一种与小麦株高和穗长性状主效QTL紧密连锁的分子标记及其应用

摘要

本发明公开了一种与小麦株高和穗长性状主效QTL紧密连锁的分子标记及其应用。本发明提供了检测待测小麦株高或穗长的引物对，为用于扩增靶片段的引物对；所述靶片段为含有由引物1、引物2和引物3扩增得到的片段的片段；所述引物1为序列1所示的单链DNA分子；所述引物2为序列2所示的单链DNA分子；所述引物3为序列3所示的单链DNA分子；本发明的实验证明了，利用引物对STARP‑2001对小麦分离群体进行辅助选择。结果表明，基因型与高秆亲本京411一致的单株显著高于基因型与矮秆亲本一致的单株，这表明引物对STARP‑2001用于小麦矮秆育种的分子标记辅助选择是切实有效的。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学级遗传育种技术领域，尤其涉及一种与小麦株高和穗长性状主效QTL紧密连锁的分子标记及其应用。

背景技术

小麦是我国第二大口粮作物。据中国粮油信息网报道，2013/14年度全国小麦供给约2208亿斤，需求约2328亿斤，年度缺口约120亿斤，国内小麦供需仍处于紧平衡并略有缺口状态。我国新的粮食安全战略目标为要确保水稻、小麦、玉米三大主粮自给率保持在95％以上，其中水稻、小麦两大口粮保持100％自给。随着人口不断增加和耕地面积的减少，进一步提高我国小麦单产对于对保障国家粮食安全具有重要的现实意义。

发现和利用产量相关的关键基因，对挖掘小麦产量遗传潜力，提高小麦单产起着重要作用。例如，上世纪中期半矮秆品种的培育使小麦等作物产量得到了大幅度提高，这一历程就是众所周知的“绿色革命”。小麦的矮秆基因Rht1基因克隆及功能研究说明，一个或少数基因就有可能导致一次产量育种的重大突破。最新研究表明，小麦的矮秆基因Rht1在降低株高的同时，导致粒重显著地降低。因此，要打破现有高产品种的单产水平，需要利用新的矮秆基因，而相关基因的定位和克隆是小麦株高性状改良的重要基础。

国内外学者已经利用不同的遗传背景及不同环境条件对株高和穗长QTL进行了定位分析研究。QTL定位结果表明，在小麦的3D、4B、4D、5A、5B、6B、6D、7A和7B等多条染色体上都有控制株高、穗长的QTL。迄今为止，关于小麦株高、穗长QTL的图位克隆研究目前尚未见报道。

近年来，小麦基因组数据平台和高通量的分子标记技术日趋成熟和完善，使基因的精细定位和克隆成为可能。目前，小麦二倍体祖先中AA和DD及六倍体小麦中国春的基因组测序数据已经发表。最近，我们采用9K的SNP芯片进行了株高穗长性状的QTL定位，并利用已有的小麦基因组信息对主效QTL进行了遗传图谱加密和候选基因筛选。

发明内容

本发明的一个目的是提供检测待测小麦株高或穗长的引物对。

本发明提供的引物对，为用于扩增靶片段的引物对；

所述靶片段为含有由引物1、引物2和引物3扩增得到的片段的片段；

所述引物1为如下a1)或a2)：

a1)序列1所示的单链DNA分子；

a2)将a1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与a1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物2为如下b1)或b2)：

b1)序列2所示的单链DNA分子；

b2)将b1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与b1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物3为如下c1)或c2)：

c1)序列3所示的单链DNA分子；

c2)将c1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与c1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。

上述引物对由序列1所示的单链DNA分子、序列2所示的单链DNA和序列3所示的单链DNA组成。

含有上述引物对的PCR试剂也是本发明保护的范围。

上述每条引物在所述PCR试剂中的终浓度为2-4μM。

含有上述引物对或上述的PCR试剂的试剂盒也是本发明保护的范围。

上述引物对或上述的PCR试剂或上述的试剂盒在检测待测小麦株高和/或穗长中的应用也是本发明保护的范围。

或上述引物对或上述的PCR试剂或上述的试剂盒在预测或筛选或培育矮杆待测小麦中的应用也是本发明保护的范围；

或上述引物对或上述的PCR试剂或上述的试剂盒在预测或筛选或培育高杆待测小麦中的应用也是本发明保护的范围；

或上述引物对或上述的PCR试剂或上述的试剂盒在预测或筛选或培育长穗待测小麦中的应用也是本发明保护的范围；

或上述引物对或上述的PCR试剂或上述的试剂盒在预测或筛选或培育短穗待测小麦中的应用也是本发明保护的范围。

本发明另一个目的是提供一种检测待测小麦株高的方法。

本发明提供检测待测小麦株高的方法，包括如下步骤：用上述引物对或上述的PCR试剂或上述的试剂盒对待测小麦进行PCR扩增，检测PCR产物；PCR扩增产物大小为185-190bp(具体为188bp)的待测小麦的株高低于PCR扩增产物大小为175-180bp(具体为178bp)的待测小麦的株高。

或，本发明提供检测待测小麦株高的方法，包括如下步骤：用上述引物对或上述的PCR试剂或上述的试剂盒对待测小麦进行PCR扩增，检测PCR产物；以豫麦8679和京411为对照进行相同扩增；

与所述豫麦8679的PCR扩增产物带型一致的待测小麦的株高低于与所述京411的PCR扩增产物带型一致的待测小麦。

本发明第3个目的是提供一种检测待测小麦穗长的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：用上述引物对或上述的PCR试剂或上述的试剂盒对待测小麦进行PCR扩增，检测PCR产物；PCR扩增产物大小为185-190bp(具体为188bp)的待测小麦的穗长小于PCR扩增产物大小为175-180bp(具体为178bp)的待测小麦的株高。

或，本发明提供的方法，包括如下步骤：用上述引物对或上述的PCR试剂或上述的试剂盒对待测小麦进行PCR扩增，检测PCR产物，检测PCR产物；以豫麦8679和京411为对照进行相同扩增；

与所述豫麦8679的PCR扩增产物带型一致的待测小麦的穗长小于与所述京411的PCR扩增产物带型一致的待测小麦。

本发明第4个目的是如下：

本发明提供了一种培育矮杆待测小麦的方法，包括如下步骤：培育上述方法获得的PCR扩增产物大小为185-190bp的待测小麦或与所述豫麦8679的PCR扩增产物带型一致的待测小麦；

或一种培育高杆待测小麦的方法，包括如下步骤：培育上述方法获得的PCR扩增产物大小为175-180bp的待测小麦或与所述京411的PCR扩增产物带型一致的待测小麦；

或一种培育长穗待测小麦的方法，包括如下步骤：培育上述方法获得的PCR扩增产物大小为175-180bp的待测小麦或与所述京411的PCR扩增产物带型一致的待测小麦；

或一种培育短穗待测小麦的方法，包括如下步骤：培育上述方法获得的PCR扩增产物大小为185-190bp的待测小麦或与所述豫麦8679的PCR扩增产物带型一致的待测小麦。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

一种小麦株高穗长性状主效基因位点的分离方法，它包括如下步骤：

(1)利用在株高和穗长上有极显著差异的小麦品种豫麦8679(75.85cm，10.40cm)和京411(91.73cm，9.16cm)，利用单粒传的方法构建的重组自交系群体(RILs)，并从中筛选到一个剩余杂合系(yj-171)，yj-171自交得到F₂分离群体。本发明用到的研究材料由中国农业大学小麦课题组提供；

(2)采用CTAB法(Doyle et al.1987)提取亲本豫麦8679和京411及RIL群体和F₂分离群体的叶片总DNA，过程中所用到的试剂包括提取液(NaCl，1M>

(3)合成自主开发的SSR引物和STARP引物，并对亲本DNA进行PCR扩增，产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，染色和显影后对条带的大小进行判别，筛选多态性引物。过程中所用到的主要软件为Primer3.0；主要试剂包括2x Taq PCR StarMix、丙烯酰胺、氢氧化钠、硝酸银等，

(4)利用多态性引物对RIL群体进行分子标记分析，获得基因型数据。

(5)把RIL群体的基因型数据输入Joinmap4.0软件，进行遗传连锁图谱的构建；

(6)RIL群体的基因型数据(仅限于定位到遗传图谱上的标记)群体的株高性状数据输入WinQTLcart2.5软件进行QTL定位，在2D染色体短臂连锁群上定位到的2个QTL在多环境中能重复检测到。利用上述技术措施，申请人最终获得了株高和穗长性状的主效基因位点QPht/Sl.cau-2D.1和QPht/Sl.cau-2D.2，其中主效基因位点QPht/Sl.cau-2D.1申请人自主开发的STARP标记STARP-2001紧密连锁，其引物序列为序列1：TGCTGACGACTCAAACAGGAAGGAAAAAGA，序列2：TCAAACAGGAAGGAAACCGG,序列3：ATGGAGCGGGTGTTCAAG。利用WinQTLCart2.5软件分析测得其对小麦株高的贡献率为11.94％，加性效应为-2.899cm；对小麦穗长表型变异的贡献率为31.37％，加性效应为-0.596cm。

本发明的引物对STARP-2001，是与株高和穗长主效QTL位点QPht/Sl.cau-2D.1紧密连锁的标记，且是基于PCR技术的共显性STARP标记，因而可靠且使用方便。实验证明，利用引物对STARP-2001对小麦分离群体进行辅助选择。结果表明，基因型与高秆亲本京411一致的单株显著高于基因型与矮秆亲本一致的单株，这表明引物对STARP-2001用于小麦矮秆育种的分子标记辅助选择是切实有效的。本发明通过对小麦株高性状的QTL定位，定位到的QPht/Sl.cau-2D.1为首次被报道(参考文献，(Zhai et al.2016))，并获得了与其紧密连锁的分子标记STARP-2001，该小麦的主效基因位点QPht/Sl.cau-2D.1，可分别解释11.94％的株高表型变异和30.94％的穗长表型变异，可用于图位克隆和分子标记辅助选择。在常规育种方法中，株高和穗长性状要等到成熟期才能鉴定，且易受环境影响，鉴定田间误差大，选择效率低下。通过苗期检测株高主效基因位点来预测小麦株高和穗长性状，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率，从而加快育种进程。本发明中株高和穗长主效基因位点位置明确，主效基因位点的检测方法方便快速，不受环境影响。通过检测与株高和穗长主效基因位点紧密连锁的分子标记，即可准确快速筛选矮秆材料。

附图说明

图1为利用STARP-2001对豫麦8679和京411，及其衍生的RIL群体的基因组DNA进行PCR得到的PCR产物的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图2为小麦2D染色体对应的连锁图谱。左侧是标记的遗传位置，右侧是标记名称及QPht/Sl.cau-2D.1的置信区间示意图。

图3为小麦株高和穗长性状的QTL定位结果图。图中横坐标是连锁图谱，纵坐标为LOD值，箭头所指位置是小麦株高和穗长主效位点QPht/Sl.cau-2D.1的位置。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、小麦株高定位群体和分离群体的构建及性状测定

本实施例中使用的群体为豫麦8679和京411衍生的RIL群体和F₂群体(由RIL群体中的一个剩余杂合系yj-171衍生的F₂群体。

RIL群体和杂合系yj-171均记载在如下文献中：Zhai HJ,Feng ZY,Li J,Liu XY,Xiao SH,Ni ZF,Sun QX(2016)QTL Analysis of Spike Morphological Traits andPlant Height in Winter Wheat(TriticμM aestivμM L.)Using a High-Density SNPand SSR-Based Linkage Map.Frontiers in Plant Science 7.doi:10.3389/fpls.2016.01617。RIL群体的株高表型数据也可从该文献获得，F₂群体的表型数据测量得到的。

yj-171衍生的F₂群体RIL系yj-171中的杂合单株自交得到F₂群体。

一、苗期叶片总DNA的提取

(1)取新鲜叶片长度1cm，放入1.2mL的离心管，加入直径4mm的钢珠，液氮速冻后磨碎。

(2)加入300μL的CTAB，65度恒温水浴60min，期间混匀2-3次。

(3)加入300μL的氯仿：异戊醇(24:1，V/V)，轻轻颠倒使其混匀，10000rpm离心10min，吸取100μL的上清液转入新的PCR板。

(4)加入100μL异丙醇，至于-20℃冷冻30min让DNA析出；10000rpm离心5min让DNA沉淀，倒掉上清液，用75％的乙醇清洗沉淀2次，沉淀置于通风橱吹干；

(5)加入100μL ddH₂O溶解DNA，用紫外分光光度计测定DNA的浓度，于-20℃冰箱中保存备用。

二、引物的开发和合成

发明人已经通过生物公司合成了公共和新开发的SSR引物。

利用两个亲本豫麦8679和京411的DNA作为筛选引物的模板，利用溶解后的引物对亲本DNA进行PCR扩增，PCR反应体系(10μL体系)如下表1：

表1

PCR反应程序(10μL体系)如下表2：

表2

将PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

挑选出在亲本中存在多态性引物对RIL群体的191系的DNA进行PCR扩增，然后对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读(图1)。SSR标记为共显性标记，即差异条带表现为位置上(既扩增产物大小)的变异，分离群体的带型依情况分别读作A和B，分别表示来源于豫麦8679和京411。通过对染色后获得的分子标记带型进行判读，获得分子标记基因型数据。利用Joinmap4.0软件对RIL群体的分子标记基因型数据进行连锁分析以构建分子标记遗传连锁图谱(图2)。基于该遗传图谱、RIL群体的基因型数据以及株高表型数据利用QTLCart2.5软件进行株高QTL检测，在2D染色体SSR标记STARP-2001(表3)附近检测到了一个重复性很好的主效QTL位点(图3)，其LOD值和贡献率都较大(表4)。

表3 2D连锁群株高主效QTL连锁标记STARP-2001的引物序列

表4 2D染色体株高主效QTL的基本信息

结果可以看出，筛选出SSR标记STARP-2001为目标分子标记其由序列1所示的单链DNA分子、序列2所示的单链DNA分子和序列3所示的单链DNA分子组成。。

实施例2、分子标记STARP-2001在矮秆育种中的应用

1、田间种植豫麦8679和京411的F₂群体。

2、苗期挂牌取样，并提取叶片总DNA，利用分子标记STARP-2001对其进行PCR扩增，PCR扩增体系按照表1所示，PCR扩增反应按照表2所示。

聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物的带型，根据不同的带型，将F₂单株分为A带型、B带型和H带型三类。

A带型为与豫麦8679一致的带型条带大小为188bp；

B带型为与京411一致的带型条带大小为178bp；

H带型为两条条带同时存在。

3、在成熟期考察F₂单株的株高和穗长，株高为在收获前测量地面到穗子顶端(不包括麦芒)的距离，穗长为主穗(不包括麦芒)的长度，如表5所示。

从表5可以看出，分子标记STARP-2001辅助选择分的A带型单株的株高和穗长均值显著低于B带型单株的株高均值。

因此，可以用分子标记STARP-2001辅助检测待测小麦的株高，具体如下：

用分子标记STARP-2001扩增待测小麦，检测PCR产物，

PCR扩增产物大小为188bp的待测小麦的株高和/或穗长小于PCR扩增产物大小为178bp的待测小麦的株高。

或，以豫麦8679和京411为对照进行相同扩增；与所述豫麦8679的PCR扩增产物带型(带型A)一致的待测小麦的株高和/或穗长小于与所述京411的PCR扩增产物带型(带型B)一致的待测小麦。

将表5的A带型和B带型的株高数据取平均值，结果如表6所示，可以看出，A带型待测小麦群体的平均株高和/或平均穗长小于B带型待测小麦群体的平均株高和/或平均穗长。

因此，可以用分子标记STARP-2001辅助检测待测小麦群体的株高，具体如下：用分子标记STARP-2001扩增待测小麦群体，检测PCR产物的带型，

PCR扩增产物大小为188bp的待测小麦群体的株高低于PCR扩增产物大小为178bp的待测小麦群体的株高。

或，以豫麦8679和京411为对照进行相同扩增；与所述豫麦8679的PCR扩增产物带型(带型A)一致的待测小麦群体的株高低于与所述京411的PCR扩增产物带型(带型B)一致的待测小麦群体。

上述株高低的小麦可以用于培育矮杆小麦。

表5利用SSR标记STARP-2001辅助选择的F₂群体单株的基因型和株高数据

表6

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种与小麦株高和穗长性状主效QTL紧密连锁的分子标记及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgctgacgac tcaaacagga aggaaaaaga30

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcaaacagga aggaaaccgg 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggagcggg tgttcaag 18