一种检测CYP3A4、CYP3A5多态性位点的试剂盒及其方法

摘要

本发明公开了一种检测CYP3A4、CYP3A5多态性位点的试剂盒及其方法，包含序列表中序列1‑4所示CYP3A4*1G的特异性上下游引物序列、序列5‑8所示CYP3A4*1G的特异性TaqMan‑MGB双荧光探针序列、序列9‑12所示CYP3A5*3的特异性上下游引物序列和序列13‑16所示CYP3A5*3的特异性TaqMan‑MGB双荧光探针序列。本发明的有益效果为特异性强、防污染、灵敏度高、检测速度快、结果分析简单且准确性高、该试剂盒可以通过检测CYP3A4、CYP3A5基因多态性位点，判断待测对象对芬太尼类药物的代谢能力，从而更准确有效地指导芬太尼类等药物的用药，具有实际的临床应用价值。将该试剂盒应用于临床的诊断后，与现有技术的吻合度更高，且价格低廉、可重复性高。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及基因检测，更具体地涉及CYP3A4、CYP3A5多态性位点基因检测试剂盒及其方法。

背景技术

CYP3A4是CYP3A亚家族中最主要的成员,占P450酶系总量的30%~40%,主要分布在肝脏和肠道。它参与了许多药物和外源性毒物的氧化代谢,可代谢约50%的临床常用药物。研究表明,人肝脏中CYP3A4的表达及其活性存在着明显的个体差异,并且这种差异90%与遗传多态性有关。CYP3A4基因位于人类第7号染色体7q21.1-q22.1上，长约27 kbp，其基因结构包括13个外显子及12个内含子。CYP3A4*1G （20230G>A）是CYP3A4内含子10中的一个单核苷酸多态性（SNP），其在中国汉族人群中的发生频率为22.1%～37%。CYP3A4*1G与阿托伐他汀、环孢霉素、他克莫司、芬太尼等药物的剂量、疗效及药代动力学改变有关。

CYP3A5位于人类7号染色体q21.1-q22.1，基因全长为31.8kb，有13个外显子，编码502个氨基酸。CYP3A5 占CYP3A总量的50%，主要在肝和小肠及其他肝外组织如肾、前列腺和肺中表达，CYP3A5表达和活性呈高度多态性，有广泛个体与种族差异。 CYP3A5酶的氨基酸与编码CYP3A4酶的氨基酸有84%的相似性，CYP3A5酶和CYP3A4酶具有诸多重叠的代谢底物和相似的催化活性，但CYP3A5酶活性比CYP3A4低80%。其中位于内含子3的SNP(6986 A>G突变)最为重要，突变定义为CYP3A5*3，在中国人群中的发生频率较高（71%~77.8%）。

芬太尼类药物为人工合成的强效麻醉性镇痛药，镇痛机制与吗啡相似，为阿片受体激动剂，作用强度为吗啡的60-80倍。其主要通过肝脏细胞色素酶P450系统的CYP3A4/CYP3A5亚家族代谢，药物在体内的代谢速率受酶活影响。芬太尼类药物为临床主要的麻醉用药，但药物剂量一旦过量，会导致呼吸抑制甚至死亡的危险。通过检测芬太尼类药物的主要代谢基因CYP3A4/CYP3A5的基因位点，来判断患者对芬太尼类药物的代谢能力，从而指导药物的使用剂量。

目前很多药物通过P450家族的酶代谢，测定P450基因型，确定酶活很关键。但是 CYP3A4、CYP3A5基因的几个关键位点，由于序列结构比较特殊，设计荧光探针的难度较大，且设计出来的探针对基因型的分别率不高，同时与之匹配的PCR引物要求也高，引物本身或上下游引物之间存在二级结构，或引物与DNA模板的结合效率低，上下游引物之间的DNA模板序列存在高GC等特殊结构，都将导致PCR效率低。目前市场上销售的分型产品，只有全球最大的生物公司Thermal Fisher提供，其序列与配方全部保密，且试剂盒价格昂贵。目前国内一般采用直接测序法和定性PCR法来检测基因多态性。这两种方法的灵敏度和特异性均不高，并不能准确的检测出基因多态性。此外，直接测序大部分采用外包实验，检测时间太长，至少需要24小时，为检测带来不便。

综上所述，本领域迫切需要开发操作简便、特异性好、准确率高、能高效地检测CYP3A4、CYP3A5多态性位点的试剂盒和方法，以弥补国内CYP3A4、CYP3A5基因检测方面的不足。

发明内容

本发明者通过广泛而深入的研究，进行大量筛选，找到了适合CYP3A4*1G、CYP3A5*3基因检测的特异性引物和特异性TaqMan-MGB双荧光探针，具体地提供了针对CYP3A4*1G基因和CYP3A5*3基因的上、下游引物和特异性荧光探针，制成用于检测CYP3A4、CYP3A5基因多态性位点的实时荧光PCR检测试剂盒。

本发明提供的用于检测CYP3A4、CYP3A5多态性位点的试剂盒包含序列表中序列1-4所示CYP3A4*1G的特异性引物上下游序列、序列5-8所示CYP3A4*1G的特异性TaqMan-MGB双荧光探针序列、序列9-12所示CYP3A5*3的特异性引物上下游序列和序列13-16所示CYP3A5*3的特异性TaqMan-MGB双荧光探针序列；2×Master Mix及使用说明书。

一种检测CYP3A4、CYP3A5多态性位点的试剂盒，该试剂盒包括引物，特异性TaqMan双荧光探针和PCR扩增试剂，其中检测试剂盒分成两组：

A组

用于检测位点CYP3A4*1G的引物序列：

SEQ1：5' CAGAGCCTTCCTACATAGAG 3'；

SEQ2：5' GGCCCAATCAATTATCTTTA 3'；

用于检测位点CYP3A4*1G的探针序列：

SEQ3：5'FAM-TCTCCATGTACCATCCACTC-3' MGB；

SEQ4：5' VIC-TCTCCATGTATCATCCACTC-3' MGB；

用于检测位点CYP3A5*3的引物序列：

SEQ5：5' AGAGTGGCATAGGAGATACC 3'；

SEQ6：5' GTGTGACACACAGCAAGAGT 3'；

用于检测位点CYP3A5*3的探针序列：

SEQ7：5' FAM-TTGTCTTTCAATATCTCTTCCC-3' MGB；

SEQ8：5' VIC-TTGTCTTTCAGTATCTCTTCCC-3' MGB；

B组

用于检测位点CYP3A4*1G的引物序列：

SEQ9：5' CTTACGCTTCTGCCAGTAG 3'；

SEQ10：5' TATGTATGAACTGGCCACTC 3'；

用于检测位点CYP3A4*1G的探针序列：

SEQ11：5' FAM-CTCCATGTACCATCCACT-3' MGB；

SEQ12：5' VIC-CTCCATGTATCATCCACT-3' MGB；

用于检测位点CYP3A5*3的引物序列：

SEQ13：5' GAGAGTGGCATAGGAGATAC 3'；

SEQ14：5' AAGCCAGACTTTGATCATTA 3'；

用于检测位点CYP3A5*3的探针序列：

SEQ15：5' FAM-TGTCTTTCAATATCTCTTCCC-3' MGB；

SEQ16：5' VIC-TGTCTTTCAGTATCTCTTCCC-3' MGB；

所述特异性TaqMan双荧光探针分为特异性野生型TaqMan荧光探针和特异性突变型TaqMan荧光探针，其5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有淬灭基团；所述特异性野生型TaqMan荧光探针和所述特异性突变型TaqMan荧光探针的荧光报告基团肯定是不同的，淬灭基团可相同可不同。

所述荧光报告基团可选自下组的报告基团：FAM、VIC、TET、JOE、HEX；

所述淬灭基团可选自下组的淬灭基团：BHQ1、BHQ2、TAMRA、MGB。

优选的，本发明所述的特异性野生型TaqMan荧光探针的荧光报告基团为FAM，淬灭基团为MGB；所述特异性突变型TaqMan荧光探针的荧光报告基团为VIC，淬灭基团为MGB。

所述PCR扩增试剂包含PCR缓冲液dATP、dCTP、dGTP、dUTP、dTTP、UDG酶、Taq酶和dd H2O。

本发明试剂盒可用于CYP3A4、CYP3A5多态性位点的检测，检测方法包括如下步骤：

使用基因组提取方法提取待测样本的基因组DNA，浓度为10-100ng/μL，所述待测样本选自：血液样本、唾液样本、口腔拭子、或其组合；

配制浓度为50-900nM的引物溶液、浓度为50-500nM的探针溶液和PCR扩增试剂（2×Master Mix）；

2×Master Mix组分浓度范围Tris-HCl（pH8.0-pH9.0）10-100mMKCl10-50 mM(NH4)2SO4 1-10 mMMgCl21.5-6.0mMdATP0.2-0.5mMdCTP0.2-0.5mMdGTP0.2-0.5mMdUTP0.2-0.5mMdTTP0.1-0.3mMUDG酶0.05-0.2UTaq酶0.05-0.2U甘油10-20%

3）配制荧光定量PCR反应体系：包括PCR扩增试剂、特异性引物上下游、特异性野生型TaqMan荧光探针、特异性突变型TaqMan荧光探针、待测样本的基因组DNA和ddH2O；

4）用实时荧光定量PCR仪进行PCR扩增：

37-50℃2-3min

95℃ 10min

95℃ 15s

58-62℃1min

5）将扩增得到的数据进行分析，得到基因的分型结果。

本试剂盒可用于检测CYP3A4、CYP3A5基因多态性位点，判断待测对象对芬太尼类药物的代谢能力，从而更准确有效地指导芬太尼类等药物的用药。

通过检测CYP3A4和CYP3A5基因多态性位点，提供CYP3A4和CYP3A5基因组合用药剂量梯度分级(表1)，剂量由少到多分级为I-IV级(即I级用量最少，IV级用量最多)，实际用药量以实际临床为准。例如，达到相同镇痛效果时，*1G/*1G组患者消耗的PCIA舒芬太尼量为(49.8±10.2)μg，与*1/*1组(64.6±10.9)μg和*1/*1G组(62.5±12.7)μg相比均减少(P＜0.01)。

表1 CYP3A4和CYP3A5基因与芬太尼的用药剂量

有益效果：

该试剂盒可以快速简便地检测CYP3A4、CYP3A5基因多态性位点，其优点为：

1、特异性强：本试剂盒使用的是特异性TaqMan双荧光探针对基因多态性位点进行识别，而且TaqMan探针在3’端连接有MGB淬灭基团。MGB探针无荧光淬灭子，降低背景信号，增加信噪比；将探针的Tm值提高了10℃左右，提高了探针与模板结合物的退火温度，增强DNA的结合；当探针与模板的单碱基不匹配即可抑制两者结合，提高特探针特异性。

2、防污染：在PCR扩增试剂中加入了dUTP和UDG酶，可以防止气溶胶污染；本试剂盒扩增和检测过程中不需开盖，在同一管中进行，降低了污染的可能性。

3、灵敏度高：极微量基因组DNA也能检测出CYP3A4、CYP3A5基因多态性。

4、检测速度快：PCR反应时间短，在反应完成后直接能看到检测结果；一次可以检测单个或多个样本。

5、结果分析简单且准确性高：本试剂盒中有两条特异性TaqMan-MGB探针,检测结果直接就能从扩增曲线中得出，提高了判断基因多态性位点的准确性。

6、该试剂盒可以通过检测CYP3A4、CYP3A5基因多态性位点，判断待测对象对芬太尼类药物的代谢能力，从而更准确有效地指导芬太尼类等药物的用药，具有实际的临床应用价值。将该试剂盒应用于临床的诊断后，与现有技术的吻合度更高，且价格低廉、可重复性高。

附图说明

图1A为样品1的A组CYP3A4*1G的扩增曲线图；

图1B为样品1的B组CYP3A4*1G的扩增曲线图；

图2A为样品1的A组CYP3A5*3的扩增曲线图；

图2B为样品1的B组CYP3A5*3的扩增曲线图；

图3A为样品2的A组CYP3A4*1G的扩增曲线图；

图3B为样品2的B组CYP3A4*1G的扩增曲线图；

图4A为样品2的A组CYP3A5*3的扩增曲线图；

图4B为样品2的B组CYP3A5*3的扩增曲线图；

图5为样品扩增曲线图综合对比图。

具体实施方式

下面结合实施例与附图，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明有任何限制。

实施例1： 样本的收集

样本收集前30分钟，病人使用清水漱口，30分钟内不应进食，饮水。

1、打开口腔拭子包装，小心取出拭子，拭子头部在口腔内壁来回摩擦20-30次。

2、打开唾液保存管将拭子头部在保存管中折断，盖上保存管盖，完成样本收集。

实施例2：DNA抽提

本抽提步骤使用默禾医疗科技（上海）有限公司的唾液DNA提取试剂盒（磁珠法）进行提取。提取得到待测样本1，2，3。

1. 收集好的样本置于恒温震荡混匀仪上，选择参数56℃，15min，800rpm/min。进行唾液样本前处理。

2. 打开试剂盒，取出排管，上下摇晃6-10次，使排管⑦孔的磁珠混匀后，小心撕去封口膜;

3. 在第①孔内加入300μL处理后唾液样本后，在第⑨孔内加入100μL 洗脱缓冲液，将排管放置至CTC-2000核酸提取仪抽屉，装上磁棒套。选择saliva DNA程序运行即可。

4.程序结束后于⑨孔收集提取后的DNA，进行后续实验或-20℃保存。

经检测，待测样本1，2的DNA浓度分别为10ng/μL，40ng/μL。

实施例3 荧光PCR检测

1. 将CYP3A4*1G特异性上下游引物序列1和序列2，特异性TaqMan-MGB双荧光探针序列5和序列6；CYP3A4*1G特异性上下游引物序列3和序列4，特异性TaqMan-MGB双荧光探针序列7和序列8；CYP3A5*3特异性上下游引物序列9和序列10，特异性TaqMan-MGB双荧光探针序列13和序列14；CYP3A5*3特异性上下游引物序列11和序列12，特异性TaqMan-MGB双荧光探针序列15和序列16分成两组（分别为A组、B组）进行PCR实验，具体如下表所示：

2. 配制荧光定量PCR反应体系：包括PCR扩增试剂、特异性引物上下游、特异性野生型TaqMan荧光探针、特异性突变型TaqMan荧光探针、待测样本的基因组DNA和ddH2O；

TaqMan荧光定量2× Master Mix (1mL)的组成如下：

组分浓度Tris-HCl(pH8.6)50mMKCl50mM(NH₄)₂SO₄5mMMgCl₂4mMdATP0.4mMdCTP0.4mMdGTP0.4mMdUTP0.4mMdTTP0.2mMUDG酶0.2UTaq酶0.2U甘油13%

PCR反应体系(10μL)如下：

2× Master Mix5 μlddH2O3 μl引物F (10μM)0.25 μl引物R(10μM)0.25 μl探针1(10μM)0.25 μl探针2(10μM)0.25 μl模板DNA1μl

3. 反应条件为：50℃ 2分钟 → 95℃ 10分钟 → [95℃ 15秒、60℃ 1分钟] 共40个循环。

4. 如图4所示。结果表明，本试剂盒CYP3A5*3的2组引物探针扩增后都有扩增曲线实验结果

样品1的两组CYP3A4*1G的扩增曲线如图1所示。结果表明，本试剂盒CYP3A4*1G 的2组引物探针扩增后都有扩增曲线，但是B组（图1B）比A组(图1A)的扩增效率更高。从图中能够清楚地判断样品1的FAM和VIC两种荧光都有扩增曲线，所以CYP3A4基因型为杂合型（CYP3A4*1/*1G）。

样品1的两组CYP3A5*3的扩增曲线如图2所示。结果表明，本试剂盒CYP3A5*3的2组引物探针扩增后都有扩增曲线，但是B组（图2B）比A组(图2A)的扩增效率更高。从图中，能够清楚地判断样品1存在FAM荧光的扩增曲线而没有VIC荧光的扩增曲线，所以样品1 的CYP3A5基因型为野生纯合型（CYP3A5*1/*1）。

样品2的两组CYP3A4*1G的扩增曲线如图3所示。结果表明，本试剂盒CYP3A4*1G 的2组引物探针扩增后都有扩增曲线，但是B组（图3B）比A组(图3A)的扩增效率更高。从图中能够清楚地判断样品2只有VIC荧光的扩增曲线而没有FAM荧光的扩增曲线，所以样品2的CYP3A4基因型为突变纯合型（CYP3A4*1G/*1G）。

样品2的两组CYP3A5*3的扩增曲线，但是B组（图4B）比A组(图4A)的扩增效率更高。从图中，能够清楚地判断样品2的FAM和VIC两种荧光都有扩增曲线，所以样品2 CYP3A5基因型为杂合型（CYP3A5*1/*3）。

CYP3A4和CYP3A5基因检测结果及芬太尼代谢能力

CYP3A4基因型CYP3A5基因型芬太尼代谢能力样品1CYP3A4*1/*1GCYP3A5*1/*1正常样品2CYP3A4*1G/*1GCYP3A5*1/*3最弱

以上实施例的先后顺序仅为便于描述，不代表实施例的优劣。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

序列表

<110>默禾医疗科技（上海）有限公司

<120>一种检测CYP3A4、CYP3A5多态性位点的试剂盒及其方法

<160>16

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>智人（Homo sapiens）

<400>1

cagagccttc ctacatagag20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>智人（Homo sapiens）

<400>2

ggcccaatca attatcttta 20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>探针

<400>3

tctccatgta ccatccactc 20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>探针

<400>4

tctccatgta tcatccactc 20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>智人（Homo sapiens）

<400>5

agagtggcat aggagatacc 20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>智人（Homo sapiens）

<400>6

gtgtgacaca cagcaagagt 20

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>探针

<400>7

ttgtctttca atatctcttc cc ttgtcttt cagtatctct tccc 22

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>探针

<400>8

ttgtctttca gtatctcttc cc 22

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>智人（Homo sapiens）

<400>9

cttacgcttc tgccagtag t atgtatgaac tggccactc 19

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>智人（Homo sapiens）

<400>10

Tatgtatgaa ctggccactc 20

<210>11

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>探针

<400>11

ctccatgtac catccact ct ccatgtatca tccact 18

<210>12

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>探针

<400>12

ctccatgtat catccact 18

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>智人（Homo sapiens）

<400>13

gagagtggca taggagatac 20

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>智人（Homo sapiens）

<400>14

aagccagact ttgatcatta 20

<210>15

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>探针

<400>15

tgtctttcaa tatctcttcc c 21

<210>16

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>探针

<400>16

tgtctttcag tatctcttcc c 21