一种自主驯化的菌株Y1及其应用

摘要

本发明公开了一种自主驯化的菌株Y1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2018年2月1日，保藏编号为CCTCC M 2018078，其分类命名为解单端孢菌素微杆菌（

说明书

技术领域

本发明涉及矿渣中资源化及无害化处理技术领域，具体涉及一种自主驯化的菌株Y1，尤其涉及一种去除电解锰渣中As、Cd、Cr并回收氨氮、锰、镁、铁、硫酸根离子的方法。

背景技术

电解锰渣是指在电解金属锰生产过程中排放的酸浸废渣，其主要成分为二氧化硅、硫酸钙和氨氮，同时还存在部分有害金属元素和As元素。每生产1t金属锰将产生7～9t的锰渣，且随着锰矿石的品味逐渐下降，每年排放的渣量也在持续上升。当前一般采用筑坝露天堆存的方法处理电解锰渣，不仅占用宝贵的土地资源，且渣中重金属元素会随着雨水冲刷、风化作用进入周边水体、土壤中，危害环境。所以，若将其进行进一步的利用，渣中重金属和有害成分是影响其利用的关键性因素。

重金属、氨氮等成分在电解锰渣中伴随着其迁移性在自然界中的循环，不仅会造成资源的浪费更给自然造成巨大的污染。开发出一种新的、高效的、经济的能够去除重金属并回收有价值成分的处理技术，将具有重大的社会、环保和经济等意义。

目前处理电解锰渣中重金属的方法主包括：水泥固化处理、石灰碱性处理、塑性材料包容处理、熔融煅烧固化处理、自胶结固化处理和药剂稳定化处理等。而电解锰渣中氨氮的处理方法主要靠水洗回收。但这些方法都存在其固有的缺点与局限性，如在水泥固化中，废渣里存在的某些抑制盐会阻止其水化过程，造成固化体破裂，影响固定效果等。另外，当固化体在环境中破裂后，废物中的有毒物质会重新进入环境。而药剂稳定化中，化学药剂的成本和运行费用均较高，不利于大规模的应用。在水洗电解锰渣回收氨氮的过程需要大量的水做溶剂，造成资源的浪费。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明所要解决的技术问题是提供了一种自主驯化的菌株Y1。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种微生物菌剂。

本发明还要解决的技术问题是提供了自主驯化的菌株Y1或微生物菌剂在重金属去除和/或氨氮、锰、镁、铁、硫酸根离子回收中的应用。

本发明还要解决的技术问题是提供一种新的去除电解锰渣中As、Cd、Cr并回收氨氮、锰、镁、铁、硫酸根离子的方法，该方法处理成本低、操作条件简单，能够改性电解锰渣达到相应的国家使用标准；并回收其中的氨氮、锰、镁、铁、硫酸根离子。

发明目的：为实现上述技术目的，本发明采取如下的技术方案：一种自主驯化的菌株Y1，该自主驯化的菌株Y1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2018年2月1日，保藏编号为CCTCC M 2018078，其分类命名为：解单端孢菌素微杆菌(Microbacteriumtrichothecenolyticum)，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)。

本发明内容还包括一种微生物菌剂，包含所述的自主驯化的菌株Y1。

本发明所述菌株Y1为从电解锰渣渣场附近筛选并驯化保存命名为Y1，具体分离驯化步骤如下：将适量广西崇左地区电解锰渣样品置于无菌水试管中，充分震荡混匀得到混合液体，混匀后使用接菌环蘸取混合液体并于牛肉膏蛋白胨平板上划线培养(30℃，48h)，分离菌株。用接菌环从第一代平板挑取单菌落，在重新配置的牛肉膏蛋白胨平板上划线培养(30℃，48h)，进行纯化。同样方法再纯化2次，使最终平板上为同一形态菌落为止。挑取单菌落接菌于含有电解锰渣固体的液体LB培养基中30℃培养24h，并利用逐级培养法提高电解锰渣投加量驯化菌株得到菌株Y1。将驯化最后的含有菌株Y1的液体培养基菌悬液收集至灭菌离心管中，清洗离心2次，进行基因组DNA的提取，提取完毕后，利用通用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R：ACGGCTACCTTGTTACGACTT进行16S rDNA的PCR实验，完成PCR后将最终PCR产物进行测序，并将测序结果与GenBank中已登录的相关序列(NZ_BCWI01000036.1)进行比对，该菌株Y1的16S rDNA序列参见序列表中的SEQ ID NO：1所示，比对结果显示菌株Y1属于解单端孢菌素微杆菌。

本发明内容还包括上述的自主驯化的菌株Y1或所述的微生物菌剂在重金属去除和/或氨氮、锰、镁、铁回收中的应用。

本发明所述的重金属包括但不仅限于As、Cd、Cr中的一种或几种。

本发明内容还包括一种去除电解锰渣中As、Cd、Cr并回收氨氮、锰、镁、铁、硫酸根离子的方法，包括以下步骤：

1)将电解锰渣、废糖蜜水溶液按照1kg:1.5-2.0L的质量体积配比混匀，置于配有搅拌装置的容器中；调节体系的pH值至7.5-8.0得到混合液；

2)在混合液中再接种自主驯化的菌株Y1，接种量为3-10w％；并保持外部温度为15-37℃，搅拌周期为9-15天，搅拌速度为150-220rpm，补充废糖蜜水溶液使电解锰渣、废糖蜜水溶液的质量体积配比维持在1kg:1.5-2.0L；

4)7-15天后过滤使固液分离，将滤液的pH值调节至8.0-9.5沉淀回收六水硫酸铵镁、六水硫酸铵锰以及六水硫酸铵铁；滤渣无毒，可排放或进一步资源化利用。

其中，所述电解锰渣为菱锰矿(主要成分：MnCO₃)经硫酸酸浸处理后的弱酸性滤渣。

其中，所述废糖蜜为制糖产业的副产物，其中废糖蜜的总糖量一般为45％-67％，同时含有大量的有机、无机物质，配制成浓度为1.5-2.0g/L的废糖蜜水溶液。

经上述处理后，本发明能够有效地清洗出电解锰渣中As、Cd、Cr、Mn、Mg、Fe、NH₃-H和部分硫酸根离子，将滤液调节pH值至8.0-9.5可沉淀回收六水硫酸铵镁、六水硫酸铵锰以及六水硫酸铵铁。经本发明方法处理后的电解锰渣中As、Cd、Cr、Mn、Mg、Fe和NH₃-H的浸出率分别为95-99％、78-88％、96-99％、85-98％、65-85％、85-95％、95-99％。

与现有技术相比，本发明对电解锰渣的无害化及资源化处理方法具有如下优点和有益效果：

1、该方法处理结束，能够达到相应回用标准：电解锰渣经本发明方法处理后，种子发芽率可达95-98％，并能持续生长一个生命周期说明对植物无毒害和胁迫作用；电解锰渣中As、Cd、Cr、Mn、Mg、Fe、NH₃-H的含量低于《土壤环境质量标准》(GB>

2、有效地回收了电解锰渣中的Mn、Mg、Fe、NH₃-H和部分硫酸根离子：实验结果表明，经处理后，清洗液中可回收高纯度的六水硫酸铵镁、六水硫酸铵锰以及六水硫酸铵铁。

3、工业废弃物资源化利用：采用的是电解锰渣、废糖蜜，该方法有效地解决了以上物料的处理，有效实现了固体废弃物资源化利用。

附图说明

图1为本发明的去除电解锰渣中As、Cd、Cr并回收氨氮、锰、镁、铁的方法的工艺流程图；

图2为本发明细菌简单形貌(左图)和革兰氏染色结果图(右图)；由图2可以看出本发明细菌外形呈杆状，革兰氏染色显红；

图3为本发明回收的复盐晶胞结构图；基于XPS元素和XRD分析在Downs,R.T.andHall-Wallace,M.(2003)The American Mineralogist CrystalStructureDatabase.American Mineralogist 88,247-250.晶体学数据库中获得该结构图，该结构图说明经本发明处理后的电解锰渣清洗液可形成结构较为稳定的复盐；

图4为本发明回收的沉淀物复盐XRD表征图，与标准卡片对比我们做检测的结果晶相衍射峰尖锐，说明了我们回收的复盐其晶相较好、纯度高的六水硫酸铵镁、六水硫酸铵锰以及六水硫酸铵铁。

具体实施方式

下面申请人将结合具体的实施例对本发明产品的制备过程及应用过程做详细说明，便于本领域技术人员清楚地理解本发明。但应该理解，以下实施例不应以任何方式被解释为对本申请权利要求书请求保护范围的限制。

将适量广西崇左地区电解锰渣样品置于无菌水试管中，充分震荡混匀，混匀后使用接菌环蘸取混合液体并于牛肉膏蛋白胨平板上划线培养(30℃，48h)，分离菌株。用接菌环从第一代平板挑取单菌落，在新配置的牛肉膏蛋白胨平板上划线培养(30℃，48h)，进行纯化。同样方法再纯化2次，使最终平板上为同一形态菌落为止。挑取单菌落接菌于含有电解锰渣固体的液体LB培养基中30℃培养24h，并利用逐级培养法提高电解锰渣投加量驯化菌株得到菌株Y1。将驯化最后的含有菌株Y1的液体培养基菌悬液收集至灭菌离心管中，清洗离心2次，进行基因组DNA的提取，提取完毕后，利用通用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R：ACGGCTACCTTGTTACGACTT进行16S rDNA的PCR实验，完成PCR后将最终PCR产物进行测序，并将测序结果与GenBank中已登录的相关序列(NZ_BCWI01000036.1)进行比对，该菌株Y1的16S rDNA序列参见序列表中的SEQ ID NO：1所示，比对结果显示菌株Y1属于解单端孢菌素微杆菌。

菌株Y1的简单形貌和革兰氏染色结果图见图2。

以上筛选驯化菌株Y1以及以下实施例中的电解锰渣均为电解锰渣为菱锰矿(主要成分：MnCO₃)经硫酸酸浸处理后的弱酸性滤渣，自然风干后，研磨过10方孔筛备用。所述电解锰渣的主要成分含量如表1所示。

表1

成分SiO₂Al₂O₃CaOMgOFe₂O₃SO₃MnO含量(wt％)22.123.1013.171.759.1422.504.82成分NH₃-HFeCrZnCoCdAs含量(wt％)12.020.0470.0070.0200.0030.0030.004

采用《固体废物浸出毒性浸出方法》(GB5086.1-1997)测得As、Cd、Cr、Fe、Mg、Mn浸出量如表2所示，采用《土壤氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮的测定氯化钾溶液提取-分光光度法》(HJ 634-2012)测得氨氮浸出量为8058mg/L。

表2

废糖蜜的总糖量为：57wt％，其主要成分和主要性质如表3所示。

表3

本申请文件中如无特殊说明，所有％均为质量百分含量。

实施例1

如图1操作流程图所示：将物料按重量比体积，电解锰渣：废糖蜜水溶液(废糖蜜浓度为1.5g/L)＝1kg：1.5L，置于配有搅拌装置容器中；用氢氧化钠溶液调节体系的pH值为7.5；再接种由自主驯化的菌株Y1，接种量为5w％；并保持外部温度为15℃，搅拌周期为9天，搅拌速度为150rpm，期间视水分蒸发情况补充废糖蜜水溶液使电解锰渣、废糖蜜水溶液的质量体积配比维持在1kg：1.5L；9天后过滤使固液分离，所得滤渣的检测结果见表4，将滤液的pH值用氢氧化钠溶液调节至8.3可沉淀回收，将沉淀物作XRD物相及矿相分析可得沉淀物为复盐混合物六水硫酸铵镁、六水硫酸铵锰以及六水硫酸铵铁，结果见图4，滤液为菌株Y1作用后的浸出液；六水硫酸铵锰、六水硫酸铵镁的晶胞结构图见图3。

检测浸出液中有害成分(As、Cd、Cr、Mn、Mg、Fe、NH₃-H)，计算得出电解锰渣中As、Cd、Cr、Mn、Mg、Fe、NH₃-H浸出率：

式中η_浸为浸出率，M₀为电解锰渣中某有害成分的质量；M为浸出液中该有害成分的质量；其结果如表4所示。

表4

经处理后的滤渣无毒，其指标远低于《危险废物鉴别标准》(GB5085.1—2007)可直接排放或进一步资源化利用。

发芽率实验：将经本实施例处理后的电解锰渣填满边长为15cm的立方体容器各10份，其中5份在表面均匀播种高羊茅种子12颗；另外5份在表面均匀播种番茄种子6颗；保持充足的光照时间和水分，7天后计算发芽情况并计算发芽率：

式中GI为发芽率，X₀为供实验种子数，颗；X发芽种子数，颗；其结果如下：高羊茅种子发芽率：95％，番茄种子发芽率：95％。

实施例2

将物料按重量比体积，电解锰渣：废糖蜜水溶液(废糖蜜浓度为1.8g/L)＝1kg:1.9L，置于配有搅拌装置容器中；用氢氧化钠溶液调节体系的pH值为7.8；再接种由自主驯化的菌株Y1，接种量为9w％；并保持外部温度为31℃，搅拌周期为10天，搅拌速度为175rpm，期间视水分蒸发情况补充废糖蜜水溶液使电解锰渣、废糖蜜水溶液的质量体积配比维持在1kg:1.9L；10天后过滤使固液分离，将滤液的pH值用氢氧化钠溶液调节至8.5可沉淀回收，将沉淀物作XRD物相及矿相分析可得沉淀物为复盐混合物六水硫酸铵镁、六水硫酸铵锰以及六水硫酸铵铁；滤液为菌株Y1作用后的浸出液，六水硫酸铵锰、六水硫酸铵镁的晶胞结构图见图3。

检测浸出液中有害成分(As、Cd、Cr、Mn、Mg、Fe、NH₃-H)，计算得出电解锰渣中As、Cd、Cr、Mn、Mg、Fe、NH3-H浸出率：

式中η_浸为浸出率，M₀为电解锰渣中某有害成分的质量；M为浸出液中该有害成分的质量；其结果如表5所示。

表5

发芽率实验：将经本实施例处理后的电解锰渣填满边长为15cm的立方体容器各10份，其中5份在表面均匀播种高羊茅种子15颗；另外5份在表面均匀播种番茄种子8颗；保持充足的光照时间和水分，7天后计算发芽情况并计算发芽率：

式中GI为发芽率，X₀为供实验种子数，颗；X发芽种子数，颗；其结果如下：高羊茅种子发芽率：97％，番茄种子发芽率：96％。

实施例3

将物料按重量比体积，电解锰渣：废糖蜜水溶液(废糖蜜浓度为2.0g/L)＝1.0kg2.0L，置于配有搅拌装置容器中；用氢氧化钠溶液调节体系的pH值为8.0；再接种由自主驯化的菌株Y1，接种量为10w％；并保持外部温度为33℃，搅拌周期为15天，搅拌速度为220rpm，期间视水分蒸发情况补充废糖蜜水溶液使电解锰渣、废糖蜜水溶液的质量体积配比维持在1.0kg:2.0L；15天后过滤使固液分离，将滤液的pH值用氢氧化钠溶液调节至9.5可沉淀回收将沉淀物作XRD物相及矿相分析可得沉淀物为复盐混合物六水硫酸铵镁、六水硫酸铵锰以及六水硫酸铵铁滤液为菌株Y1作用后的浸出液，六水硫酸铵锰、六水硫酸铵镁的晶胞结构图见图3。

检测浸出液中有害成分(As、Cd、Cr、Mn、Mg、Fe、NH₃-H)，计算得出电解锰渣中As、Cd、Cr、Mn、Mg、Fe、NH3-H浸出率。

式中η_浸为浸出率，M₀为电解锰渣中某有害成分的质量；M为浸出液中该有害成分的质量；其结果如表6所示。

表6

发芽率实验：将经本实施例处理后的电解锰渣填满边长为15cm的立方体容器各10份，其中5份在表面均匀播种高羊茅种子20颗；另外5份在表面均匀播种番茄种子10颗；保持充足的光照时间和水分，7天后计算发芽情况并计算发芽率：

式中GI为发芽率，X₀为供实验种子数，颗；X发芽种子数，颗；其结果如下：高羊茅种子发芽率：98％，番茄种子发芽率：97％。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对发明进行了详细的描述，但本领域的技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中南民族大学

<120> 一种自主驯化的菌株Y1及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1389

<212> DNA

<213> 解单端孢菌素微杆菌(Microbacterium trichothecenolyticum)

<400> 1

agtgcgctgc tacctgcagt cgaacggtga agccgcgaac gggtgagtaa cacgtgagca 60

acctgcaagc ttgcttggtg gatcagtgcc tggactctgg gataagcgct ggaaacggcg 120

tctaatactg gatatgagcc tctatcgcat ggtgggggtt ggaaagattt tttggtctgg 180

gatgggctcg cggcctatca gcttgttggt gaggtaatgg ctcaccaagg cgtcgacggg 240

tagccggcct gagagggtga ccggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg 300

ggaggcagca gtgggggcct gatgcagcaa cgccgcgtga gggatgacgg ccttcgggtt 360

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taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg tagggcgcaa gcgttatccg gaattattgg 480

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ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag 1020

cgcaaccctc gttctatgtt gccagcacgt aatggtggga actcatggga tactgccggg 1080

gtcaactcgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg tcttgggctt 1140

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gtcaagtcat gaaagtcggt aacacctgaa gccggtggcc caacccttgt ggagggagcc 1380

gtcgaaagc 1389

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 通用引物27F(Artificial Sequence)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 通用引物1492R(Artificial Sequence)

<400> 3

acggctacct tgttacgact t 21