降脂药在高同型半胱氨酸血症治疗方面的应用

摘要

本发明公开了降脂药在高同型半胱氨酸血症治疗方面的应用。研究发现，HHcy会显著促进B淋巴细胞自噬、浆细胞化相关基因和蛋白的表达水平，自噬、浆细胞化抑制因子则下调，表明HHcy会刺激促进B淋巴细胞自噬、浆细胞化。降脂药预处理B淋巴细胞可逆转HHcy引起的自噬、浆细胞化相关基因和蛋白上调及相关抑制因子下调。研究还发现，HHcy会显著促进B淋巴细胞分泌anti‑β2GPI，降脂药预处理B淋巴细胞可逆转HHcy对B淋巴细胞分泌anti‑β2GPI的促进作用。anti‑β2GPI作为一种抗磷脂抗体，其升高会导致血液中抗磷脂抗体水平升高，具有诱发抗磷脂综合征的风险，使用降脂药干预可预防该风险。降脂药还可通过抑制高同型半胱氨酸血症致B淋巴细胞分泌anti‑β2GPI降低anti‑β2GPI对巨噬细胞的炎性活化。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，涉及降脂药在高同型半胱氨酸血症治疗方面的应用。

背景技术

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是体内蛋氨酸代谢的中间产物，是一个含有巯基的 非必需氨基酸。蛋氨酸代谢发生异常，会导致血中Hcy这一中间代谢产物的积累。如果血中 Hcy水平上升高于10μM时，即定义为高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia，HHcy)。

已有研究证明，HHcy与包括心血管疾病在内的多种疾病有关。

发明内容

本发明的目的在于提供降脂药在高同型半胱氨酸血症治疗方面的应用。

本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：

降脂药在制备抑制高同型半胱氨酸血症致B淋巴细胞自噬的药物中的应用。体内外研究 发现，HHcy会显著促进B淋巴细胞自噬相关基因和蛋白的表达水平，自噬抑制因子则显著 被下调，这表明HHcy在体和离体会刺激促进B淋巴细胞发生自噬。降脂药非诺贝特预处理 B淋巴细胞可以逆转HHcy引起的自噬相关基因和蛋白上调以及自噬抑制因子下调。

降脂药在制备抑制高同型半胱氨酸血症致B淋巴细胞浆细胞化的药物中的应用。本领域 技术人员知道，当B淋巴细胞激活后会经过免疫球蛋白类型转化重组，最终分化成浆细胞。 BLIMP1和IRF4具有促浆细胞化的作用，抑制B淋巴细胞浆细胞的分子包括BCL6和PAX5 等；通过测定B淋巴细胞中BLIMP1、IRF4、BCL6和PAX5的表达水平可以反映B淋巴细 胞的浆细胞化程度。体内外研究发现，HHcy会显著促进B淋巴细胞浆细胞化相关基因和蛋 白的表达水平，浆细胞化抑制因子则显著被下调，这表明HHcy在体和离体会刺激促进B淋 巴细胞浆细胞化。降脂药非诺贝特预处理B淋巴细胞可以逆转HHcy引起的浆细胞化相关基 因和蛋白上调以及浆细胞化抑制因子下调。

降脂药在制备抑制高同型半胱氨酸血症致B淋巴细胞分泌anti-β2GPI的药物中的应用。 体内外研究发现，HHcy会显著促进B淋巴细胞分泌anti-β2GPI，降脂药非诺贝特预处理B 淋巴细胞可以逆转HHcy对B淋巴细胞分泌anti-β2GPI的促进作用。

降脂药在制备抑制高同型半胱氨酸血症致B淋巴细胞分泌anti-β2GPI进而升高血液中抗 磷脂抗体水平的药物中的应用。anti-β2GPI是一种典型的抗磷脂抗体(APL)，anti-β2GPI升高 会导致血液中抗磷脂抗体水平也显著升高。本领域技术人员知道，APL过高会引起一种自身 免疫性疾病抗磷脂综合征(APS)。也就是说，对于HHcy患者，B淋巴细胞的anti-β2GPI分泌 水平提高导致血液中APL过高具有引发APS自身免疫性疾病的风险，使用降脂药非诺贝特 干预可以预防该风险。

降脂药在制备抑制高同型半胱氨酸血症致B淋巴细胞分泌anti-β2GPI进而促进巨噬细胞 炎性活化的药物中的应用。研究结果发现，anti-β2GPI IgG会直接促进巨噬细胞M1极化并抑 制抑炎性M2极化，促进巨噬细胞分泌炎症因子，引发或加重机体内的炎症。而根据上述结 果，降脂药非诺贝特可以抑制B淋巴细胞分泌anti-β2GPI，所以本领域技术人员可以知道降 脂药可以通过抑制高同型半胱氨酸血症致B淋巴细胞分泌anti-β2GPI降低anti-β2GPI对巨噬 细胞的炎性活化作用。

在具体实施例中，所述降脂药为非诺贝特。

附图说明

图1：HHcy刺激机体产生APL IgG和anti-β2GPI IgG。同型半胱氨酸饮水喂养(1.8g/l)造 成C57BL/6J小鼠HHcy模型中。ELISA检测小鼠血浆APL(A)、anti-β2GPI(B)和ACL (C)IgG水平。n＝3-5。*与对照组相比；P<0.05为具有显著性差异。

图2：Hcy刺激B淋巴细胞产生APL IgG和anti-β2GPI IgG。Hcy刺激C57BL/6J小鼠脾脏B淋巴细胞72小时。ELISA检测Hcy刺激后B淋巴细胞培养基上清APL(A)、anti-β2GPI (B)和ACL(C)IgG水平。n＝6。*与对照组相比；P<0.05为具有显著性差异。

图3：HHcy促进小鼠B淋巴细胞发生浆细胞化。C57BL/6J小鼠给予普通饮水或Hcy(1.8g/l) 的饮水饲养两周后，分离脾脏B淋巴细胞进行检测。(A)用Western blot检测B淋巴细胞内 BLIMP1和IRF4蛋白的表达水平；eIF5作为内参。n＝3。(B)定量PCR检测B淋巴细胞Pax5、 Irf4和Blimp1基因的表达水平。n＝3-5。*与对照组相比；P<0.05差异显著。

图4：Hcy促进小鼠脾脏B淋巴细胞发生浆细胞化。C57BL/6J小鼠分离脾脏B淋巴细胞， 使用Hcy刺激48小时。(A)Western blot检测B淋巴细胞BLIMP1和IRF4蛋白的表达水平，eIF5作为内参。n＝3。(B)定量PCR检测B淋巴细胞Pax5、Irf4和Blimp1基因的表达水平。 n＝3-5。*与对照组相比；P<0.05为具有显著性差异。

图5：HHcy促进小鼠脾脏B淋巴细胞自噬作用。C57BL/6J小鼠给予普通饮水或Hcy(1.8g/l) 的饮水饲养两周，分离脾脏B淋巴细胞进行检测。(A)用Western blot检测B淋巴细胞内 BLIMP1、IRF4、p62和LC3II蛋白表达水平，eIF5作为内参。n＝3。(B)定量PCR检测B淋巴细胞内Blimp1、Irf4、Lc3ii、Atg5、Atg7、Atg9和Atg12基因的表达水平。n＝3-5。*与 对照组相比；P<0.05为具有显著性差异。

图6：Hcy促进小鼠脾脏B淋巴细胞自噬。分离C57BL/6J小鼠脾脏B淋巴细胞，使用Hcy刺激48小时。(A)Westernblot检测B淋巴细胞BLIMP1、IRF4、p62和LC3II蛋白的 表达水平，eIF5作为内参。n＝3。(B)定量PCR检测B淋巴细胞Blimp1、Irf4、Lc3ii、Atg5、 Atg7、Atg9和Atg12基因的表达水平。n＝3-5。*与对照组相比；P<0.05为具有显著性差异。

图7：降脂药非诺贝特抑制B淋巴细胞的浆细胞化、自噬和anti-β2GPI IgG的分泌。分 离C57BL/6J小鼠脾脏B淋巴细胞，非诺贝特(10μM)预处理B淋巴细胞30分钟后，给予 Hcy(100μM)刺激48小时或72小时。(A)Hcy(100μM)刺激48小时后，Western blot 检测B淋巴细胞BLIMP1、IRF4、p62和LC3II蛋白的表达水平，eIF5作为内参。n＝3。(B) Hcy(100μM)刺激B淋巴细胞72小时后，ELISA检测细胞培养基上清中anti-β2GPIIgG水 平。n＝6。*与对照组相比；#与Hcy组相比；P<0.05具有显著性差异。

图8：anti-β2GPI活化巨噬细胞。anti-β2GPI(1ng/μl)刺激巨噬细胞24小时。(A)免疫荧光染色检测巨噬细胞上β2-GPI(红色)和Hochest33324(蓝色)的分布情况。n＝6。(B)定量PCR检测巨噬细胞细胞M1类别转化相关的基因。(C)用定量PCR检测巨噬细胞细胞 M2类别转化相关的基因。n＝6。*与对照组相比；P<0.05为具有显著性差异。

图9：anti-β2GPI活化巨噬细胞分泌炎症因子。anti-β2GPI(1ng/μl)刺激巨噬细胞24小 时。CBA检测小鼠炎症实验检测巨噬细胞TNF-α，MCP1，IL-6以及IL-10等炎症因子分泌情况。n＝6。*与对照组相比.P<0.05为具有显著性差异。

具体实施方式

下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。

一、实验材料

抗小鼠LC3II，BLIMP1，IRF4，Phospho-DRP1(Ser637)：美国CST公司；抗小鼠eIF5抗体：美国Santa Cruz Biotechnology公司；抗小鼠p62抗体：日本MBL International公司； IRDye700或800结合的荧光二抗：美国Rockland公司；抗小鼠APOH抗体：美国Biossantibodies公司；辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)：中杉金桥科技有限公司。

小鼠抗心磷脂抗体IgG(ACA-IgG)检测试剂盒：上海古朵生物科技有限公司；小鼠β2 糖蛋白I抗体IgG(anti-β2GPIIgG)：上海古朵生物科技有限公司；小鼠抗磷脂抗体(AplAPA)： 上海古朵生物科技有限公司；beta2-GlycoproteinI IgG/IgM ELISAKit：美国Abnova公司；BD CBA小鼠炎症检测试剂盒：美国BD公司；BCA蛋白定量试剂盒：美国Pierce公司；AMV 逆转录试剂盒：美国Promega公司。

二、实验方法

1、实验动物与疾病模型建立

1)实验动物：我们选用6～8周龄的雌性小鼠进行实验，其中C57BL/6J小鼠由北京大学 医学部实验动物中心提供，所有小鼠均在无特定病原体(SPF)环境下饲养。

2)高同型半胱氨酸血症小鼠模型：为了在小鼠中诱导高同型半胱氨酸血症，我们给予6 周龄的雌性C57BL/6J小鼠含有1.8g/lDL-同型半胱氨酸的饮水喂养四周，确定同型半胱氨酸 血症诱导成功。

3)所有动物实验遵守北京大学医学部生物医学伦理委员会实验动物伦理分会指南进行。

2、脾脏B淋巴细胞提取和培养

1)脾脏细胞悬液的制备：将小鼠颈椎脱臼法处死后，75％酒精消毒，迅速打开腹腔分离 脾脏置于细胞用PBS(4℃)中。剥离脾脏周围筋膜、脂肪、结缔组织，置于300目尼龙网上， 加入PBS并对脾脏研磨，制备脾脏的单细胞悬液。

2)分离单个核细胞：将脾脏的单细胞悬液转移至15ml离心管中，离心(1000rpm×10min) 后，弃上清，加入4℃预冷的红细胞裂解红细胞(每个小鼠脾脏对应加入3-5ml)，离心 (1000rpm×10min)，再用PBS重悬洗涤，离心(1000rpm×10min)后收集得到单个细胞。

3)抗CD19磁珠阳性分选B淋巴细胞(以分离1×10⁸脾脏细胞为例)：将分离的单个核>8细胞/900μl，随后加入抗CD19磁珠100μl后，4℃冰箱中孵育18min，>+B淋>

4)B淋巴细胞的培养：用含有10％血清的RPMI-1640培养基重悬细胞，细胞计数，以3×10⁶细胞/ml接种于细胞培养板中，加入LPS(终浓度为0.1μg/ml)后，放入37℃的5％CO₂的细胞孵箱中培养。

5)Hcy刺激实验：往含有B细胞的培养基加入Hcy(终浓度100μM)，刺激特定时间。

6)抑制剂或阻断剂加入：在加入Hcy刺激前半小时，往B细胞中加入自噬抑制剂3-MA (终浓度为10mM)，降脂药非诺贝特(终浓度为10μM)预先孵育半小时。

3、原代小鼠腹腔巨噬细胞分离

1)雌性8周龄C57BL/6J小鼠腹腔注射4％巯乙酸盐肉汤2ml。

2)3天后，脱颈椎死小鼠，75％酒精消毒，下腹部进针注射8ml含有10％FBS的腹腔灌 洗液，按摩腹部3分钟，充分灌洗腹腔。

3)剪开皮肤，暴露腹腔，用10ml注射器尽取腹腔液体。

4)腹腔液体离心(1000rpm×5min)，弃上清；加入5ml含10％FBS的RPMI-1640洗涤细胞，离心(1000rpm×5min)，弃上清。

5)用含有10％血清的RPMI-1640培养基重悬细胞，细胞计数，以3×10⁶细胞/孔接种于>6细胞/孔接种于细胞培养12孔板中(用>2的细胞孵箱中培养，贴壁2小时后换入新鲜的含有>

4、细胞蛋白的提取和定量

1)细胞总蛋白的提取：收集悬浮的B细胞至1.5mlEP管中，离心(4℃，350g×10min)， 弃去上清，加入PBS吹洗细胞，再次离心(4℃，350g×10min)后，加入全细胞裂解液(每 1×10⁷个B细胞对应加入40μl)，冰上放置30min待细胞充分裂解。离心(4℃，10000rpm×10min)>

2)蛋白定量：利用Pierce公司的BCA蛋白定量试剂盒，配置白蛋白标准溶液(0、50、100、200、300、400、500、1000mg/ml)，分别加入96孔酶标板中(每孔25μl)，待测蛋 白样品用水稀释至25μl(2.5μl样品+22.5μl水)后加入酶标板，最后每孔加入200μl的BCA 工作液(试剂A和试剂B以50:1的浓度混合)，37℃孵育30min，以570nm为测定波长， 630nm为校准波长，利用酶标仪测定并记录吸光度值。利用Prism6软件根据标准蛋白的吸光 度值作出标准曲线，再根据样品的吸光度值计算出样品的蛋白浓度。

5、蛋白印迹实验(Western blotting)

1)蛋白电泳：配置不连续SDS聚丙烯酰胺凝胶(上层为6％浓缩胶，下层为10％分离胶)， 利用Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra cell系统加入蛋白样品(蛋白与5×上样缓冲液以1:4比例 混合)以及蛋白分子量marker后进行电泳，55V恒压电泳至溴酚兰到达分离胶界面，蛋白 marker初步分离后，改变电压至110V，恒压电泳至溴酚兰到达分离胶下边界后停止电泳。

2)蛋白转膜：切割出7×5cm大小的凝胶，利用Bio-Rad Mini Trans-BlotElectrophoretic Transfer Cell系统将凝胶恒流(250mA)电转2小时，转移到硝酸纤维膜上。

3)免疫杂交：转膜后，取出印迹膜在室温下用5％牛奶或BSA封闭1小时，随后加入一 抗(1:1000浓度稀释)，在4℃摇床中孵育过夜。第二天取出印迹膜，利用TBST洗膜(3 次×10min)，将印迹膜加入IRDye700或800连接的荧光二抗(1:10000～20000稀释)中避光 室温孵育1小时，再用TBST洗膜(3次×10min)。

4)蛋白显影：利用Odyssey红外成像系统，选取相应的荧光通道检测印迹膜的荧光条带。

5)图像分析：利用Odyssey软件，去除背景后，根据条带的灰度值来进行蛋白表达的定 量，并导出相应图像。

6、总RNA提取和定量

1)总RNA液相分离：收集悬浮的B细胞至1.5ml EP管中，离心(4℃，350g×10min)，弃去上清，加入PBS吹洗细胞，再次离心(4℃，350g×10min)后，加入RNATRIzol(每1×10⁷个B细胞加入1ml)，冰上放置10min待细胞充分裂解；向EP管内加入200μl三氯甲烷，用>

2)RNA沉淀：加入等体积的异丙醇至上层液相中，颠倒混匀后冰上放置15min，离心(4℃，13000rpm×15min)。

3)RNA洗涤：离心后弃去上清，加入1ml的75％乙醇(利用DEPC水稀释)，颠倒混 匀后离心(4℃，13000rpm×10min)，弃去上清后室温静置干燥RNA。

4)RNA溶解重悬：加入无核酸酶水溶解RNA(每1×10⁷个B细胞加入10-15μl)溶解RNA沉淀。

5)RNA定量：吸取DEPC水测定，作为空白对照，随后每个样品吸取1μl来进行浓度测定，记录RNA浓度与吸光度OD260nm/280nm。

7、实时定量PCR分析

1)RNA逆转录：吸取1.5μg总RNA至EP管，70℃变性10min后置于冰上，利用Promega逆转录系统，在EP管中分别加入以下试剂：

25mM MgCl₂4μl

10×逆转录缓冲液2μl

10mM dNTP混合物2μl

Oligo(dT)15引物1μl

重组逆转录酶抑制剂0.5μl

AMV逆转录酶0.6μl

最后用无核酸酶水补足至20μl的总体积。

将EP管放入42℃水浴1小时，100℃变性5min后，放置冰上，放入-20℃保存。

2)PCR引物设计：PCR引物根据NCBI网站上Primer设计，利用Oligo软件进行引物筛选，最后利用NCBI网站上Blast进行引物特异性对比分析，得到特异的引物。具体引物序列如下表所示：

3)定量PCR及数据分析：

逆转录得到cDNA按照qPCR体系进行实验，体系如下：

10×PCR缓冲液2.5μl

2.5mM dNTP混合物2μl

10μM上游引物0.5μl

10μM下游引物0.5μl

逆转录反应混合物5μl

TaKaRaTaq 0.25μl

SYRB Green 1.25μl

去离子水补充至25μl

预变性94℃5min；(变性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃30s)×40个循环；延伸72℃5min。收集数据，利用Stratagene Mx Pro软件进行统计分析。

8、ELISA测定APL、ACA和anti-β2GPI IgG

1)样品收集：对于细胞上清样品，将分离得到的B淋巴细胞(1×10⁶细胞/500μl)植入>

2)实验测定：利用上海古朵生物科技有限公司的小鼠特异性APL抗体，ACL抗体和aβ2GPI IgG。

3)ELISA试剂盒进行测定。

9、统计学分析

所有实验数据均利用GraphPad Prism 6软件统计，并以平均数±标准差(Mean±SD)表示。 对两组数据之间进行比较时，采用学生t检验方法；对多组数据进行比较时，则采用单因素 方差分析，并进一步采用Tukey检验。P值<0.05作为显著性差异的标准。

三、实验结果

1、高同型半胱氨酸促进B淋巴细胞分泌anti-β2GPI

利用6周龄C57BL/6J雌性小鼠进行4周Hcy(1.8g/l)饮水喂养，诱导HHcy模型。随后我们对激活B淋巴细胞产生总的抗磷脂抗体(APL)和其中两种典型的抗磷脂抗体，即anti-β2GPI和抗心磷脂抗体(ACL)IgG分泌水平进行了检测。如图1所示，与对照组相比，HHcy 小鼠外周血中总APL IgG显著上升(3609.67±585.70mg/l上升到8402.67±1014.18mg/l)， anti-β2GPI IgG水平也明显增加(2.45±0.47mg/l上升到5.82±1.63mg/l)。但ACL IgG水平没 有明显变化。结果说明HHcy促进小鼠B淋巴细胞APL以及anti-β2GPIIgG的生成和分泌。

我们在离体实验中进一步验证HHcy刺激B淋巴细胞产生抗磷脂抗体的作用。分离C57BL/6J小鼠脾脏B淋巴细胞后，给予Hcy(100μM)刺激72小时，anti-β2GPI IgG明显上 升(从0.023±0.0039mg/l上升到0.10±0.020mg/l)(图2中B)。但是与对照组相比，APL IgG与ACL IgG水平没有变化(图2中A和C)。结果进一步证实HHcy促进小鼠B淋巴细胞抗 磷脂抗体产生，特别是促进其anti-β2GPI IgG的产生和分泌。

2、高同型半胱氨酸促进B淋巴细胞浆细胞化

本领域技术人员知道，当B淋巴细胞激活后会经过免疫球蛋白类型转化重组，最终分化 成浆细胞。BLIMP1和IRF4具有促浆细胞化的作用，抑制B淋巴细胞浆细胞的分子包括BCL6 和PAX5等；通过测定B淋巴细胞中BLIMP1、IRF4、BCL6和PAX5的表达水平可以反映B 淋巴细胞的浆细胞化程度。

如图3中A，HHcy在体显著上调脾脏B淋巴细胞BLIMP1和IRF4的蛋白表达水平。同时，如图3中B的定量PCR结果显示，HHcy小鼠脾脏Blimp1和转录因子干扰素调节因子4(Irf4)基因水平也显著上调。此外，抑制B淋巴细胞浆细胞化的转录因子Pax5基因呈现下降趋势。以上结果说明Hcy在体刺激促进B淋巴细胞向浆细胞分化。

在离体实验中，我们进一步验证了Hcy对B淋巴细胞的浆细胞化作用。如图4中A所示， 从C57BL/6J小鼠分离脾脏B淋巴细胞后，给予Hcy(100μM)刺激48小时，B淋巴细胞表 达的浆细胞化标志BLIMP1和IRF4的蛋白表达水平显著上调。同时，如图4中B的定量PCR 结果显示，Hcy离体刺激小鼠脾脏B淋巴细胞，其浆细胞化标志Blimp1和Irf4基因表达水平 显著上调。此外，抑制B淋巴细胞浆细胞化的转录因子Pax5基因与在体HHcy刺激B淋巴 细胞结果一致，呈现下降趋势。

以上结果提示，HHcy在体和离体显著上调B淋巴细胞BLIMP1和IRF4的蛋白和基因表 达水平，同时下调转录因子Pax5的基因表达水平，从而促进B淋巴细胞发生浆细胞化。

3、高同型半胱氨酸促进B淋巴细胞自噬

本领域技术人员知道，B淋巴细胞的浆细胞化以及系统性红斑狼疮等抗磷脂综合征的发 病过程依赖于B淋巴细胞的自噬作用。

如图5中A，HHcy在体促进B淋巴细胞浆细胞化，即BLIMP1和IRF4蛋白表达水平显著上调的情况下，B淋巴细胞表达的自噬标志蛋白(LC3II)水平显著上调；p62蛋白水平显著下降。同时，如图5中B的定量PCR结果显示，HHcy在体刺激脾脏B淋巴细胞浆化相关Blimp1和Irf4的基因表达水平显著上调；Pax5基因显著下调。自噬相关基因Lc3ii、Atg5、Atg7、Atg9、Atg12的mRNA表达显著上调。这些结果说明HHcy刺激B淋巴细胞发生浆细 胞化的同时促进B淋巴细胞自噬。

为了进一步验证上述在体HHcy对B淋巴细胞自噬的调控作用。我们从C57BL/6J小鼠 分离脾脏B淋巴细胞后，给予Hcy(100μM)刺激48小时，如图6中A所示，Hcy刺激B 淋巴细胞BLIMP1和IRF4的蛋白表达水平显著上调；脾脏B淋巴细胞表达的自噬标志蛋白 (LC3II)蛋白水平显著上调；自噬底物p62蛋白水平显著下降。图6中B的定量PCR结果 显示，Hcy刺激脾脏B淋巴细胞Blimp1和Irf4基因水平显著上调，抑制性因子Pax5基因表 达显著被下调，自噬相关基因Lc3ii、Atg5、Atg7、Atg9、Atg12的mRNA表达水平显著上调。 以上结果进一步说明Hcy在体和离体刺激促进B淋巴细胞发生自噬。

4、降脂药非诺贝特阻断Hcy上调B淋巴细胞浆细胞化、自噬和anti-β2GPI的分泌

如图7中A，Westernblotting结果显示，非诺贝特预处理B淋巴细胞有效翻转由Hcy刺 激上调的B淋巴细胞BLIMP1和IRF4等浆细胞化标志的蛋白表达水平。同时，Hcy刺激引起的自噬标志蛋白(LC3II)蛋白表达水平的上调和p62蛋白水平的下调均得到翻转。在图7中B的ELISA结果显示，非诺贝特显著降低Hcy刺激B淋巴细胞72小时后anti-β2GPI IgG 产生(从0.12±0.02mg/l降低到0.05±0.01mg/l)。这些结果说明，脂质代谢参与Hcy促进B 淋巴细胞浆细胞化以及anti-β2GPI IgG分泌的过程，降脂药非诺贝特可以阻断Hcy上调B淋巴细胞浆细胞化、自噬和anti-β2GPI的分泌。

5、anti-β2GPI IgG促进巨噬细胞M1致炎极化并抑制其M2抑炎极化

使用商品化anti-β2GPI IgG对巨噬细胞进行刺激，观察该抗体对巨噬细胞极化的影响。 如图8中A所示，与对照组相比，激光共聚焦显像观察到anti-β2GPI IgG处理巨噬细胞后， 其表面出现β2GPI向巨噬细胞膜的募集。图8中B结果显示抗体处理巨噬细胞后，其Il-1β、 Tnf-α、Mcp1以及Il-6等多种炎性细胞因子基因表达增加。图8中C结果显示抗体处理巨噬 细胞后，抑炎M2型巨噬细胞标志分子Arg-1、Mrc1、Mmgl2、Clec10a和Chi3l3的基因表达 被显著降低。这些结果说明anti-β2GPI直接促进巨噬细胞M1极化并抑制抑炎性M2极化。

我们还检测了anti-β2GPI IgG作用于巨噬细胞后，对先关的炎症因子分泌水平的影响。 如图9流式CBA的结果显示，anti-β2GPI IgG可以有效的诱导巨噬细胞肿瘤坏死因子(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP1)、白细胞介素-6(IL-6)以及白细胞介素-10(IL-10)等炎症因子分泌。

上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不 应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。