一种土壤生物有效性重金属富集电极及其制备方法和应用

摘要

本发明属于土壤传感检测技术领域，具体为一种土壤生物有效性重金属富集电极及其制备方法和应用。本发明提出的方法是将碳纤维表面改性、表面活化、包覆银层，再与环糊精、淀粉、甲壳素以及核酸适配体复合，制备得到土壤生物有效性重金属富集电极。该电极具有多通道检测能力，能同时检测土壤中镉、汞、砷、铅、铬、铜、镍、锌等8种重金属及无机物的生物有效性，且检测限均符合土壤环境质量标准GB15618‑2008。

说明书

技术领域

本发明属于土壤传感检测技术领域，具体涉及一种土壤生物有效性重金属富集电极及其制备方法和应用。

背景技术

土壤重金属对植物产生毒害作用，并通过食物链对人体健康造成威胁；现用土壤重金属检测方法是测定土壤重金属全量（单位是mg/kg，即1kg土壤中重金属的含量），检测过程复杂，测定结果中很大一部分土壤重金属不具备生物有效性。土壤活性态重金属检测方法检测出的土壤活性态重金属，能最大限度反映土壤重金属与植物根系吸收之间关系，表征土壤重金属污染状态。土壤环境质量标准 GB15618-2008规定要测量的重金属包括镉、汞、砷、铅、铬、铜、镍、锌等16种（其中砷虽然不是重金属元素，但在土壤质量中通常将其归为类重金属）。

孟昭福等(Acta Sci Circum, 2005,25(12): 1661−1668.)将土壤重金属有效性定义为作物重金属吸收量与土壤重金属全量之比。土壤重金属有效性越高，则表明该金属越容易被作物吸收。因此，只有准确判断重金属有效性，才能更好地进行重金属危险性评估。然而, 重金属有效性受多种因素的影响，其中pH、有机质是影响较大的因素，另外土壤氧化还原电位、土壤生物等对土壤重金属的有效性也有一定影响(J Zhejiang Agric Sci,2012, (5): 729−732.), 因此寻找科学合理的重金属有效性评估方法至关重要。

何文等发明了一系列土壤活性态重金属的检测方法（CN106153587A、CN106124281A、CN105866093A），采用超大量土壤分析取样量，二乙三胺五乙酸为螯合剂，氯化钙中钙离子为螯合浸提平衡剂，三乙醇胺作为缓冲剂，螯合浸提出土壤活性态重金属；用原子荧光分光光谱法，采用低质量分数标准曲线，保证土壤中超微量土壤活性态重金属的检出。

温州医科大学发明了一种检测重金属镉的微生物学方法（CN104946681A），具体涉及一种检测镉大肠杆菌工程菌株的构建方法及其检测水中镉方法的建立。该发明所述工程菌株的构建，首先采用Red重组系统敲除大肠埃希氏菌镉抗性zntA和zntR基因，然后采用基因敲入技术将pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2报告基因置换到zntR编码基因位置后获得。该发明所述工程菌株对镉的最低检测范围符合《污水综合排放标准》GB8978-1996，克服了基于质粒载体的工程菌株具有荧光本底值高、检测信号差等缺陷。该发明所述工程菌株可与AAS等理化分析法互补分析镉的生物有效性及其总量，为客观评价镉的生物毒性大小提供依据。

张海明等研究了“基于纳米电极阵列传感器的土壤重金属污染检测机理与技术”（中南大学硕士论文，2014），研究了纳米电极阵列的电化学特性，电极修饰的方法以及纳米电极传感器的非线性扩散效应，小时间常数效应，传递速率与信噪比。得出了纳米电极阵列设计方法与注意事项和纳米电极阵列制作方法。提出并设计了一套重金属检测系统模型，针对三电极检测体系，研究溶液电阻、双电层电容等电路内部参数，研究了土壤重金属扩散与弥散效应。从扩散定律和质量守恒定律出发，建立了一套基于扩散定律与质量守恒的土壤中重金属传播模型。并对该模型的应用范围进行了分析，为重金属的预警提供理论支撑。

综上所述，土壤生物有效性重金属的检测主要有以下几种方法：（1）植物吸附法；利用植物的根、茎、叶等富集土壤中的重金属，这种方法最准确，但耗时长、占地广、效率低；（2）化学提取法；这种方法速度快，效率高，但尚未建立生物有效性与提取之间的科学联系，即缺乏理论依据。（3）生物传感螯合法；这种方法可以克服以上两种方法的缺点，建立土壤生物有效性重金属的原位实时检测方法，但其灵敏度较差，检测限不合要求。如果将重金属富集技术与生物传感技术融合，则有望解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种土壤生物有效性重金属富集电极及其制备方法和应用。

本发明提出的土壤生物有效性重金属富集电极的制备方法，具体步骤如下：

（1）表面改性：将长4~6cm、宽1~3cm的碳纤维布固定在匀胶机转盘上，控制转盘温度为110~130℃、转速为900~1100转/分钟，滴加9~11ml质量分数为0.5~1.5%的3-氨基丙基三甲氧基硅烷溶液，滴毕，降低转盘温度至20~30℃，转盘停止转动，得改性碳纤维电极；其中，3-氨基丙基三甲氧基硅烷溶液的溶质为3-氨基丙基三甲氧基硅烷、溶剂为丙酮；

（2）表面活化：将步骤（1）中的改性碳纤维电极浸入质量分数为0.5~1.5%的氯金酸水溶液中，放置1小时，取出，再浸入质量分数为0.05~0.15%的硼氢化钠水溶液中，放置4~6分钟，取出，用去离子水洗涤3~4次（每次可为100ml），得活化碳纤维电极；

（3）银包覆：将步骤（2）中的活化碳纤维电极浸入40~60ml银铵溶液中，再滴加9~11ml质量分数为9~11%的葡萄糖水溶液，滴毕，放置4~6分钟，取出，用去离子水洗涤3~4次（每次可为100ml），得银包覆碳纤维电极；其中，银铵溶液的溶质为硝酸银、氨水，溶剂为去离子水，硝酸银质量分数为3~4%，氨水质量分数为0.5~1.5%；

（4）电极制备：将1~2g环糊精、2~4g淀粉、1.5~4.5g甲壳素以及1~3g核酸适配体与15~25ml去离子水混合，搅拌成糊状，涂布至步骤（3）中的银包覆碳纤维电极上，放入烘箱中，于50~70℃烘烤2~4小时，取出，得土壤生物有效性重金属富集电极。

其中，核酸适配体的序列为：

AAAAAAAATACTCAGGGCACTTGCAAGCAATTGTGGTCCCAATGGGCTGAGTAT（SEQ ID NO.1）。

将上述制备得到的土壤生物有效性重金属富集电极作为工作电极，装配至电化学工作站三电极体系中，利用已标定生物有效性重金属的土壤标样，对电极进行标定，测得镉、汞、砷、铅、铬、铜、镍、锌的检测限分别低于0.20mg/kg、0.20mg/kg、10mg/kg、40mg/kg、100mg/kg、20mg/kg、20mg/kg、50mg/kg。

如果步骤（4）中不使用环糊精为原料，本发明还提供如下技术方案作为对比：

将2g淀粉、1.5g甲壳素以及1g所述核酸适配体与20ml去离子水混合，经过同样操作得到土壤生物有效性重金属富集电极。将土壤生物有效性重金属富集电极作为工作电极，装配至电化学工作站三电极体系中，利用已标定生物有效性重金属的土壤标样，对电极进行标定，测得镉、汞、砷、铅、铬、铜、镍、锌的检测限分别为20mg/kg、25mg/kg、150mg/kg、420mg/kg、550mg/kg、280mg/kg、240mg/kg、530mg/kg。

如果步骤（4）中不使用淀粉为原料，本发明还提供如下技术方案作为对比：

将2g环糊精、4.5g甲壳素以及3g所述核酸适配体与20ml去离子水混合，经过同样操作得到土壤生物有效性重金属富集电极。将土壤生物有效性重金属富集电极作为工作电极，装配至电化学工作站三电极体系中，利用已标定生物有效性重金属的土壤标样，对电极进行标定，测得镉、汞、砷、铅、铬、铜、镍、锌的检测限分别为25mg/kg、20mg/kg、180mg/kg、480mg/kg、510mg/kg、210mg/kg、200mg/kg、560mg/kg。

如果步骤（4）中不使用甲壳素为原料，本发明还提供如下技术方案作为对比：

将1g环糊精、4g淀粉以及1g所述核酸适配体与20ml去离子水混合，经过同样操作得到土壤生物有效性重金属富集电极。将土壤生物有效性重金属富集电极作为工作电极，装配至电化学工作站三电极体系中，利用已标定生物有效性重金属的土壤标样，对电极进行标定，测得镉、汞、砷、铅、铬、铜、镍、锌的检测限分别为30mg/kg、35mg/kg、110mg/kg、310mg/kg、450mg/kg、380mg/kg、440mg/kg、450mg/kg。

从上述对比技术方案可以看出，本发明的技术效果——土壤生物有效性重金属富集电极测得的“镉、汞、砷、铅、铬、铜、镍、锌的检测限”是电极材料中各组分共同作用的结果，一旦某个组分发生改变，则镉、汞、砷、铅、铬、铜、镍、锌的检测限数值急剧升高，即具有“1+1>2”的协同效应，这是其他文献中未曾报道过的现象。

由上可见，本发明制备的土壤生物有效性重金属富集电极，可用于土壤生物有效性重金属元素的检测。并具有多通道检测能力，能同时检测镉、汞、砷、铅、铬、铜、镍、锌等8种重金属及无机物，且检测限都符合土壤环境质量标准 GB15618-2008。

本发明的有益效果在于：

（1）土壤生物有效性重金属富集电极对镉、汞、砷、铅、铬、铜、镍、锌的检测限分别低于0.20mg/kg、0.20mg/kg、10mg/kg、40mg/kg、100mg/kg、20mg/kg、20mg/kg、50mg/kg，符合土壤环境质量标准 GB15618-2008；

（2）土壤生物有效性重金属富集电极能同时检测8种重金属及无机物，具有多通道检测能力，能极大提高检测效率。

具体实施方式

下面通过实例进一步描述本发明。

实施例1

将1g 3-氨基丙基三甲氧基硅烷与99g丙酮混合，得3-氨基丙基三甲氧基硅烷溶液。将长5cm、宽2cm的碳纤维布固定在匀胶机转盘上，控制转盘温度为120℃、转速为1000转/分钟，滴加10ml3-氨基丙基三甲氧基硅烷溶液，滴毕，降低转盘温度至25℃，转盘停止转动，得改性碳纤维电极。

将改性碳纤维电极浸入质量分数为1%的氯金酸水溶液中，放置1小时，取出，再浸入质量分数为0.1%的硼氢化钠水溶液中，放置5分钟，取出，用去离子水洗涤3次，每次100ml，得活化碳纤维电极。

将3.5g硝酸银、3.5ml质量分数为28%的氨水与95.5g去离子水混合，得银铵溶液；将活化碳纤维电极浸入50ml银铵溶液中，再滴加10ml质量分数为10%的葡萄糖水溶液，滴毕，放置5分钟，取出，用去离子水洗涤3次，每次100ml，得银包覆碳纤维电极。

将1g环糊精、2g淀粉、1.5g甲壳素以及1g所述核酸适配体与20ml去离子水混合，搅拌成糊状，涂布至银包覆碳纤维电极上，放入烘箱中，于60℃烘烤3小时，取出，得土壤生物有效性重金属富集电极。将土壤生物有效性重金属富集电极作为工作电极，装配至电化学工作站三电极体系中，利用已标定生物有效性重金属的土壤标样，对电极进行标定，测得镉、汞、砷、铅、铬、铜、镍、锌的检测限分别为0.18mg/kg、0.16mg/kg、8mg/kg、20mg/kg、60mg/kg、12mg/kg、16mg/kg、32mg/kg。

实施例2

将1g 3-氨基丙基三甲氧基硅烷与99g丙酮混合，得3-氨基丙基三甲氧基硅烷溶液。将长5cm、宽2cm的碳纤维布固定在匀胶机转盘上，控制转盘温度为120℃、转速为1000转/分钟，滴加10ml 3-氨基丙基三甲氧基硅烷溶液，滴毕，降低转盘温度至25℃，转盘停止转动，得改性碳纤维电极。

将改性碳纤维电极浸入质量分数为1%的氯金酸水溶液中，放置1小时，取出，再浸入质量分数为0.1%的硼氢化钠水溶液中，放置5分钟，取出，用去离子水洗涤3次，每次100ml，得活化碳纤维电极。

将3.5g硝酸银、3.5ml质量分数为28%的氨水与95.5g去离子水混合，得银铵溶液；将活化碳纤维电极浸入50ml银铵溶液中，再滴加10ml质量分数为10%的葡萄糖水溶液，滴毕，放置5分钟，取出，用去离子水洗涤3次，每次100ml，得银包覆碳纤维电极。

将2g环糊精、4g淀粉、4.5甲壳素以及3g所述核酸适配体与20ml去离子水混合，搅拌成糊状，涂布至银包覆碳纤维电极上，放入烘箱中，于60℃烘烤3小时，取出，得土壤生物有效性重金属富集电极。将土壤生物有效性重金属富集电极作为工作电极，装配至电化学工作站三电极体系中，利用已标定生物有效性重金属的土壤标样，对电极进行标定，测得镉、汞、砷、铅、铬、铜、镍、锌的检测限分别为0.12mg/kg、0.19mg/kg、9mg/kg、35mg/kg、55mg/kg、14mg/kg、12mg/kg、45mg/kg。

实施例3

将1g 3-氨基丙基三甲氧基硅烷与99g丙酮混合，得3-氨基丙基三甲氧基硅烷溶液。将长5cm、宽2cm的碳纤维布固定在匀胶机转盘上，控制转盘温度为120℃、转速为1000转/分钟，滴加10ml 3-氨基丙基三甲氧基硅烷溶液，滴毕，降低转盘温度至25℃，转盘停止转动，得改性碳纤维电极。

将改性碳纤维电极浸入质量分数为1%的氯金酸水溶液中，放置1小时，取出，再浸入质量分数为0.1%的硼氢化钠水溶液中，放置5分钟，取出，用去离子水洗涤3次，每次100ml，得活化碳纤维电极。

将3.5g硝酸银、3.5ml质量分数为28%的氨水与95.5g去离子水混合，得银铵溶液；将活化碳纤维电极浸入50ml银铵溶液中，再滴加10ml质量分数为10%的葡萄糖水溶液，滴毕，放置5分钟，取出，用去离子水洗涤3次，每次100ml，得银包覆碳纤维电极。

将1.5g环糊精、3g淀粉、3g甲壳素以及2g所述核酸适配体与20ml去离子水混合，搅拌成糊状，涂布至银包覆碳纤维电极上，放入烘箱中，于60℃烘烤3小时，取出，得土壤生物有效性重金属富集电极。将土壤生物有效性重金属富集电极作为工作电极，装配至电化学工作站三电极体系中，利用已标定生物有效性重金属的土壤标样，对电极进行标定，测得镉、汞、砷、铅、铬、铜、镍、锌的检测限分别为0.16mg/kg、0.15mg/kg、6mg/kg、28mg/kg、92mg/kg、14mg/kg、9mg/kg、38mg/kg。

实施例4

将1g 3-氨基丙基三甲氧基硅烷与99g丙酮混合，得3-氨基丙基三甲氧基硅烷溶液。将长5cm、宽2cm的碳纤维布固定在匀胶机转盘上，控制转盘温度为120℃、转速为1000转/分钟，滴加10ml 3-氨基丙基三甲氧基硅烷溶液，滴毕，降低转盘温度至25℃，转盘停止转动，得改性碳纤维电极。

将改性碳纤维电极浸入质量分数为1%的氯金酸水溶液中，放置1小时，取出，再浸入质量分数为0.1%的硼氢化钠水溶液中，放置5分钟，取出，用去离子水洗涤3次，每次100ml，得活化碳纤维电极。

将3.5g硝酸银、3.5ml质量分数为28%的氨水与95.5g去离子水混合，得银铵溶液；将活化碳纤维电极浸入50ml银铵溶液中，再滴加10ml质量分数为10%的葡萄糖水溶液，滴毕，放置5分钟，取出，用去离子水洗涤3次，每次100ml，得银包覆碳纤维电极。

将2g淀粉、1.5g甲壳素以及1g所述核酸适配体与20ml去离子水混合，搅拌成糊状，涂布至银包覆碳纤维电极上，放入烘箱中，于60℃烘烤3小时，取出，得土壤生物有效性重金属富集电极。将土壤生物有效性重金属富集电极作为工作电极，装配至电化学工作站三电极体系中，利用已标定生物有效性重金属的土壤标样，对电极进行标定，测得镉、汞、砷、铅、铬、铜、镍、锌的检测限分别为20mg/kg、25mg/kg、150mg/kg、420mg/kg、550mg/kg、280mg/kg、240mg/kg、530mg/kg。

实施例5

将1g 3-氨基丙基三甲氧基硅烷与99g丙酮混合，得3-氨基丙基三甲氧基硅烷溶液。将长5cm、宽2cm的碳纤维布固定在匀胶机转盘上，控制转盘温度为120℃、转速为1000转/分钟，滴加10ml 3-氨基丙基三甲氧基硅烷溶液，滴毕，降低转盘温度至25℃，转盘停止转动，得改性碳纤维电极。

将改性碳纤维电极浸入质量分数为1%的氯金酸水溶液中，放置1小时，取出，再浸入质量分数为0.1%的硼氢化钠水溶液中，放置5分钟，取出，用去离子水洗涤3次，每次100ml，得活化碳纤维电极。

将3.5g硝酸银、3.5ml质量分数为28%的氨水与95.5g去离子水混合，得银铵溶液；将活化碳纤维电极浸入50ml银铵溶液中，再滴加10ml质量分数为10%的葡萄糖水溶液，滴毕，放置5分钟，取出，用去离子水洗涤3次，每次100ml，得银包覆碳纤维电极。

将2g环糊精、4.5g甲壳素以及3g所述核酸适配体与20ml去离子水混合，搅拌成糊状，涂布至银包覆碳纤维电极上，放入烘箱中，于60℃烘烤3小时，取出，得土壤生物有效性重金属富集电极。将土壤生物有效性重金属富集电极作为工作电极，装配至电化学工作站三电极体系中，利用已标定生物有效性重金属的土壤标样，对电极进行标定，测得镉、汞、砷、铅、铬、铜、镍、锌的检测限分别为25mg/kg、20mg/kg、180mg/kg、480mg/kg、510mg/kg、210mg/kg、200mg/kg、560mg/kg。

实施例6

将1g 3-氨基丙基三甲氧基硅烷与99g丙酮混合，得3-氨基丙基三甲氧基硅烷溶液。将长5cm、宽2cm的碳纤维布固定在匀胶机转盘上，控制转盘温度为120℃、转速为1000转/分钟，滴加10ml 3-氨基丙基三甲氧基硅烷溶液，滴毕，降低转盘温度至25℃，转盘停止转动，得改性碳纤维电极。

将改性碳纤维电极浸入质量分数为1%的氯金酸水溶液中，放置1小时，取出，再浸入质量分数为0.1%的硼氢化钠水溶液中，放置5分钟，取出，用去离子水洗涤3次，每次100ml，得活化碳纤维电极。

将3.5g硝酸银、3.5ml质量分数为28%的氨水与95.5g去离子水混合，得银铵溶液；将活化碳纤维电极浸入50ml银铵溶液中，再滴加10ml质量分数为10%的葡萄糖水溶液，滴毕，放置5分钟，取出，用去离子水洗涤3次，每次100ml，得银包覆碳纤维电极。

将1g环糊精、4g淀粉以及1g所述核酸适配体与20ml去离子水混合，搅拌成糊状，涂布至银包覆碳纤维电极上，放入烘箱中，于60℃烘烤3小时，取出，得土壤生物有效性重金属富集电极。将土壤生物有效性重金属富集电极作为工作电极，装配至电化学工作站三电极体系中，利用已标定生物有效性重金属的土壤标样，对电极进行标定，测得镉、汞、砷、铅、铬、铜、镍、锌的检测限分别为30mg/kg、35mg/kg、110mg/kg、310mg/kg、450mg/kg、380mg/kg、440mg/kg、450mg/kg。

序列表

<110> 复旦大学

<120> 一种土壤生物有效性重金属富集电极及其制备方法和应用

<130> 001

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaaaaaaata ctcagggcac ttgcaagcaa ttgtggtccc aatgggctga gtat 54