一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器的制备方法及应用

摘要

本发明属于免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器的制备方法及应用。本发明利用双金属Pd@Pt纳米粒子负载氨基功能化MoSe2作为催化材料，与检测抗体孵化后作为标记物，同时利用金纳米棒负载氨基功能化石墨烯作为电极修饰材料，成功构建了夹心型免疫传感器，从而实现了对肿瘤标志物NSE、SCCA的检测，具备灵敏度高，特异性强，检测限低等优势，对肿瘤的早期检测具有重要的科学意义和应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于纳米功能材料、免疫分析以及生物传感技术领域，涉及一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器的制备方法及应用。具体是采用Pd@Pt/MoSe₂为检测抗体标记物，实现了对肿瘤标志物NSE、SCCA的灵敏检测。

背景技术

癌症是严重威胁人类健康的高发病率和高死亡率的疾病。虽然恶性肿瘤的治疗技术在不断进步，但迄今为止，恶性肿瘤的早期发现、早期诊断和早期治疗仍然是治疗恶性肿瘤最有效的手段。肿瘤标志物是肿瘤细胞本身存在或分泌的特异性物质，绝大多数存在于恶性肿瘤中，血清中肿瘤标志物的检测对肿瘤预警及早期诊断具有重要的科学意义和应用前景。因此，降低肿瘤死亡率的主要途径是实现早期对肿瘤标志物的灵敏检测。目前临床血清肿瘤标志物的免疫检测方法主要有放射免疫法、酶联免疫法、时间分辨荧光免疫法等，但无法避免放射污染、耗时、灵敏度不够等缺点。因此，发明一种特异性强，灵敏度高，检测速度快，操作简便的免疫传感器十分重要。

电化学免疫传感器主要利用抗原与抗体间高度特异性结合的特性，将免疫分析法和电化学传感器相结合，具有分析灵敏度高、特异性强、使用简便及成本低等独特优势，已广泛用于各种肿瘤标志物的检测，同时在环境监测、食品安全控制、生物监测、临床检验等领域发挥重要作用。

金纳米棒负载氨基功能化石墨烯具有大的比表面积和良好的生物相容性，可以显著提高捕获Ab₁的固载量；石墨烯良好的电子传递能力可以增强电极的导电性。Pd@Pt/MoSe₂能够提供良好的催化作用，MoSe₂具有较大的比表面积能够提高Pd@Pt>2的固载量，同时减少贵金属的团聚作用。本发明采用金纳米棒负载氨基功能化石墨烯作为基底材料，Pd@Pt/MoSe₂作为催化材料与检测抗体进行孵化作为标记物，构建了用于肿瘤标志物检测的夹心型电化学免疫传感器。

发明内容

本发明提供了一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器的制备方法及应用，实现了对肿瘤标志物的灵敏检测。

本发明的目的之一是提供一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器的制备方法。

本发明的目的之二是将所制备的铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器应用于肿瘤标志物NSE、SCCA的高灵敏、特异性检测。

本发明的技术方案，包括以下步骤。

1. 一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器的制备方法，步骤如下：

（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉打磨成镜面，超纯水清洗干净；

（2）取6 µL、1.0 ~ 3.0 mg/mL的金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液滴涂到电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，晾干；

（3）将6 µL、8.0 ~ 12.0 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab₁滴加到电极表面，超纯水冲洗，4>

（4）继续将3 µL、0.5 ~ 2.0 mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 °C冰箱中晾干；

（5）滴加6 µL、0.1 pg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，4 °C冰箱中晾干；

（6）将6 µL、1.5 ~ 3.5 mg/mL检测抗体孵化物Pd@Pt/MoSe₂-Ab₂溶液滴至电极表面，置于4>

2.所述金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液的制备，步骤如下：

（1）金纳米棒溶液的制备

将95 ~ 105μL、质量分数为1%的氯金酸和350 ~ 370 mg十六烷基三甲基溴化铵加入到10 mL超纯水中，超声震荡15 ~ 20 min；磁力搅拌下快速加入50 ~ 70μL、0.1 mol/L新制备的硼氢化钠溶液，搅拌2 ~ 4 min，得到棕黄色的金纳米种子溶液；

将380 ~ 420 μL、质量分数为1%的氯金酸和700 ~ 780 mg十六烷基三甲基溴化铵及15~ 25 μL、0.1 mol/L硝酸银溶液加入到20 mL超纯水中，超声震荡25 ~ 45min；加入90 ~120 μL、0.1 mol/L新配制的抗坏血酸溶液，溶液由黄色变无色，加入20 μL金纳米种子溶液，震荡30 ~ 40 s，静置24 h，超纯水离心洗涤3次，再分散于10 mL超纯水中，得到金纳米棒溶液；

（2）氧化石墨烯的制备

将1 ~ 2 g石墨薄片和0.5 ~ 1 g硝酸钠依次加入装有23 mL浓硫酸的烧瓶中，在冰浴中搅拌30 min；搅拌下加入3 ~ 4 g高锰酸钾，加高锰酸钾的过程中保持反应温度低于20 °C，然后升温至35 °C并保持30 min，然后升温至90°C ~ 95°C并保持15 min，后缓慢加入50mL超纯水；再依次加入140 mL超纯水和10 ~ 15 mL、质量分数为30%的H₂O₂溶液，溶液变成亮黄色；离心分离，分别用1>

（3）金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液的制备

在50 mL的烧杯中加入40 ~ 50 mg氧化石墨烯和10 ~ 15 mL乙二醇，超声震荡30 min，加入0.3 ~ 0.4 mL、质量分数为25%的氨水，超声震荡5 min，将溶液转移到聚四氟乙烯高压釜中，180 °C反应10 ~ 14h，冷却至室温，无水乙醇离心洗涤，在30 °C的真空干燥箱中干燥12h，制得氨基化石墨烯；

将20 ~ 30 mg氨基功能化石墨烯加至10 mL上述步骤（1）制备的金纳米棒溶液中，震荡12 h，制得金纳米棒负载氨基化石墨烯。

3.所述检测抗体孵化物Pd@Pt/MoSe₂-Ab₂溶液的制备，步骤如下：

（1）功能化Pd NPs分散液的制备

依次取90 ~ 110 mg聚乙烯吡咯烷酮，550 ~ 650 mg溴化钾和60 ~ 70 mg抗坏血酸溶于8 mL超纯水中，加热至80 °C保持10 min；在磁力搅拌下加入50 ~ 70 mg四氯化钯酸钠，反应3 h后，依次用超纯水和丙酮离心洗涤3次，制得Pd NPs，重新分散在10 mL超纯水中制得Pd NPs分散液；

分别取180 ~ 200 mg十六烷基三甲基溴化铵和25 ~ 30 mg溴水杨酸溶于10 mL超纯水中；加入1.0 ~ 2.0 mL的Pd NPs分散液，超声震荡5 ~ 9 min，离心，用超纯水离心洗涤三次，重新分散在10 mL超纯水中，得到功能化Pd NPs分散液；

（2）Pd@Pt NPs分散液的制备

将250 ~ 270 μL、质量分数为1%是氯铂酸溶于5 mL超纯水中，加入1 mL功能化Pd NPs分散液，超声震荡1 ~ 2 min，快速加入1 mL、0.01mol/L的抗坏血酸溶液，快速震荡10 ~ 15s，静置8 ~ 10 h，超纯水离心洗涤，重新分散于10 mL超纯水中，制得Pd@Pt NPs分散液；

（3）氨基化MoSe₂的制备

将150 ~ 170 mg硒粉加入到5 mL、质量分数为85%水合肼中，磁力搅拌2 ~ 3 h，制得溶液A；将200 ~ 280 mg钼酸钠加入到20 mL超纯水中，制得溶液B；将A、B两溶液混合，磁力搅拌30 min，转移到聚四氟乙烯高压釜中，200 °C加热24 h，冷却至室温，无水乙醇和超纯水离心洗涤3次，在60 °C的真空干燥箱中干燥16 ~ 24h，制得MoSe₂；

将100 mg MoSe₂和160>2；

（4）Pd@Pt/MoSe₂的制备

将25 ~ 35 mg氨基化MoSe₂加至10>2，

（5）检测抗体孵化物Pd@Pt/MoSe₂-Ab₂溶液的制备

将4 ~ 8 mg的Pd@Pt/MoSe₂加至1>2溶液和900>2-Ab₂溶液，4>

4.肿瘤标志物的检测，包括以下步骤：

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.00 ~ 9.00磷酸盐缓冲溶液中进行测试；

（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间400 s；

（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的 pH = 7.0的磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。

上述所述肿瘤标志物选自下列之一：NSE、SCCA。

本发明所用原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。

本发明的有益成果

（1）金纳米棒负载氨基功能化石墨烯，具有大的比表面积和良好的生物相容性，可以结合更多抗体，并且提升电极表面的电子传输能力，提高导电性。Pd@Pt为核壳型纳米复合材料，具有良好的催化性能和生物相容性，Pd@Pt/MoSe₂具有大的比表面积能有效吸附并固载抗体，并具有更好的催化性能。采用金纳米棒负载氨基化石墨烯作为基底材料，Pd@Pt/MoSe₂作为检测抗体标记物构建的夹心型免疫传感器，提高了传感器的灵敏度，降低了检测限；

（2）一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器实现了对肿瘤标志物NSE的检测，其线性范围15fg/mL~ 90ng/mL，检测限低至5.0fg/mL，对肿瘤标志物SCCA的检测，其线性范围15fg/mL~ 90ng/mL，检测限低至5.0fg/mL，表明一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器可以达到准确测定的目的。

具体实施方式

现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此。

实施例1一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器的制备方法，步骤如下：

（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉打磨成镜面，超纯水清洗干净；

（2）取6 µL、1.0 mg/mL的金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液滴涂到电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，晾干；

（3）将6 µL、8.0 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab₁滴加到电极表面，超纯水冲洗，4>

（4）继续将3 µL、0.5 mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 °C冰箱中晾干；

（5）滴加6 µL、10fg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，4 °C冰箱中晾干；

（6）将6 µL、1.5 mg/mL检测抗体孵化物Pd@Pt/MoSe₂-Ab₂溶液滴至电极表面，置于4>

实施例2一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器的制备方法，步骤如下：

（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉打磨成镜面，超纯水清洗干净；

（2）取6 µL、2.0 mg/mL的金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液滴涂到电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，晾干；

（3）将6 µL、10.0 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab₁滴加到电极表面，超纯水冲洗，4>

（4）继续将3 µL、1.0 mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 °C冰箱中晾干；

（5）滴加6 µL、0.1 pg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，4 °C冰箱中晾干；

（6）将6 µL、2.5 mg/mL检测抗体孵化物Pd@Pt/MoSe₂-Ab₂溶液滴至电极表面，置于4>

实施例3一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器的制备方法，步骤如下：

（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉打磨成镜面，超纯水清洗干净；

（2）取6 µL、3.0 mg/mL的金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液滴涂到电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，晾干；

（3）将6 µL、12.0 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab₁滴加到电极表面，超纯水冲洗，4>

（4）继续将3 µL、2.0 mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 °C冰箱中晾干；

（5）滴加6 µL、0.1 pg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，4 °C冰箱中晾干；

（6）将6 µL、3.5 mg/mL检测抗体孵化物Pd@Pt/MoSe₂-Ab₂溶液滴至电极表面，置于4>

实施例4所述金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液的制备，步骤如下：

（1）金纳米棒溶液的制备

将95 μL、质量分数为1%的氯金酸和350 mg十六烷基三甲基溴化铵加入到10 mL超纯水中，超声震荡15 min；磁力搅拌下快速加入50μL、0.1 mol/L新制备的硼氢化钠溶液，搅拌2min，得到棕黄色的金纳米种子溶液；

将380 μL、质量分数为1%的氯金酸和700 mg十六烷基三甲基溴化铵及15 μL、0.1 mol/L硝酸银溶液加入到20 mL超纯水中，超声震荡25 min；加入90μL、0.1 mol/L新配制的抗坏血酸溶液，溶液由黄色变无色，加入20 μL金纳米种子溶液，震荡30 s，静置24 h，超纯水离心洗涤3次，再分散于10 mL超纯水中，得到金纳米棒溶液；

（2）氧化石墨烯的制备

将1 g石墨薄片和0.5 g硝酸钠依次加入装有23 mL浓硫酸的烧瓶中，在冰浴中搅拌30min；搅拌下加入3 g高锰酸钾，加高锰酸钾的过程中保持反应温度低于20 °C，然后升温至35 °C并保持30 min，然后升温至90°C并保持15 min，后缓慢加入50 mL超纯水；再依次加入140 mL超纯水和10 mL、质量分数为30%的H₂O₂溶液，溶液变成亮黄色；离心分离，分别用1mol/L的HCl溶液和超纯水洗涤，>

（3）金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液的制备

在50 mL的烧杯中加入40 mg氧化石墨烯和10 mL乙二醇，超声震荡30 min，加入0.3mL、质量分数为25%的氨水，超声震荡5 min，将溶液转移到聚四氟乙烯高压釜中，180 °C反应10 h，冷却至室温，无水乙醇离心洗涤，在30 °C的真空干燥箱中干燥12h，制得氨基化石墨烯；

将20 mg氨基功能化石墨烯加至10 mL上述步骤（1）制备的金纳米棒溶液中，震荡12 h，制得金纳米棒负载氨基化石墨烯。

实施例5所述金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液的制备，步骤如下：

（1）金纳米棒溶液的制备

将100 μL、质量分数为1%的氯金酸和360 mg十六烷基三甲基溴化铵加入到10 mL超纯水中，超声震荡18 min；磁力搅拌下快速加入60μL、0.1 mol/L新制备的硼氢化钠溶液，搅拌3 min，得到棕黄色的金纳米种子溶液；

将400 μL、质量分数为1%的氯金酸和740 mg十六烷基三甲基溴化铵及20 μL、0.1 mol/L硝酸银溶液加入到20 mL超纯水中，超声震荡35 min；加入105 μL、0.1 mol/L新配制的抗坏血酸溶液，溶液由黄色变无色，加入20 μL金纳米种子溶液，震荡35 s，静置24 h，超纯水离心洗涤3次，再分散于10 mL超纯水中，得到金纳米棒溶液；

（2）氧化石墨烯的制备

将1.5 g石墨薄片和0.75 g硝酸钠依次加入装有23 mL浓硫酸的烧瓶中，在冰浴中搅拌30 min；搅拌下加入3.5 g高锰酸钾，加高锰酸钾的过程中保持反应温度低于20 °C，然后升温至35 °C并保持30 min，然后升温至93°C并保持15 min，后缓慢加入50 mL超纯水；再依次加入140 mL超纯水和12 mL、质量分数为30%的H₂O₂溶液，溶液变成亮黄色；离心分离，分别用1>

（3）金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液的制备

在50 mL的烧杯中加入45 mg氧化石墨烯和12.5 mL乙二醇，超声震荡30 min，加入0.35mL、质量分数为25%的氨水，超声震荡5 min，将溶液转移到聚四氟乙烯高压釜中，180 °C反应12 h，冷却至室温，无水乙醇离心洗涤，在30 °C的真空干燥箱中干燥12h，制得氨基化石墨烯；

将25 mg氨基功能化石墨烯加至10 mL上述步骤（1）制备的金纳米棒溶液中，震荡12 h，制得金纳米棒负载氨基化石墨烯。

实施例6所述金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液的制备，步骤如下：

（1）金纳米棒溶液的制备

将105 μL、质量分数为1%的氯金酸和370 mg十六烷基三甲基溴化铵加入到10 mL超纯水中，超声震荡20 min；磁力搅拌下快速加入70 μL、0.1 mol/L新制备的硼氢化钠溶液，搅拌4 min，得到棕黄色的金纳米种子溶液；

将420 μL、质量分数为1%的氯金酸和780 mg十六烷基三甲基溴化铵及25 μL、0.1 mol/L硝酸银溶液加入到20 mL超纯水中，超声震荡45 min；加入120 μL、0.1 mol/L新配制的抗坏血酸溶液，溶液由黄色变无色，加入20 μL金纳米种子溶液，震荡40 s，静置24 h，超纯水离心洗涤3次，再分散于10 mL超纯水中，得到金纳米棒溶液；

（2）氧化石墨烯的制备

将2 g石墨薄片和1 g硝酸钠依次加入装有23 mL浓硫酸的烧瓶中，在冰浴中搅拌30min；搅拌下加入4 g高锰酸钾，加高锰酸钾的过程中保持反应温度低于20 °C，然后升温至35 °C并保持30 min，然后升温至95°C并保持15 min，后缓慢加入50 mL超纯水；再依次加入140 mL超纯水和15 mL、质量分数为30%的H₂O₂溶液，溶液变成亮黄色；离心分离，分别用1mol/L的HCl溶液和超纯水洗涤，>

（3）金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液的制备

在50 mL的烧杯中加入50 mg氧化石墨烯和15 mL乙二醇，超声震荡30 min，加入0.4mL、质量分数为25%的氨水，超声震荡5 min，将溶液转移到聚四氟乙烯高压釜中，180 °C反应14 h，冷却至室温，无水乙醇离心洗涤，在30 °C的真空干燥箱中干燥12h，制得氨基化石墨烯；

将30 mg氨基功能化石墨烯加至10 mL上述步骤（1）制备的金纳米棒溶液中，震荡12 h，制得金纳米棒负载氨基化石墨烯。

实施例7所述检测抗体孵化物Pd@Pt/MoSe₂-Ab₂溶液的制备，步骤如下：

（1）功能化Pd NPs分散液的制备

依次取90 mg聚乙烯吡咯烷酮，550 mg溴化钾和60 mg抗坏血酸溶于8 mL超纯水中，加热至80 °C保持10 min；在磁力搅拌下加入50 mg四氯化钯酸钠，反应3 h后，依次用超纯水和丙酮离心洗涤3次，制得Pd NPs，重新分散在10 mL超纯水中制得Pd NPs分散液；

分别取180 mg十六烷基三甲基溴化铵和25 mg溴水杨酸溶于10 mL超纯水中；加入1.0mL的Pd NPs分散液，超声震荡5 min，离心，用超纯水离心洗涤三次，重新分散在10 mL超纯水中，得到功能化Pd NPs分散液；

（2）Pd@Pt NPs分散液的制备

将250 μL、质量分数为1%是氯铂酸溶于5 mL超纯水中，加入1 mL功能化Pd NPs分散液，超声震荡1 min，快速加入1 mL、0.01mol/L的抗坏血酸溶液，快速震荡10 s，静置8 h，超纯水离心洗涤，重新分散于10 mL超纯水中，制得Pd@Pt NPs分散液；

（3）氨基化MoSe₂的制备

将150 mg硒粉加入到5 mL、质量分数为85%水合肼中，磁力搅拌2 h，制得溶液A；将200mg钼酸钠加入到20 mL超纯水中，制得溶液B；将A、B两溶液混合，磁力搅拌30 min，转移到聚四氟乙烯高压釜中，200 °C加热24 h，冷却至室温，无水乙醇和超纯水离心洗涤3次，在60 °C的真空干燥箱中干燥16 h，制得MoSe₂；

将100 mg MoSe₂和160>2；

（4）Pd@Pt/MoSe₂的制备

将25 mg氨基化MoSe₂加至10>2，

（5）检测抗体孵化物Pd@Pt/MoSe₂-Ab₂溶液的制备

将4 mg的Pd@Pt/MoSe₂加至1>2溶液和900>2-Ab₂溶液，4>

实施例8所述检测抗体孵化物Pd@Pt/MoSe₂-Ab₂溶液的制备，步骤如下：

（1）功能化Pd NPs分散液的制备

依次取100 mg聚乙烯吡咯烷酮，600 mg溴化钾和65 mg抗坏血酸溶于8 mL超纯水中，加热至80 °C保持10 min；在磁力搅拌下加入60 mg四氯化钯酸钠，反应3 h后，依次用超纯水和丙酮离心洗涤3次，制得Pd NPs，重新分散在10 mL超纯水中制得Pd NPs分散液；

分别取190 mg十六烷基三甲基溴化铵和27 mg溴水杨酸溶于10 mL超纯水中；加入1.5mL的Pd NPs分散液，超声震荡7 min，离心，用超纯水离心洗涤三次，重新分散在10 mL超纯水中，得到功能化Pd NPs分散液；

（2）Pd@Pt NPs分散液的制备

将260 μL、质量分数为1%是氯铂酸溶于5 mL超纯水中，加入1 mL功能化Pd NPs分散液，超声震荡1.5 min，快速加入1 mL、0.01mol/L的抗坏血酸溶液，快速震荡12 s，静置9 h，超纯水离心洗涤，重新分散于10 mL超纯水中，制得Pd@Pt NPs分散液；

（3）氨基化MoSe₂的制备

将160 mg硒粉加入到5 mL、质量分数为85%水合肼中，磁力搅拌2.5 h，制得溶液A；将240 mg钼酸钠加入到20 mL超纯水中，制得溶液B；将A、B两溶液混合，磁力搅拌30 min，转移到聚四氟乙烯高压釜中，200 °C加热24 h，冷却至室温，无水乙醇和超纯水离心洗涤3次，在60 °C的真空干燥箱中干燥20 h，制得MoSe₂；

将100 mg MoSe₂和180>2；

（4）Pd@Pt/MoSe₂的制备

将30 mg氨基化MoSe₂加至10>2，

（5）检测抗体孵化物Pd@Pt/MoSe₂-Ab₂溶液的制备

将6 mg的Pd@Pt/MoSe₂加至1>2溶液和900>2-Ab₂溶液，4>

实施例9所述检测抗体孵化物Pd@Pt/MoSe₂-Ab₂溶液的制备，步骤如下：

（1）功能化Pd NPs分散液的制备

依次取110 mg聚乙烯吡咯烷酮， 650 mg溴化钾和70 mg抗坏血酸溶于8 mL超纯水中，加热至80 °C保持10 min；在磁力搅拌下加入70 mg四氯化钯酸钠，反应3 h后，依次用超纯水和丙酮离心洗涤3次，制得Pd NPs，重新分散在10 mL超纯水中制得Pd NPs分散液；

分别取200 mg十六烷基三甲基溴化铵和30 mg溴水杨酸溶于10 mL超纯水中；加入2.0mL的Pd NPs分散液，超声震荡9 min，离心，用超纯水离心洗涤三次，重新分散在10 mL超纯水中，得到功能化Pd NPs分散液；

（2）Pd@Pt NPs分散液的制备

将270 μL、质量分数为1%是氯铂酸溶于5 mL超纯水中，加入1 mL功能化Pd NPs分散液，超声震荡2 min，快速加入1 mL、0.01mol/L的抗坏血酸溶液，快速震荡15 s，静置10 h，超纯水离心洗涤，重新分散于10 mL超纯水中，制得Pd@Pt NPs分散液；

（3）氨基化MoSe₂的制备

将170 mg硒粉加入到5 mL、质量分数为85%水合肼中，磁力搅拌3 h，制得溶液A；将280mg钼酸钠加入到20 mL超纯水中，制得溶液B；将A、B两溶液混合，磁力搅拌30 min，转移到聚四氟乙烯高压釜中，200 °C加热24 h，冷却至室温，无水乙醇和超纯水离心洗涤3次，在60 °C的真空干燥箱中干燥24 h，制得MoSe₂；

将100 mg MoSe₂和00>2；

（4）Pd@Pt/MoSe₂的制备

将35 mg氨基化MoSe₂加至10>2，

（5）检测抗体孵化物Pd@Pt/MoSe₂-Ab₂溶液的制备

将8 mg的Pd@Pt/MoSe₂加至1>2溶液和900>2-Ab₂溶液，4>

实施例10肿瘤标志物NSE的检测，包括以下步骤：

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.00 ~ 9.00磷酸盐缓冲溶液中进行测试；

（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间400 s；

（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的 pH = 7.0的磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化；

（4）采用标准曲线法，测定肿瘤标志物NSE的线性范围为15fg/mL~90 ng/mL，检测限为5fg/mL。

实施例11肿瘤标志物SCCA的检测

按照实施例10的方法对样品中SCCA进行检测，其线性范围为15 fg/mL ~ 90 ng/mL，检测限为5.0 fg/mL。