的混合体。

本发明所指的粗毒素为该菌株的次生代谢产物。

本发明提供的除草剂对环境友好，可抑制杂草的耐药和抗药性发展，有利于绿色食品和有机农业的推广，并且成本低、无污染、对农作物安全。

该除草剂中的粗毒素、活体细胞菌丝和分生孢子的混合体可通过如下方法制备得到：取所述菌株m5-2>Bipolaris>在培养5 d后的病原菌菌落边缘打取菌饼5片接种于马铃薯粉琼脂液体培养基中，于摇床内25 ℃ 培养10 d，然后过滤，得到菌株的粗毒素提取液和活体细胞菌丝与分生孢子混合体。

该除草剂可加工成多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂、水分散粒剂等，优选加工成适于喷洒施用的剂型。上述剂型所使用的载体是农药学上可接受的载体，优选农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体，可以是固体的或液体的形式。固体载体的实例包括矿物，如粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土；植物材料，如玉米粉、豆粉或淀粉；高分子化合物，如聚乙烯醇、聚二醇。液体载体的实例包括各种有机溶剂，如癸烷和十二烷、植物油、矿物油和水。

根据需要，本发明的除草剂可使用表面活性剂、粘合剂、稳定剂等助表面活性剂，如吐温20、吐温80等，稳定剂可使用抗氧化剂或PH调剂等。本发明提供的除草剂中的分生孢子数量随制剂的形式和施用的方法而变化。

优选地，当所述除草剂为粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂（即固体制剂）时，所述除草剂中分生孢子的数量为1×10⁵~1×10⁸个孢子/克。

更为优选地，所述除草剂中分生孢子的数量为1×10⁶~1×10⁷个孢子/克。

优选地当所述除草剂为液剂、乳剂或悬浮剂时，所述除草剂的喷洒液中分生孢子的含量为1×10⁴~1×10^{6>个孢子/mL。}

更为优选地，所述除草剂的喷洒液中分生孢子的含量为1×10⁵~1×10^{6>个孢子/mL。}

本发明的除草剂可以与其它适合的化学除草剂配合使用，从而降低化学除草剂的用量，减少对环境的污染。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的从狗牙根病株获得的m5-2>Bipolaris>可有效防除禾本科杂草，由其制成的除草剂对环境友好，可抑制杂草的耐药和抗药性发展，有利于绿色食品和有机农业的推广，并且成本低、无污染、对农作物安全。

附图说明

图1为m5-2>Bipolaris>分生孢子图片。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

实施例1病原菌的分离和纯化、特性鉴定

（1） 病原菌的分离与纯化

发病狗牙根染病叶片上出现褐色至暗紫色的椭圆形、梭形的斑点，随着斑点扩大，叶鞘、茎、根部也受到感染。潮湿的条件下叶片表面生成黑色霉状物，即为分生孢子梗，当发病较为严重时，多数植株枯萎死亡，并形成黑褐色的枯草斑。选择病斑典型的发病杂草叶片冲洗干净后，从发病部位的病健交界处切取3 mm × 3 mm的小块组织，样本剪取完成后置于2.5%的次氯酸钠溶液中消毒1 min，之后再用无菌水换洗3 次，移入马铃薯葡萄糖琼脂［PDA，添加庆大霉素(1ml/L) 以抑制细菌生长］培养基上，25℃恒温培养。病原菌经纯化后保存于PDA斜面培养基上，置于4℃冰箱贮存备用。

（2）病原菌的形态学鉴定

对分离获得的真菌进行单孢纯化和培养，将菌株接种在PDA培养基上，25 ℃恒温培养5d之后观察记录各菌落形态。持续观察病原菌菌落分生孢子的产生情况，并在光学显微镜下观察其形态及产孢结构特征，测量50个病原菌孢子和孢子梗大小等，查阅相关专著文献进行鉴定。在PDA培养基上25℃下生长5 d后，培养的菌落直径达70 mm，黑色，毡状，菌落背面灰褐色。菌落在PDA培养基上不易产孢，菌丝黄褐色，有分枝，多隔膜，分生孢子梗单生，少数集生，圆筒状或屈膝状，褐色，长达94.5~147 μm，宽4~9 μm。分生孢子（如图1）弯曲，纺锤形，宽椭圆形，暗褐色，具6~10个假隔膜，多数9个，大小58.5~84.5×13.5~18.5 μm。通过形态学和培养性状观测，并查考文献 [Manamgoda, D. S., Rossman, A. Y., Castlebury, L.A., Crous, P. W., Madrid, H., Chukeatirote, E., & Hyde, K. D. (2014). Thegenus bipolaris.>79,>Bipolaris>)。

（3）病原菌的分子生物鉴定

将供试菌株转移至新鲜的PDA培养基上培养10天，用灭菌的接种针将菌丝刮下，参照DNA secure新型植物基因组DNA提取试剂盒说明书（Takara, 大连）对病原菌基因组进行提取。利用White等设计r DNA-ITS 区通用引物ITS-1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS-4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）（上海生工生物有限公司合成），以分离自狗牙根病原菌基因组为模板进行PCR扩增，预期产物约580 bp。PCR扩增体系：2×Taq PCR MasterMix 25 μL（Takara, 大连），20μ mol/L引物各1μL，模板DNA 1μＬ，加灭菌双蒸水至50μL。PCR 反应条件：94℃预热4min；94℃ 40ｓ，62℃ 45ｓ，72℃ 1min，共32个循环；72℃延伸10 min。将所有PCR 产物分别加入0.1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，经溴化乙锭染色后，于凝胶成像仪检测，将PCR产物上海生工有限公司（生工，上海）进行DNA测序。将分离所得病原菌的ITS序列与Gen-Bank核酸数据库进行比对，根据病菌的形态特征、培养性状和致病性，结合序列分析，对病原菌进行鉴定。并用MEGA5.0进行系统发育分析和进化树构建，用Neighbor-joining法构建进化树，自展次数为1000次。对病原菌菌株M5-2的rDNA-ITS序列进行扩增后，将PCR产物纯化后测序，测序分别获得580 bp左右的r DNA-ITS序列片段，与期望片段大小相符。利用NCBI 网站中的BLAST软件，对所测菌株的序列进行同源性比对：该菌株病原菌与佩利金平脐蠕孢的同源性均达到了99 %。通过序列比对结果辅助证明狗牙根致病菌是B.>peregianensis。从构建的系统发育树可知，分离自狗牙根的佩利金平脐蠕孢和NCBI数据库已有B.>聚在同一分类单元，而平脐蠕孢属 (Bipolaris)不能聚在一个分支，从而证明从本发明菌株是佩利金平脐蠕孢。。

具体的，rDNA-ITS序列如下：

TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACACAACAAAATATGAAGGCCTGGCTTCGCGGCCGGCTGAAATATTTTTTTTCACCCGTGTCTTTTGCGCACTTGTTGTTTCCTGGGCGGGCTCGCCCGCCACCAGGACCAAACCATAAACCTTTTTCTTTTGCAGTTTTCATCAGCGTCAGTAAAAAACAATGTAATTATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCTTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTTTTTTGTCTCTCCTTGCGGGAGACTCGCCTTAAAACGATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACATTTTTTGCGCTTTGTATCAGGAGAAAAGGACGGTACTCCATCAAGACGTTTACATTTTTAACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA。

实施例2m5-2>Bipolaris>的生物学试验

通过人工接种方法，测定m5-2菌株对常见杂草及作物苗期的致病性，以了解其寄主范围。

将供试植物(名单见表1)种子播种于直径10 cm的塑料花盆中，每种植物播种9盆，在为25℃，光周期为12 h更替的环境下培育。当供试植物达到2-4片真叶时进行接种，根据供试植物的植株大小每盆保留5~10株。

采用两种接种方法：(1)采用孢子悬浮液喷雾法接种：所述的菌株m5-2在PDA培养基培养10 d后，用无菌盖玻片刮取孢子，配备成1×10⁶个孢子/ml的水溶液。用微型喷雾器将混匀的孢子悬浮液均匀喷洒到供试植株上，每种植物接种3盆。(2)>

致病性测定结果

用该菌株孢子与粗毒素对9种杂草和5种作物进行除草活性检测，发现菌株分生孢子与粗毒素对供试杂草均具有一定的致死活性。其中菌饼对硬骨草、马唐、狗牙根、牛筋草等禾本科杂草致死率达到4级以上，粗毒素对该几种杂草的致死率均达到了5级。对积雪草、酢浆草、空心莲子草的致病性较强达到了2-3级，然而对一点红的致死率较弱，菌饼和粗毒素的致病性均为1级。对水稻和玉米有弱致病性，治病性强度为1-2级，而对大豆，西瓜和萝卜无致病性。对照叶片均无发病症状。

表1 菌株m5-2分生孢子与出毒素对不同植物的致病性

供试植株分生孢子粗毒素对照硬骨草450积雪草320酌浆草330马唐450一点红110狗牙根550空心莲子草230三叶鬼针草210牛筋草550水稻210玉米120大豆000西瓜000萝卜0000

注：病情分级标准：病情分级标准：0级为无植株发病；1级：发病叶片为1%~10%；2级：发病叶片为10%~30%；3级：发病叶片为30%~50%；4级：发病叶片为50%~70%；5级：发病叶片为70%~100%。

序列表

<110> 岭南师范学院

<120> 一株m5-2佩立金平脐蠕孢Bipolaris peregianensis及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 587

<212> DNA

<213> 佩立金平脐蠕孢(Bipolaris peregianensis)

<400> 1

tccgtaggtg aacctgcgga gggatcatta cacaacaaaa tatgaaggcc tggcttcgcg 60

gccggctgaa atattttttt tcacccgtgt cttttgcgca cttgttgttt cctgggcggg 120

ctcgcccgcc accaggacca aaccataaac ctttttcttt tgcagttttc atcagcgtca 180

gtaaaaaaca atgtaattat tacaactttc aacaacggat ctcttggttc tggcatcgat 240

gaagaacgca gcgaaatgcg atacgtagtg tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat 300

ctttgaacgc acattgcgcc ctttggtatt ccaaagggca tgcctgttcg agcgtcattt 360

gtaccttcaa gctttgcttg gtgttgggcg ttttttgtct ctccttgcgg gagactcgcc 420

ttaaaacgat tggcagccgg cctactggtt tcggagcgca gcacattttt tgcgctttgt 480

atcaggagaa aaggacggta ctccatcaag acgtttacat ttttaacttt tgacctcgga 540

tcaggtaggg atacccgctg aacttaagca tatcaataag cggagga 587

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