一种测定磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的电化学方法

摘要

本发明公开一种测定磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的电化学方法，属于电化学分析技术领域。本发明所述方法为首先选用导电性良好的碳浆电极，采用透析法对PEPC抗体进行纯化，之后将其固定在碳浆工作电极上，由于该抗体与磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的特异性结合，该传感器能快速识别并捕获植物总蛋白中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。利用电化学方法可快速实现对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的高灵敏度检测；该检测方法具有灵敏度高，检测限低，选择性和重复性好等优点，可用于磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的定量检测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种测定磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的电化学方法，属于电化学分析技术领域。

背景技术

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxy-lase，PEPC)是植物细胞代谢中的一种重要羧化酶，在不同类型植物中执行着不同的功能。在C4和景天酸代谢(CAM)植物中，它起着捕获CO₂及作为CO₂泵以提高光合效率的功能，该酶介导不可逆的β羧化反应，将磷酸烯醇式丙酮酸转化成草酰乙酸和磷酸。而在C3植物中，该酶为Krebs循环补充四碳二羧酸水平而起着回补反应的功能。它在植物和细菌中广泛存在，在动物及丝状霉菌中缺乏此酶。在植物的叶绿体和细菌的可溶性分级沉淀中存在。因此，检测PEPC酶活性具有重要意义。

目前用于检测PEPC活性的方法主要是分光光度法，该方法利用PEPC在磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）、还原型辅酶Ⅰ（NADH）、H₂CO₃、Mg²⁺存在的条件下，可以生成苹果酸(Mal)及辅酶Ⅰ(NAD)，NADH减少的速度可在340nm处进行测定，并以25℃，pH8.0条件下，每mg蛋白在反应体系中每分钟消耗1μmol/L的NADH定义为一个酶活力单位。但是，这种方法存在灵敏度低，检测限较高，选择性差等问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种测定磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的电化学方法，该方法灵敏度高，检测限低，选择性和重复性好，可以快速、准确的检测PEPC酶活性，具体包括以下步骤 ：

（1）对碳浆印刷电极的工作电极进行活化，使工作电极表面产生羧基；

（2）将步骤（1）得到的碳浆印刷电极用ddH₂O冲洗后自然晾干，在工作电极上滴入PEPC抗体，4℃结合16h，用电极洗液和ddH₂O交替冲洗，室温晾干，再滴加牛血清蛋白封闭活性位点，用电极洗液和ddH₂O交替冲洗，即制得磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶电化学传感器；

（3）将植物总蛋白样品滴加到步骤（2）得到的电化学传感器上，使蛋白与抗体充分结合，之后用电极洗液和ddH₂O交替冲洗，以洗去非特异性结合的杂蛋白；

（4）将步骤（3）得到的电化学传感器在反应液中反应3min后，使用循环伏安法测定电流大小；

（5）将步骤（4）测得的电流值带入电流峰值与NADH浓度的线性关系式（y=0.0804x+0.8267）中，求得NADH的浓度，再依据酶活力单位的定义(25℃，pH8.0条件下，每mg蛋白在反应体系中每分钟消耗1μmol/L的NADH定义为一个酶活力单位)换算出酶活。

优选的，本发明步骤（1）中所述活化方法为：在碳浆印刷电极的工作电极表面滴加100μL的电解质溶液，用电化学工作站进行循环伏安扫描，使工作电极表面产生羧基；其中电解质溶液为浓度为10mmol/L的磷酸盐缓冲液，pH为7.2；循环伏安扫描的电压范围为-0.3-0.4V，扫速为500mV/s，共扫描10圈。

优选的，本发明步骤（2）中所述PEPC抗体的滴加量为5μl，浓度为25μg/mL；牛血清蛋白的滴加量为5μl，质量百分比浓度为1%。

优选的，本发明步骤（2）和步骤（3）中电极洗液为pH 7.2的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液中含0.1mmol/L NaCl和质量百分比浓度为1%的Tween 20。

优选的，本发明步骤（3）中加入的植物总蛋白样品中的蛋白的总量为15μg，蛋白与抗体的结合时间为室温下1小时。

优选的，本发明步骤（4）中所用反应液的成分及含量为：0.05mol/L Tris-HCl，0.01mol/L KHCO₃，0.01mol/L>4，0.005>

本发明所述碳浆印刷电极是以碳浆为工作电极，氯化银为参比电极，碳浆为对极的印刷电极。

本发明通过首先选用导电性良好的碳浆电极，采用透析法对PEPC抗体进行纯化，之后将其固定在碳浆工作电极上，由于该抗体与磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的特异性结合，该传感器能快速识别并捕获植物总蛋白中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；根据偶联法可快速实现对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的高灵敏度检测；该检测方法具有灵敏度高，检测限低，选择性好、重现性和稳定性好等优点，可用于磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的定量检测。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

（1）特异性强，本发明的反应体系中，缺乏其中任一成分都检测不出电流变化。

（2）灵敏度高，由于PEPC抗体与PEPC的特异性结合很强，从而使本发明具有较高的灵敏度。

（3）检测限低，在检测限的测试中，发现本发明能检测出较低的PEPC酶活。

（4）选择性好，植物总蛋白与PEPC抗体结合1h后，需要用电极洗液和ddH2O交替冲洗，此时植物总蛋白中的PEPC与固定在工作电极上的PEPC抗体发生特异性结合，杂蛋白及小分子物质即可被洗掉，本发明即呈现良好的选择性。

（5）重复性好，本发明选取了一个样品为例，做了4组重复，误差分析显示本发明具有较好的重复性。

附图说明

图1为本发明PEPC传感器制备及分析示意图。

图2为本发明的特异性检测示意图。

图3为电流峰值与NADH浓度的线性关系图。

图4 为3种不同的玉米叶片蛋白样品利用本发明测得的循环伏安曲线。

图5为以玉米叶片蛋白样品1为例，做了4次重复所得电流值比较。

图6为本发明的检测限测试图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。

实施例1

第一部分：特异性验证

（1）在碳浆印刷电极的工作电极表面滴加100μL的电解质溶液，用电化学工作站进行循环伏安扫描，使工作电极表面产生羧基；其中电解质溶液为浓度为10mmol/L的磷酸盐缓冲液，pH为7.2；循环伏安扫描的电压范围为-0.3-0.4V，扫速为500mV/s，共扫描10圈。

（2）将步骤（1）得到的碳浆印刷电极用ddH₂O冲洗后自然晾干，在工作电极上滴入5μl浓度为25μg/mL的>2O交替冲洗，室温晾干；滴入5μl质量百分比浓度为>2O交替冲洗，室温晾干。

（3）滴加15μg玉米叶片总蛋白样品到电化学传感器上，用电极洗液和ddH₂O交替冲洗，室温晾干；其中，玉米叶片总蛋白样品用抽提液（10%甘油，100mM>

（4）配制3种不同的反应液，第一种为完全反应液，即0.05mol/L Tris-HCl，0.01mol/L KHCO₃，0.01mol/L>4，0.005>

（5）将反应液置于30℃水浴温育10min，滴加100μl反应液覆盖住三电极及中间区域，反应3min后，使用循环伏安法（Cyclic Voltammetry， CV）测定电流大小。

结果如图2所示，1为完全反应液，2为PEP缺乏反应液，3为MDH缺乏反应液。在PEP缺乏反应液和MDH缺乏反应液中均检测不到电流的变化，说明本发明具有很强的特异性。

第二部分：电流峰值与NADH浓度的关系

（1）在碳浆印刷电极的工作电极表面滴加100μL的电解质溶液，用电化学工作站进行循环伏安扫描，使工作电极表面产生羧基；其中电解质溶液为浓度为10mmol/L的磷酸盐缓冲液，pH为7.2；循环伏安扫描的电压范围为-0.3-0.4V，扫速为500mV/s，共扫描10圈。

（2）将步骤（1）得到的碳浆印刷电极用ddH2O冲洗后自然晾干，滴入25U的 MDH，室温下结合2小时。

（3）将NADH浓度分别为30μmol/L、40μmol/L、50μmol/L、60μmol/L、70μmol/L、80μmol/L、90μmol/L、100μmol/L的含0.05mol/L Tris-HCl，0.01mol/L KHCO₃，0.01mol/LMgSO₄，0.1>

结果如图3所示，NADH浓度在30μmol/L至100μmol/L之间，电流峰值与NADH浓度呈现良好的线性关系:y=0.0804x+0.8267，求得NADH的浓度，再依据酶活力单位的定义(25℃，pH8.0条件下，每mg蛋白在反应体系中每分钟消耗1μmol/L的NADH定义为一个酶活力单位)换算出酶活。

第三部分：重复性和玉米叶片样品测定

（1）在碳浆印刷电极的工作电极表面滴加100μL的电解质溶液，用电化学工作站进行循环伏安扫描，使工作电极表面产生羧基；其中电解质溶液为浓度为10mmol/L的磷酸盐缓冲液，pH为7.2；循环伏安扫描的电压范围为-0.3-0.4V，扫速为500mV/s，共扫描10圈。

（2）将步骤（1）得到的碳浆印刷电极用ddH₂O冲洗后自然晾干，滴入5μl浓度为25μg/mL的>2O交替冲洗，室温晾干。滴入5μl>2O交替冲洗，室温晾干。

（3）滴加15μg玉米叶片总蛋白样品到电化学传感器上，用电极洗液和ddH₂O交替冲洗，室温晾干；其中玉米叶片总蛋白样品用抽提液（10%甘油，100mM>

（4）将反应液置于30℃水浴温育10min，滴加100μl反应液覆盖住三电极及中间区域，反应3min后，使用循环伏安法（Cyclic Voltammetry， CV）测定电流大小，结果如图4所示。通过电流峰值与NADH浓度的线性关系:y=0.0804x+0.8267，根据电流的大小求得NADH的浓度，再依据酶活力单位的定义（25℃，pH8.0条件下，每mg蛋白在反应体系中每分钟消耗1μmol/L的NADH定义为一个酶活力单位）换算出酶活。

（5）样品1做4个重复，结果如图5所示，说明本发明具有可靠的重复性。

为考察该方法的可靠性，所得结果与参考方法（反应体系为50 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，10 mmol/L>4，10>3，5>

表1 玉米叶片样品PEPC酶活测定

第四部分：检测限测定

（1）在碳浆印刷电极的工作电极表面滴加100μL的电解质溶液，用电化学工作站进行循环伏安扫描，使工作电极表面产生羧基；其中电解质溶液为浓度为10mmol/L的磷酸盐缓冲液，pH为7.2；循环伏安扫描的电压范围为-0.3-0.4V，扫速为500mV/s，共扫描10圈。

（2）将步骤（1）得到的碳浆印刷电极用ddH₂O冲洗后自然晾干，滴入5μl浓度为25μg/mL的>2O交替冲洗，室温晾干。滴入5μl>2O交替冲洗，室温晾干。

（3）分别滴加1μg，5μg，10μg，15μg，20μg玉米叶片总蛋白样品到电化学传感器上，用电极洗液和ddH₂O交替冲洗，室温晾干；其中，玉米叶片总蛋白样品用抽提液（10%甘油，100mM>

（4）将反应液置于30℃水浴温育10min，滴加100μl反应液覆盖住三电极及中间区域，反应3min后，使用循环伏安法（Cyclic Voltammetry， CV）测定电流大小。

结果如图6所示，在5μg到20μg之间，电流信号随总蛋白量增加而增加，1μg与5μg，15μg与20μg的电流差别不明显，因此判定本发明对玉米叶片总蛋白的最低检测限为5μg。