一种抵抗素多肽疫苗及其在治疗乳腺癌中的应用

摘要

本发明公开了一种抵抗素多肽疫苗及其在治疗乳腺癌中的应用，属于生物技术领域。本发明的多肽疫苗由Resistin蛋白特异多肽段与免疫佐剂组成，成为Resistin多肽疫苗。该疫苗通过多次皮下注射，可激活机体淋巴细胞，并产生针对Resistin蛋白的免疫中和抗体。Resistin多肽疫苗并不影响机体糖耐受与胰岛素耐受水平。Resistin多肽疫苗能显著抑制小鼠模型下ER阳性乳腺肿瘤和三阴性乳腺肿瘤的生长，另外，Resistin多肽疫苗能显著抑制高脂饮食诱导的肥胖模型下小鼠ER阳性乳腺肿瘤和三阴性乳腺肿瘤的生长。本发明为改进目前乳腺癌的治疗方法提供新的途径。

说明书

技术领域

本发明涉及一种抵抗素多肽疫苗及其在治疗乳腺癌中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

乳腺癌是困扰全球女性健康的重大问题，每年全世界约有140万人被诊断为乳腺癌，而大约有50万人死于该病，乳腺癌是40-55岁女性的第一位死亡原因。我国乳腺癌的年均增长速度为3％-4％，成为城市中死亡率增长最快的癌症，尤其以上海、北京、天津及沿海地区为我国乳腺癌的高发地区，已占女性恶性肿瘤发病率的首位。

饮食结构的不合理以及遗传因素等导致的肥胖与乳腺癌的发病密切相关。一方面，长期高脂肪饮食常常导致雌性激素水平异常升高，进而促进乳腺癌的发展。另一方面，过多的脂肪组织为肿瘤细胞的增殖与迁移提供能量，同时脂肪组织也为肿瘤细胞的转移和化学药物治疗提空庇护场所。

近来，越来越多的报道聚焦到脂肪组织分泌的脂肪因子促进乳腺癌起源，即乳腺癌干细胞的增殖以及乳腺癌细胞增殖和转移，例如Leptin、Adiponectin、白介素家族、Resistin等。

抵抗素蛋白(Resistin)在小鼠中由脂肪细胞产生并分泌，在人体中主要由脂肪细胞和单核巨噬细胞产生和分泌。Resistin被报道与肥胖和二型糖尿病密切相关，在临床上，血清中Resistin水平与乳腺癌病人恶性程度呈正相关，Resistin能促进体外培养乳腺癌细胞的迁移，同时体外实验证明，Resistin促进乳腺癌干细胞的增殖并促进乳腺癌的化疗抵抗。

基于此，体内阻遏Resistin的功能或有望有效地治疗乳腺癌，特别是肥胖模型下的乳腺癌治疗。但是，目前尚未有有效的靶向Resistin的治疗乳腺癌方案。

乳腺癌的临床上的治疗方案包括手术切除原发病灶，区域淋巴结清扫术，激素治疗以及放化疗等等。然而，乳腺癌的复发率和死亡率仍然很高，并且伴随着较高的代价并给与病人较大的痛苦和负担。

现有技术已经开发出基因疫苗用于治疗肿瘤相关疾病，即构建载体表达某种抗原的基因片段，利用该质粒直接免疫动物，抗原片段在宿主体内表达并刺激机体产生免疫应答抑制肿瘤细胞增殖、转移或直接杀伤肿瘤细胞。但是基因疫苗涉及到基因在具体组织或器官的摄取以及表达问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种抑制肿瘤，尤其是乳腺癌细胞生长的多肽疫苗。本发明直接将Resistin的特定肽段通过免疫学方法免疫小鼠，刺激小鼠机体产生免疫应答，刺激淋巴细胞分泌抗Resistin蛋白的免疫中和抗体，通过阻遏Resistin蛋白功能达到抑制肿瘤细胞生长的目的。本发明提供的Resistin的特定肽段可用于制备ER阳性和三阴性乳腺癌生长抑制剂。

本发明所述多肽疫苗，由Resistin蛋白特异多肽段与免疫佐剂组成，所述Resistin蛋白特异多肽段包括多肽序列EAIDKKIKQDF(鼠源Resistin全长序列从N端起第30-40位氨基酸)。

本发明所述多肽疫苗，通过皮下注射到小鼠体内，在小鼠体内经过抗原呈递细胞识别并处理后由T淋巴细胞使小鼠体内大量产生抗Resistin蛋白的免疫中和抗体。

另一方面，本发明的疫苗可用于制备抑制肿瘤生长药剂，尤其是针对乳腺癌及肥胖模型下乳腺肿瘤的治疗。小鼠在预先接种Resistin多肽疫苗后，能显著抑制E0771(C57BL/6背景小鼠；ER阳性乳腺癌)和4T1(BALB/c背景小鼠；三阴性乳腺癌)乳腺癌在原发部位的生长，更进一步，在高脂饮食诱导的肥胖模型下，Resistin多肽疫苗对于E0771和4T1乳腺癌在原发部位的生长抑制作用更加显著。

综上所述，本发明提供了一种皮下注射免疫的Resistin多肽疫苗，并检测其抑制乳腺癌生长的效果。该疫苗可刺激小鼠体内产生大量有功能的抗Resistin蛋白免疫中和抗体。而且，Resistin多肽疫苗在预先接种后，在不同背景小鼠下，能显著抑制ER阳性乳腺肿瘤和三阴性乳腺肿瘤的生长；同时，Resistin多肽疫苗并不影响机体糖耐受与胰岛素耐受水平，对于肥胖模型下的乳腺癌生长具有更加明显的效果。因此，上述免疫疗法可以为改进目前乳腺癌的治疗方法提供新的思路与途径。

附图说明

本发明附图中出现的N.S表示没有显著性，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

图1显示Resistin蛋白的单体结构(a)、三聚体(b)、六聚体结构图(c)以及Resistin的全长序列信息(d)。其中箭头所指以及红色标注(1#)为所选用于疫苗制备所需肽段。

图2显示:Resistin多肽疫苗的接种以及后续实验流程图。将雌性小鼠进行12周高脂饮食诱导肥胖，在第12、14、15、16、17、20、22周往每只小鼠腹部皮下注射5周标准鼠抗体制备佐剂(北京博奥龙免疫技术有限公司)与抗原肽段混合液(1:1，50μg)，对照小鼠每只注射5周标准鼠抗体制备佐剂与牛血清蛋白(BSA)混合液(1:1，50μg)。

图3显示注射完疫苗后，在第17周，通过Western Blot验证正常饮食和高脂饮食小鼠体内血清中产生的抗体对于分化成熟的3T3-L1脂肪细胞中Resistin的识别能力。阳性对照为商业用抗Resistin抗体(PEPROTECH公司)，阴性对照为正常饮食小鼠注射对照处理的血清。

图4显示ELISA验证正常饮食和高脂饮食小鼠血清中所产生抗体对于Resistin的识别和结合能力。阳性对照为商业用抗Resistin抗体(PEPROTECH公司)，阴性对照为鼠IgG。

图5将采集到的小鼠血清经过Protein G纯化。纯化后的抗体与成熟脂肪细胞上清液孵育提前孵育6h后，处理肿瘤细胞E0771。通过Western Blot检测下游信号通路的改变。

图6在第18周对C57BL/6正常饮食和高脂饮食小鼠对照组和给疫苗组进行葡萄糖耐受测试(GTT)。

图7在第19周对C57BL/6正常饮食和高脂饮食小鼠对照组和给疫苗组进行胰岛素耐受测试(ITT)。

图8显示C57BL/6正常与高脂饮食小鼠给予对照(BSA)处理或疫苗处理以及E0771细胞移植(第二乳腺脂肪垫注射5*10⁵细胞)流程图以及对应的小鼠体重变化。

图9 C57BL/6正常/肥胖小鼠在给予对照或疫苗条件下，小鼠肿瘤体积的测量图(a)与小鼠全身照典型图(b)。

图10将C57BL/6小鼠宰杀后，测量正常与肥胖条件下给予对照或疫苗条件下的小鼠乳腺肿瘤重量图(b)，与各个分组肿瘤大小的直观图(a)。

图11ELISA实验测定正常饮食和高脂饮食小鼠注射过疫苗后血清中抗Resistin免疫中和抗体浓度(以PEPROTECH公司生产的抗Resistin抗体作为阳性对照并以其浓度作为标准，计算血清中抗体浓度；以注射BSA的正常饮食小鼠血清作为阴性对照)。将测定所得小鼠血清中抗体浓度与小鼠乳腺瘤体重量做图分析，并计算出两者之间相关系数r值。

图12BALB/c正常/肥胖小鼠在给予对照或疫苗条件下，小鼠肿瘤体积的测量图。

图13将BALB/c小鼠宰杀后，测量正常与肥胖条件下给予对照或疫苗条件下的小鼠乳腺肿瘤重量图(b)，与各个分组肿瘤大小的直观图(a)。

图14ELISA实验测定正常饮食和高脂饮食小鼠注射过疫苗后血清中抗Resistin免疫中和抗体浓度(以PEPROTECH公司生产的抗Resistin抗体作为阳性对照并以其浓度作为标准，计算血清中抗体浓度；以注射BSA的正常饮食小鼠血清作为阴性对照)。将测定所得小鼠血清中抗体浓度与小鼠乳腺瘤体重量做相关图分析，并计算出两者之间相关系数r值。

具体实施方式

除非特别指明，以下实施例构建肥胖模型所用C57BL/6和BALB/c雌鼠从出生后第四周开始喂养高脂饲料12周直至肥胖，高脂饲料脂肪比例为60％。

除非特别指明，以下实施例中所用的试剂和材料均为分析纯级别的试剂，且可从正规渠道商购合成或购买，其中免疫小鼠所需多肽纯度为>＝95％。

本发明将对照组和注射疫苗组组进行统计学分析，P<0.05即表示组间差异具有统计学意义。

本发明检测经多肽疫苗免疫后，小鼠血液内抗Resistin中和抗体效果的方法，是通过Western Blot和ELISA检测产生的抗体对于抗原的识别和结合；通过免疫中和实验在体外检测所产生抗体对于Resistin功能的抑制作用。

实施例1 Resistin蛋白疫苗的制备和免疫中和抗体的检测

在小鼠体内，Resistin主要由成熟脂肪细胞分泌，且在体内主要以三聚体以及六聚体形式存在。首先，利用B细胞抗原表位预测分析软件分析Resistin蛋白序列具备较强免疫原性的区域，然后，利用蛋白三维结构分析软件分析预测所得抗原性较强的区域，根据蛋白质单体以及多聚体3D结构中所处的位置选取暴露在蛋白3D结构表面且抗原性较强的序列合成短肽并进行后续实验评估。

以1#多肽(N端α螺旋，序列EAIDKKIKQDF)做为抗原，同时在其C端通过半胱氨酸偶联BSA，方便抗原呈递，增强免疫。合成的抗原多肽用生理盐水溶解稀释成1mg/ml浓度。

Resistin多肽疫苗由5周标准鼠抗体制备佐剂(北京博奥龙免疫技术有限公司)与抗原混合液(体积比1:1)组成。

按照图2的实验方案，先将雌性小鼠(C57BL/6或BALB/c背景)进行正常饮食或高脂饮食饲养12周。在第12、14、15、16、17、20、22周往每只小鼠腹部皮下注射疫苗(100μL)，对照小鼠每只注射5周标准鼠抗体制备佐剂与牛血清蛋白(BSA)混合液(1:1，100μL)。

在第17周，通过眼眶静脉窦采血约100μL于ep管中，室温静置20分钟后，于4℃离心机3500转/分钟离心15分钟，吸取上清液(血清)。用一抗稀释液以1:500比例稀释小鼠血清，利用蛋白质免疫印迹实验，验证血清中产生的抗体对于3T3-L1脂肪细胞中Resistin蛋白的识别作用(以正常饮食小鼠注射对照处理的血清为阴性对照，以PEPROTECH公司生产的抗Resistin抗体为阳性对照)。实验结果显示注射完疫苗后的正常以及高脂饮食小鼠血清中都产生了Resistin抗体可以特异性的识别Resistin(图3)。

进一步，通过ELISA实验检测注射疫苗后的小鼠血清对于Resistin蛋白的识别与结合能力。如图4显示，在进行1:50、1:100、1:200、1:400的梯度稀释下，小鼠血清能较强地识别并结合自然状态下的Resistin蛋白(以正常饮食小鼠注射对照处理的血清为阴性对照，稀释比例同上；以PEPROTECH公司生产的抗Resistin抗体为阳性对照，稀释比例为1：200、1：400、1：800、1：1600)。

为了检测注射疫苗后，血清中抗体是否能阻遏Resistin蛋白的功能。将剩余血清约40μL-50μL用PBS依稀并用Protein G beads进行纯化，洗脱的，得到纯化后的抗体。将抗体按照1:50的比例与3T3-L1成熟脂肪细胞上清液(无血清)室温孵育6h，然后与37℃培养乳腺癌细胞E07711h。收细胞，进行Western blot。实验结果如图5显示，注射疫苗后的小鼠血清纯化所得抗体能显著阻遏细胞上清中Resistin对于肿瘤细胞内AKT和S6的磷酸化激活(已报道Resistin能促进AKT和S6磷酸化)，说明纯化后的抗体能阻遏Resistin的生物学功能。以正常饮食小鼠注射对照处理的血清纯化所得为阴性对照；以PEPROTECH公司生产的抗Resistin抗体为阳性对照，稀释比例为1：100。

实施例2 Resistin多肽疫苗有效抑制C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠正常饮食和高脂饮食诱导肥胖模型下的乳腺肿瘤生长

将正常饮食与饮食诱导肥胖小鼠进行5次疫苗皮下注射后。通过血糖试纸检测疫苗对小鼠血糖水平影响。分别检测小鼠糖耐受水平和胰岛素耐受水平，如图6和7所示，注射疫苗对于小鼠糖耐受或胰岛素耐受水平没有影响。同时，对小鼠整个实验流程中体重的变化记录显示，小鼠体重并不受到疫苗注射影响(图8)。

在进行过6次皮下注射疫苗后，在第21周往C57BL/6小鼠右侧第二乳腺脂肪垫注射E0771乳腺癌细胞5*10⁵个(ER阳性细胞系；细胞重悬于100μl>3)＝0.5*长径(cm)*短径(cm)²。从第六天起，连续8天每天在同一时间，测量肿瘤的长径与短径，并计算肿瘤的体积大小，并做图比较。如图9所示，Resistin多肽疫苗注射后，小鼠乳腺肿瘤生长明显受到抑制；另外，在肥胖组小鼠内，注射Resistin多肽疫苗注射后后，小鼠乳腺肿瘤体积减小更加明显。

更进一步，在测量第13天将小鼠宰杀，取出小鼠肿瘤组织称重，并拍照，如图10。实验结果显示，Resistin多肽疫苗注射后，小鼠乳腺肿瘤重量减轻；另外，在肥胖组小鼠内，注射Resistin多肽疫苗注射后后，小鼠乳腺肿瘤重量减小更加明显。

ELISA实验测定正常饮食组给予Resistin多肽疫苗注射后，小鼠乳腺肿瘤重量减轻；另外，对于肥胖组小鼠，注射Resistin多肽疫苗注射后，小鼠乳腺肿瘤重量减轻更加明显。进一步，测定正常饮食和高脂饮食小鼠注射过疫苗后血清中抗Resistin免疫中和抗体浓度，并将其与肿瘤重量对应起来，如图11，实验结果显示，无论是在正常饮食组还是在高脂饮食组，血清中Resistin抗体浓度与肿瘤重量呈反比(正常饮食中r＝0.69；高脂饮食中r＝0.80)，说明小鼠体内产生的免疫中和抗体对乳腺肿瘤的抑制作用。

为了验证在不同小鼠背景下，不同鼠源细胞系移植条件下，Resistin多肽疫苗是否具有同样作用。我们在BALB/c小鼠上进行同样的上述疫苗注射操作，而后，往右侧第二乳腺脂肪垫注射4T1乳腺癌细胞2*10⁶个(三阴性细胞系；细胞重悬于100μl>

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种抵抗素多肽疫苗及其在治疗乳腺癌中的应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 鼠

<400> 1

Glu Ala Ile Asp Lys Lys Ile Lys Gln Asp Phe

1 5 10