一种植物提取物的抗病毒复配增效组合物

摘要

本发明公开了一种植物提取物的抗病毒复配增效组合物，包括如下重量份的组分：0.5‑8份的冷饭团乙醇浸膏的石油醚萃取浸膏和2份的宁南霉素；或者，0.5‑8份的冷饭团乙醇浸膏的氯仿萃取浸膏和2份的宁南霉素；或者，0.5‑8份的冷饭团乙醇浸膏的乙酸乙酯萃取浸膏和2份的宁南霉素。本发明的石油醚、氯仿、乙酸乙酯等萃取浸膏与宁南霉素复配组合，获得不同配比的组合物，通过与宁南霉素复配，其复配组合物能够产生明显增效效果，特定配比的复配组合物抗病毒活性优于未配比的萃取浸膏和商品化药剂宁南霉素。

说明书

技术领域

本发明涉及生物农药技术领域，具体涉及一种包含冷饭团萃取浸膏与宁南霉素的抗植物病毒复配增效组合物。

背景技术

农作物是世界上广泛种植的经济作物，然而，每年因农作物感染植物病毒而造成的经济损失高达数千亿美元，因此，有效控制和治疗植物病毒病对整个农业的发展有着极大意义。烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)是一种普遍产生的植物病毒，具有发病率高和防治困难的特点。目前，所有已商品化的植物抗病毒剂在500μg/mL浓度下对植物病毒的治疗活性仅为30～50％，其抑制效果并不理想，所以，还未找到非常有效的方法对烟草花叶病毒进行防治。研究表明，从植物中开发的抗病毒物质具有毒副作用小，对人类和环境友好且成本低廉的特点，因此，从植物中筛选抗病毒物质依旧是开发植物病毒抑制剂的重要途径之一。

很多植物中具有的抗病毒物质有着环境友好和开发成本低等优点，但是单一的植物活性成分一般不能达到理想的药效效果，通过与其他农药进行复配，可适当提高药效，减少化学药剂的使用量以降低对人类和环境的危害，亦减缓植物病毒抗药性的产生。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的是对冷饭团的乙醇粗提物进行萃取分离，得到的石油醚、氯仿、乙酸乙酯等萃取浸膏与宁南霉素复配组合，获得不同配比的组合物，通过与宁南霉素复配，发现复配组合物能够产生明显增效效果，特定配比的复配组合物抗病毒活性优于未配比的萃取浸膏和商品化药剂宁南霉素。

为达上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种植物萃取浸膏的抗病毒复配增效组合物，包括如下重量份的组分：

0.5-8份的冷饭团乙醇浸膏的石油醚萃取浸膏和2份的宁南霉素；或者，

0.5-8份的冷饭团乙醇浸膏的氯仿萃取浸膏和2份的宁南霉素；或者，

0.5-8份的冷饭团乙醇浸膏的乙酸乙酯萃取浸膏和2份的宁南霉素。

进一步的，复配增效组合物对TMV具有最佳治疗活性时，包括如下重量份的组分：

2份的冷饭团乙醇浸膏的石油醚萃取浸膏和2份的宁南霉素；或者，

1份的冷饭团乙醇浸膏的氯仿萃取浸膏和2份的宁南霉素；或者，

8份的冷饭团乙醇浸膏的乙酸乙酯萃取浸膏和2份的宁南霉素。

进一步的，复配增效组合物对TMV具有最佳保护活性时，包括如下重量份的组分：

2份的冷饭团乙醇浸膏的石油醚萃取浸膏和2份的宁南霉素；或者，

0.5份的冷饭团乙醇浸膏的氯仿萃取浸膏和2份的宁南霉素；或者，

8份的冷饭团乙醇浸膏的乙酸乙酯萃取浸膏和2份的宁南霉素。

进一步的，复配增效组合物对TMV具有最佳钝化活性时，包括如下重量份的组分：

1份的冷饭团乙醇浸膏的石油醚萃取浸膏和2份的宁南霉素；或者，

0.5份的冷饭团乙醇浸膏的氯仿萃取浸膏和2份的宁南霉素。

进一步的，复配增效组合物对TMV具有最佳保护活性时，包括如下重量份的组分：

0.5份的冷饭团乙醇浸膏的氯仿萃取浸膏柱层析分离物和2份的宁南霉素。

更进一步的，所述冷饭团乙醇浸膏的氯仿萃取浸膏柱层析分离物的制备如下：

将冷饭团乙醇浸膏的氯仿萃取浸膏用石油醚溶解，200～300目硅胶拌样、装柱，进行柱层析分离，以石油醚/乙酸乙酯为洗脱液，用等体积洗脱液分5次梯度洗脱，五次洗脱液的石油醚与乙酸乙酯的体积比分别为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4，收集相同极性的洗脱液，得到5个组分Fr7到Fr11，其中Fr8和Fr11是其第二组分和第五组分洗脱液减压得到，即为有效的所述冷饭团乙醇浸膏的氯仿萃取浸膏柱层析分离物。

石油醚浸膏柱层析分离物Fr1到Fr6是指将石油醚浸膏用二氯甲烷溶解，200～300目硅胶拌样、装柱，以石油醚/乙酸乙酯(V/V＝80:1、60:1、40:1、20:1、1:1、1:20)为洗脱液，用等体积洗脱液分6次梯度洗脱，收集相同极性洗脱液并减压浓缩得Fr1到Fr6；氯仿萃取浸膏柱层析分离物Fr8和Fr11是指将氯仿浸膏用适量石油醚溶解，以石油醚/乙酸乙酯(V/V＝4:1、2:1、1:1、1:2、1:4)为洗脱液，用等体积洗脱液分5次梯度洗脱，收集相同极性的洗脱液并减压浓缩得到5个组分Fr7到Fr11；乙酸乙酯萃取浸膏柱层析分离物Fr12到Fr17是指将乙酸乙酯浸膏用甲醇溶解，200～300目硅胶拌样、装柱，以氯仿/甲醇(V/V＝1:0、20:1、10:1、5:1、1:1、0:1)为洗脱液，用等体积洗脱液分6次梯度洗脱，收集相同极性洗脱液并减压浓缩得Fr12到Fr17。

通过对冷饭团石油醚萃取浸膏的柱层析分离物Fr1到Fr6、氯仿萃取浸膏的分离物Fr8到Fr11及冷饭团乙酸乙酯萃取浸膏的柱层析分离物Fr12到Fr17与宁南霉素进行复配，以宁南霉素为对照，初步抗病毒活性测试结果表明：所有经说明的柱层析分离物均表现出一定的抗TMV活性，但相较于其他分离物，Fr8与Fr11表现出较好的抗TMV保护活性，最接近于宁南霉素；Fr11表现出较好的抗TMV钝化活性，最接近于宁南霉素。

冷饭团乙醇浸膏的制备如下：

取冷饭团干果，用5倍量的95％乙醇浸泡提取三次，时长分别为7d、5d、3d，合并三次滤液并减压浓缩(0.08MPa)、干燥(60℃)，得到冷饭团乙醇浸膏。

还公开了如上述的抗病毒复配增效组合物在防治农作物病害中的应用。

进一步的，所述农作物包括烟草、蔬菜和禾谷类作物。

进一步的，所述的农作物病害包括烟草花叶病毒、辣椒病毒、黄瓜花叶病毒。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果：

本发明提供的复配增效组合物之间形成相互增效的关系，其较单剂药效高，持效期长、减缓植物病毒抗药性的产生，这样施用可减少农药的用量，降低成本。

具体实施方式

冷饭团粗提物的制备：

称取冷饭团干果8kg，用5倍量的95％乙醇浸泡提取三次，时长分别为7d、5d、3d，合并三次滤液并减压浓缩(0.08MPa)、干燥(60℃)，得到冷饭团乙醇萃取浸膏1.2kg；在冷饭团乙醇萃取浸膏加入300ml蒸馏水于超声仪中分散，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，直至萃取液为无色，并分别将各萃取液减压浓缩(0.08MPa)，得到冷饭团石油醚萃取浸膏约80g、冷饭团氯仿萃取浸膏约4g、冷饭团乙酸乙酯萃取浸膏约20g、冷饭团正丁醇萃取浸膏约40g，备用。

冷饭团抗病毒活性成分的制备：

生物活性跟踪发现，石油醚层萃取浸膏、氯仿层萃取浸膏和乙酸乙酯层萃取浸膏对烟草花叶病毒的抑制活性较好，故采用柱层析对其进一步的分离。取石油醚层萃取浸膏3g，200ml二氯甲烷溶解，200～300目3g硅胶拌样、60g200～300目硅胶装柱，以石油醚/乙酸乙酯(V/V＝80:1、60:1、40:1、20:1、1:1、1:20)为洗脱液进行柱层析分离，每梯度用400mL洗脱液洗脱，收集相同极性洗脱液并减压浓缩得到6个组分Fr1到Fr6；取氯仿层萃取浸膏3g，200mL二氯甲烷溶解，200～300目硅胶拌样、60g 200～300目硅胶装柱，以石油醚/乙酸乙酯(V/V＝4:1、2:1、1:1、1:2、1:4)为洗脱液进行柱层析分离，每梯度用400mL洗脱液洗脱，收集相同极性的洗脱液并减压浓缩得5个组分Fr7到Fr11；取乙酸乙酯层萃取浸膏3g，200ml甲醇溶解，200～300目硅胶拌样、60g 200～300目硅胶装柱，以氯仿/甲醇(V/V＝1:0、20:1、10:1、5:1、1:1、0:1)为洗脱液进行柱层析分离，每梯度用400ml洗脱液洗脱，收集相同极性洗脱液并减压浓缩得Fr12到Fr17。

冷饭团萃取浸膏与宁南霉素复配增效组合物的制备：

冷饭团石油醚萃取浸膏、氯仿萃取浸膏、乙酸乙酯萃取浸膏与宁南霉素为有效成分复配而成的水剂，供试总浓度为0.5mg/mL，复配组合物是以冷饭团萃取浸膏(冷饭团乙醇浸膏的石油醚萃取浸膏、冷饭团乙醇浸膏的氯仿萃取浸膏、氯仿萃取浸膏的柱层析分离物Fr8和Fr11、冷饭团乙醇浸膏的乙酸乙酯萃取浸膏、冷饭团乙醇浸膏的正丁醇萃取浸膏)与宁南霉素按质量分数比为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4进行复配，以含1％Tween-20的二次蒸馏水为溶剂。

冷饭团萃取浸膏与宁南霉素复配组合物的抗病毒室内生物活性测定

实验方法：

活体治疗试验

采用半叶枯斑法测定。选着叶龄一致且长势良好的心叶烟，将其打顶，在此心叶烟叶片上均匀撒上一层金刚砂，并用排笔在全叶上人工接种病毒，约30min后，用清水冲洗掉金刚砂，叶片自然晾干后，用毛笔在右半叶涂抹药剂，左半叶涂抹对应剂量的溶剂作对照。随后，常温保湿培养，每株处理接种叶片4～5片，每药剂按上述方法重复3次，2～3d后记录枯斑的数目，计算抑制率。

活体保护试验

采用半叶枯斑法测定。选取叶龄一致且长势良好的心叶烟，将其打顶，用毛笔在右半叶涂施药剂，在其左半叶涂施对应计量的溶剂，约24h后，在此心叶烟叶片上均匀撒上一层金刚砂，并用排笔在全叶上人工接种病毒，约30min后，清水冲洗叶片。随后，常温保湿培养，每株处理接种叶片4～5片，每药剂按上述方法重复3次。2～3d后记录枯斑的数目，计算抑制率。

活体钝化试验

选取叶龄一致且长势良好的心叶烟，将其打顶，将TMV用磷酸缓冲溶液稀释至6×10-3mg/mL，在已配好的化合物溶液中加入等体积的稀释病毒液混合钝化30min，同时在对应计量的溶剂中也加入等体积的稀释病毒液。在已选心叶烟叶片均匀撒上一层金刚砂，并用排笔将处理好的化合物人工接种于已选心叶烟右半叶，对应的溶剂与病毒混合液接种于左半叶。约30min后，清水冲洗叶片，随后，常温保湿培养，每株处理接种叶片4～5片，每药剂按上述方法重复3次。2～3d后记录枯斑的数目，计算抑制率。

A TMV枯斑寄主：心叶烟(Nicotiana glutinosa)，种子购于中国农业科学院烟草研究所。

B对照药物：8％宁南霉素水剂(德强生物股份有限公司)。

C供试病毒：烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)，购于中国科学院武汉病毒研究。

实验结果：

表1冷饭团乙醇浸膏萃取浸膏的抗TMV活性

从表1可以看出，冷饭团乙醇浸膏萃取浸膏中，石油醚萃取浸膏的抗TMV保护活性较好，其抑制率为59.86％，接近于商品药宁南霉素；氯仿萃取浸膏对TMV的钝化活性较好，其抑制率为79.02％；乙酸乙酯萃取浸膏对TMV的治疗活性较好，其抑制率为53.18％，接近于商品药宁南霉素；正丁醇萃取浸膏对TMV的保护和钝化抑制率均较好，分别为58.32和88.08％。

因此，冷饭团乙醇浸膏的石油醚层萃取浸膏、氯仿层萃取浸膏、乙酸乙酯层萃取浸膏和正丁醇层萃取浸膏值得进一步研究。

表2冷饭团乙醇浸膏的石油醚萃取浸膏抗TMV活性

注：配比为1:0时，代表石油醚萃取浸膏；配比为0:1时，代表宁南霉素，都为对照。

从表2可以看出，冷饭团石油醚萃取浸膏与宁南霉素按不同质量比复配后对烟草花叶病毒具有明显的增效作用，并且在复配比为1:1时，其治疗和保护抑制率分别为68.85％和68.25％，优于商品药宁南霉素；在复配比为1:2时，其钝化抑制率为86.11％，优于商品药宁南霉素。

表3冷饭团乙醇浸膏的氯仿萃取浸膏抗TMV活性

注：配比为1:0时，代表氯仿萃取浸膏；配比为0:1时，代表宁南霉素，都为对照。

从表3可以看出，冷饭团氯仿萃取浸膏与宁南霉素按不同质量比复配后对烟草花叶病毒具有明显的增效作用，在复配比为1:1和1:2时，其治疗抑制率分别为59.48％和60.04％，优于宁南霉素；在复配比为1:4时，其保护抑制率为69.30％，优于宁南霉素；在复配比为1:1和1:2时，其钝化抑制率分别为96.50和99.08％，优于宁南霉素。

表4冷饭团乙醇浸膏的乙酸乙酯萃取浸膏抗TMV活性

注：配比为1:0时，代表乙酸乙酯萃取浸膏；配比为0:1时，代表宁南霉素，都为对照。

从表4可以看出，冷饭团乙酸乙酯萃取浸膏与宁南霉素按不同质量比复配后对烟草花叶病毒具有明显的增效作用，并且在复配比为4:1和1:1时，其治疗抑制率分别为64.78％和64.38％，与宁南霉素相当；在复配比为4:1时，其保护抑制率为74.71％，与宁南霉素相当。

表5冷饭团乙醇浸膏的正丁醇萃取浸膏抗TMV活性

注：配比为1:0时，代表正丁醇萃取浸膏；配比为0:1时，代表宁南霉素，都为对照。

从表5可以看出，冷饭团正丁醇萃取浸膏与宁南霉素按不同质量比复配后对烟草花叶病毒具有一定增效作用，其活性随着宁南霉素质量比的增大而增强，但均没有超过宁南霉素。

因此，冷饭团乙醇浸膏的石油醚层萃取浸膏、氯仿层萃取浸膏、乙酸乙酯层萃取浸膏值得进一步研究。

表6供试石油醚、氯仿、乙酸乙酯层分段对TMV的抑制活性

从表6可以看出，组分Fr8和Fr11的对TMV的保护抑制率较好，分别为56.97和58.40％；Fr11对TMV的钝化抑制率为81.82％，值得进一步研究。

表7 Fr8和Fr11与宁南霉素复配后对TMV的抑制活性

从表7得出，复配剂在0.5mg/mL供试浓度下，组分Fr8和Fr11分别与宁南霉素复配后，复配剂对TMV的保护抑制率明显增强。组分Fr8和宁南霉素配比在4:1～1:4之间时，其对TMV的保护抑制率优于单剂，配比为1:4时，其保护抑制率为68.02％，优于宁南霉素，增效效果最佳；组分Fr11和宁南霉素配比为1:1～1:4之间时，抗TMV活性明显优于单剂，配比为1:4时，其保护抑制率为70.57％，优于宁南霉素，增效效果最佳。

由此可见，冷饭团萃取浸膏与宁南霉素的复配组合物优于单剂的效果，可用于抗病毒药物的开发研究。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。