基于离子微凝胶的直接电子传递型葡萄糖电化学传感器的构筑及应用

摘要

本发明公开了一种基于离子微凝胶的直接电子传递型葡萄糖电化学传感器的构筑方法，是将带正电性的离子微凝胶与带负电性的氧化石墨烯通过静电引力进行组装，并采用简单的滴涂法将此混合基质修饰于玻碳电极表面，形成一层由凝胶微球构成的二维单层凝胶膜；再将葡萄糖氧化酶通过静电引力的物理方式固定于凝胶表面，组装堆积形成一种多通道的三维结构，促进电子的快速传递。本发明构筑的葡萄糖电化学传感器属于第三类直接电子传递型传感器，在检测过程中无需氧气及氧化还原性介质的参与，提高传感效率，可在较低电位下实现葡萄糖的检测，避免了高电位下一些干扰物质电化学氧化所产生的信号干扰，实现对葡萄糖的高效、灵敏、准确的检测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种直接电子传递型葡萄糖电化学传感器的构建，尤其涉及一种基于离子微凝胶的直接电子传递型葡萄糖电化学传感器的构筑及应用，属于葡萄糖信号分子检测技术领域。

背景技术

实现对葡萄糖高效率的电催化氧化在生物传感及能源转换方面具有重大意义，尤其在临床检测方面的应用尤为显著。而葡萄糖氧化酶作为促进葡萄糖氧化的生物活性催化剂，具有特异性强、灵敏度高、低毒无污等特性。据大量文献报道，基于葡萄糖氧化酶的生物传感器可大致分为三类，相比于第一、二类基于葡萄糖氧化酶的传感器，第三类直接电子传递型葡萄糖传感器可以巧妙地克服以上两类传感器中所存在的氧化电位高、溶解氧浓度不足以及介质毒害等缺陷，在无氧无介质的条件下即可实现葡萄糖的氧化，并将产生的电子迅速地传递到电极表面，实现对葡萄糖的高效检测，因此受到研究者们的广泛关注。

近年来，已有大量文献报道了基于直接电子传递的葡萄糖电化学传感器，各类无机纳米粒子、导电高分子聚合物以及各种各样的碳材料被广泛应用于构筑直接电子传递型葡萄糖传感器。然而，以上这些材料都不能很好地为葡萄糖氧化酶的固定提供一个适宜空间并保证其生物催化活性不被破坏。而且，一些无机纳米粒子还可能对生物体产生一些毒害现象，因此制备一种高效而安全的直接电子传递型葡萄糖传感器仍具有极大的挑战。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于离子微凝胶-氧化石墨烯的直接电子传递型葡萄糖电化学传感器的构筑方法。

本发明构筑直接电子传递型葡萄糖电化学传感器的方法，是将带正电性的离子微凝胶与带负电性的氧化石墨烯通过静电引力进行组装，并采用简单的滴涂法将此混合基质修饰于玻碳电极表面，形成一层由凝胶微球构成的二维单层凝胶膜；再将葡萄糖氧化酶通过静电引力的物理方式固定于二维单层凝胶膜表面，组装堆积形成一种多通道的三维结构，促进电子的快速传递，最后实现葡萄糖的高效检测。其具体构筑方法，包括以下工艺步骤：

（1）离子微凝胶的制备：在去离子水中，氮气氛围下，在交联剂、引发剂存在下，单体N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)和1-乙烯基咪唑(VIM)在60℃~70℃下聚合反应5~6小时；所得微凝胶悬浊液倒入分子量为14000的透析袋中透析5~7天，透析结束后冷冻干燥，即得离子微凝胶。

单体N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)和1-乙烯基咪唑(VIM)的摩尔比为1:0.19~1:0.38；

交联剂采用1,6-二溴己烷，交联剂的用量为单体总摩尔量的的0.10~0.13倍；

引发剂采用偶氮二异丁脒盐酸盐(AIBA)，引发剂的用量为单体总摩尔量的的0.02~0.04倍。

（2）离子微凝胶-氧化石墨烯在玻碳电极上的修饰：将氧化石墨烯与离子微凝胶超声分散于水中，得离子微凝胶-氧化石墨烯混合液；采用滴凃法将离子微凝胶-氧化石墨烯混合液滴凃于玻碳电极表面，自然晾干，得经修饰的玻碳电极。

离子微凝胶-氧化石墨烯混合液中，氧化石墨烯与离子微凝胶的质量比为1:1~1:2，二者的总含量为10~15mg/ml。

玻碳电极在修饰之前，以Al₂O₃为抛光剂，将玻碳电极在麂皮上进行打磨抛光，再用无水乙醇:超纯水=1:1（v:v）的混合液及超纯水依次超声清洗5min，氮气吹干。

（3）葡萄糖氧化酶的固定：将浓度为30~40mg/ml的葡萄糖氧化酶溶液滴加到经修饰的玻碳电极上，再滴加浓度为20~30mg/ml壳聚糖溶液进行固定，于0~4℃下自然干燥，然后用浓度为0.02M的磷酸缓冲溶液进行浸泡除杂，即得基于离子微凝胶的直接电子传递型葡萄糖电化学传感器。

葡萄糖氧化酶与壳聚糖的质量比为1:0.67~1:0.75。

图1为离子微凝胶-氧化石墨烯/葡萄糖氧化酶修饰的玻碳电极表面扫描电镜图；插图为放大后的离子微凝胶、氧化石墨烯、葡萄糖氧化酶三者在电极上组装后形成的微观结构图。由图1可知，离子微凝胶、氧化石墨烯及葡萄糖氧化酶三者之间通过静电引力进行自组装，形成一种三维的骨架结构。高度组装的微凝胶膜为葡萄糖氧化酶的固定及其生物催化活性的保存提供了居所及保障，同时，微凝胶多通道的三维骨架为电子在生物酶与电极之间的传递提供了良好的桥梁。

二、直接电子传递型葡萄糖电化学传感器的验证

采用循环伏安法在无氧条件分别对葡萄糖含量为0M、10mM的pH=7的浓度为0.2M的磷酸缓冲溶液进行测试，观察到在葡萄糖含量为0M时循环伏安曲线无氧化还原峰出现，而当葡萄糖含量为10mM时，循环伏安曲线在-0.488v和-0.501v出现一对明显的氧化还原峰（见图2），与文献报道的直接电子传递型葡萄糖电化学传感器完全相符，充分验证了本发明所构筑的电化学传感器为直接电子传递型葡萄糖电化学传感器，在检测过程中无需氧气及氧化还原性介质的参与，提高传感效率，可在较低电位下实现葡萄糖的检测，避免了高电位下一些干扰物质电化学氧化所产生的信号干扰，可以准确而迅速地实现葡萄糖的检测，灵敏度高，检测限低，为葡萄糖的检测提供良好的技术支持。

三、直接电子传递型葡萄糖电化学传感器的应用

1、检测条件与方法：电化学工作站初始电压为-0.47v的条件下，在浓度为0.2M，pH =7.0的磷酸缓冲液中进行测量。采用计时电流法，每30s向不断搅拌状态下的30ml磷酸缓冲液中加入0.1ml浓度为10mM的葡萄糖溶液，观察电流密度的变化，并将不同浓度下的电流密度进行线性拟合，确定传感效率。

2、结果判断：通过计时电流法中将不同葡萄糖浓度所对应的电流密度进行线性拟合所得到的曲线图（图3、4）可以得出：电流密度在葡萄糖浓度为0~0.54mM范围内呈现良好的线性关系，其线性回归方程为I(uA)=1.4897C-0.9896(R²=0.9955)，灵敏度为7.59>-1·cm^-2，检测限为：11.64>

综上所述，本发明采用具有三维多孔结构的离子微凝胶为葡萄糖氧化酶固定提供适宜空间；通过离子微凝胶与氧化石墨烯之间简单的自组装方式形成一种多通道的三维结构，促进电子的快速传递，最后实现对葡萄糖的高效、灵敏、准确的检测。

附图说明

图1为离子微凝胶-氧化石墨烯/葡萄糖氧化酶修饰的玻碳电极表面扫描电镜图；插图为放大后的离子微凝胶、氧化石墨烯、葡萄糖氧化酶三者在电极上组装后形成的微观结构图。

图2为离子微凝胶-氧化石墨烯/葡萄糖氧化酶修饰后的玻碳电极在无氧条件下，葡萄糖浓度分别为0mM(a)、10mM(b)的pH=7的浓度为0.2M的磷酸缓冲溶液进行的循环伏安测试曲线图。

图3为离子微凝胶-氧化石墨烯/葡萄糖氧化酶修饰后的玻碳电极在不断加入浓度为10mM葡萄糖溶液后所得的计时电流曲线图。

图4为不同葡萄糖浓度所对应的电流密度进行线性拟合所得到的线性回归曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例对于本发明葡萄糖电化学传感器的制备及应用也能够做进一步说明。

1、葡萄糖电化学传感器的制备

（1）离子微凝胶的制备：离子微凝胶是通过乳液聚合法进行制备的，将单体N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm) 0.2264g（2.0mmol）、1-乙烯基咪唑(VIM) 27ul（0.38mmol），溶于45ml去离子水中，加入46 ul（0.3mmol）1,6-二溴己烷为交联剂，在通氮除氧的条件下加入5ml浓度为5 mg/mL的引发剂偶氮二异丁脒盐酸盐(AIBA)溶液，加热至70℃反应6小时后倒入分子量为14000的透析袋中进行透析，7天后进行冷冻干燥，即得离子微凝胶。

（2）离子微凝胶-氧化石墨烯混合液的配置：将0.2ml浓度为5mg/ml的氧化石墨烯水分散液与0.1ml浓度为5mg/ml的离子微凝胶分散液进行超声混合，即得离子微凝胶-氧化石墨烯混合液。

（3）玻碳电极的修饰剂葡萄糖氧化酶的固定：吸取10ul的离子微凝胶-氧化石墨烯混合液，滴凃于打磨干净后的玻碳电极表面，自然晾干后滴加10ul浓度为40mg/ml的葡萄糖氧化酶溶液，随后滴加10ul浓度为30mg/ml壳聚糖溶液进行修饰固定，并将所得电极置于4℃冰箱中自然干燥。

2、葡萄糖电化学传感器的应用

电化学工作站初始电压为-0.47v的条件下，在浓度为0.2M，pH =7.0的磷酸缓冲液中进行测量。采用计时电流法，在不断搅拌状态下向30ml磷酸缓冲液中加入0.1ml的葡萄糖溶液，测定电流密度为-0.94uAuA，并通过线性回归方程I(uA)=1.4897C-0.9896，计算出葡萄糖溶液的浓度为0.033mM。