KLOTHO蛋白在制备诊断胃肠道间质瘤危险度的试剂中的用途

摘要

本申请涉及KLOTHO蛋白在评估胃肠道间质瘤危险度中的用途。具体地，本发明提供了一种KLOTHO蛋白在制备诊断胃肠道间质瘤危险度的试剂中的用途，所述的KLOTHO蛋白的氨基酸序列如SEQ NO.1所示。本发明具有如下技术效果：由于胃肠道间质瘤患者，其间质瘤的危险度分级越高，间质瘤组织中KLOTHO蛋白表达阳性率越高，通过检测个体间质瘤组织中KLOTHO蛋白及其相关组成成分的表达预测胃肠道间质瘤的危险度。

说明书

技术领域

本发明涉及医学、临床诊断领域。具体而言，涉及一种KLOTHO蛋白作为标记物在诊断胃肠道间质瘤危险度方面的用途。

背景技术

胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumor，GIST)是一类起源于胃肠道的间叶源性肿瘤，与传统意义上的恶性肿瘤与癌症不同，其生物学行为和临床表现复杂多样，跨度覆盖良性、低度恶性、中度恶性、高度恶性，因此GISTs患者的预后亦差异很大，良性GISTs可以终生无任何进展，而高度恶性GISTs生长极快，预后极差。对于GISTs危险度的判断，目前普遍采用的是美国国立卫生研究院(National Institutes of Health,NIH)危险度分级，即主要依据肿瘤大小、核分裂相以及肿瘤原发部位进行判断，缺乏分子指标。

Klotho是1997年发现与衰老相关的基因，位于人类染色体13q12，长度约为50kb，由5个外显子和4个内含子组成。Koltho基因的cDNA含有二段不同的片段，分别编码二种不同的蛋白：一为膜型，位于细胞膜上，其胞外区的蛋白序列与β-葡萄糖苷酶相似；二为分泌型，存在于血液循环中，被认为是一种肽类激素。Klotho基因在小鼠中的表达缺失导致其出现类似于人类衰老的各种表型，如动脉硬化、骨质疏松、肺气肿、寿命缩短、皮肤萎缩、不育症、运动失调等。近年来，越来越多的研究发现klotho基因在恶性肿瘤的发生发展过程中发挥类似“抑癌基因”的重要作用。

对现有技术的国内外文献和专利进行检索，至今未见任何klotho与胃肠道间质瘤之间相关性的研究报道，更无任何KLOTHO蛋白及其相关组成成分用于胃肠道间质瘤诊断和治疗的研究报道。根据我们的研究结果，GISTs患者的间质瘤组织中，KLOTHO蛋白表达阳性率与GISTs的危险度分级呈正相关，提示klotho基因可能参与促进GISTs从良性到恶性的转化。这一研究结果与现有的研究认为“klotho具有类似抑癌基因样作用”恰恰相反，提示klotho在GISTs中的功能有其特殊性。

发明内容

本发明的目的在于填补现有klotho基因应用的空白，也填补了胃肠道间质瘤的危险程度判断缺乏分子指标的空白，即一种KLOTHO蛋白或其可溶性蛋白片段在制备诊断胃肠道间质瘤危险度的试剂中的用途。

本发明旨在提供一种诊断胃肠道间质瘤危险度的方法，从而辅助胃肠道间质瘤的治疗。

鉴于本领域的上述要求，本发明的一些实施方式提供了确定受试者样本中klotho表达水平的试剂在制备诊断胃肠道间质瘤危险度的试剂中的用途。

在一些实施方式中，在蛋白水平确定klotho的表达水平。当在蛋白的表达水平确定为KLOTHO的表达水平时，可用的试剂是抗KLOTHO蛋白或其可溶性蛋白片段的抗体。多克隆抗体或单克隆抗体均可用于实施本公开的技术方案。在具体的实施方式中，利用免疫组化的原理，采用抗KLOTHO蛋白或其可溶性蛋白片段的抗体确定KLOTHO蛋白的表达水平。

在另一些实施方式中，在基因水平确定klotho的表达水平。当在基因水平确定为klotho的表达水平时，可用的试剂是探针或引物对。技术人员可根据klotho的核苷酸序列自行制备特异性的探针或引物对。

在一些实施方式中，受试者样本为胃肠间质瘤组织样本。胃肠间质瘤组织可以通过活检的方式获得，或者通过内镜切除的方式获得，或者通过外科手术的方式获得。

在一些实施方式中，胃肠道间质瘤危险度分级是指极低度(良性)、低度、中度、高度恶性。

附图说明

图1a为极低危险度GISTs中KLOTHO蛋白免疫组化染色结果(×10)；

图1b为极低危险度GISTs中KLOTHO蛋白免疫组化染色结果(×300)；

图2a为高危险度GISTs中KLOTHO蛋白免疫组化染色结果(×10)；

图2b为高危险度GISTs中KLOTHO蛋白免疫组化染色结果(×300)；

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明。需注意的是，以下实施例只用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

下列实施例中提到的KLOTHO蛋白均为氨基酸序列如SEQ NO.1所示的KLOTHO蛋白。

实施例1 GISTs组织中KLOTHO蛋白表达的临床意义

(一)临床病理样本

用于检测的GISTs样本是由90例GISTs组织组成的组织芯片，购置自上海芯超生物有限公司，货号HDgS-GIST090Loc-01，配套相关临床病理资料。

(二)实验方法

采用免疫组化S-P法，检测KLOTHO蛋白在由90例GISTs组织组成的组织芯片中的表达情况。步骤如下：

1.将组织芯片放入烘箱中，温度调至63度，烘蜡一小时。

2.配制试剂：

2.1 10*PBS缓冲液(配方：80g NaCl、2g KCl、15.35g Na2HPO4、2g KH2PO4，用纯水定容至1000毫升)：将10*PBS缓冲液稀释至1*PBS缓冲液，再在1*PBS缓冲液中加入占总体积0.05％的吐温试剂；

2.2抗原修复液

柠檬酸修复液：82毫升0.1mol/L的柠檬酸钠溶液+18毫升0.1mol/L的柠檬酸溶液+900毫升的纯水置于高压锅中；

EDTA修复液：PH＝9.0的50*EDTA抗原修复液(迈新)用纯水稀释50倍。

3.片子烘烤完成后，从烘箱内取出，放入全自动染色机中，进行脱蜡；

脱蜡过程：二甲苯两缸，每缸15分钟；

无水乙醇两缸，每缸7分钟；

90％酒精1缸，7分钟；

80％酒精1缸，7分钟；

70％酒精1缸，7分钟；

4.从染色机中取出片子，用纯水冲洗3次，一次3分钟。冲洗过程中将柠檬酸修复液放至电炉上开始加热；

5.抗原修复

柠檬酸高压修复：柠檬酸修复液沸腾后，将片子放入高压锅中，盖上高压锅盖，待出气后开始计时，5分钟。时间到后终止加热，将高压锅盖打开，使其自然冷却30分钟；

EDTA热修复：加热沸腾后放入片子，计时20分钟。

6.配制内源性过氧化物酶阻断剂。38.4ml无水甲醇+12ml 30％浓度的H2O2+9.6ml纯水；

7.将片子放入阻断剂中10分钟。

8.取出片子，用PBS缓冲液冲洗3次，一次5分钟；

9.冰箱中取出KLOTHO抗体[SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY,INC.Klotho(T-19:s-22218)]，放入离心机里7200转离心30秒；

10.取出抗体，按照稀释度用DAKO抗体稀释液稀释；

11.滴加抗体；

12.将湿盒放入冰箱，4℃过夜。

13.从冰箱里取出湿盒，静置1小时待其恢复到室温；

14.将片子用PBS缓冲液冲洗3次，一次5分钟；

15.滴加EnVision^TM+/HRP鼠工作液(来自DAKO公司)，30分钟；

16.时间到后用PBS冲洗3次，一次5分钟。

17.从冰箱里取出DAB试剂盒，按1ml DAB稀释液+1滴DAB色原进行配制；(来自DAKO液体DAB+底物系统)

18.在片子上滴加稀释后的DAB，显色5分钟，到时后自来水冲洗15分钟。

19.在片子上滴加苏木素2分钟，时间到后在0.25％的盐酸酒精中浸没2秒，用自来水冲洗2分钟；

20.将片子放入全自动染色机进行脱水，取出封片。

脱水过程：75％酒精1缸，3分钟；

85％酒精1缸，3分钟；

95％酒精1缸，3分钟；

无水乙醇两缸，每缸5分钟；

二甲苯两缸，每缸5分钟。

(三)结果判断标准：

根据染色强度与阳性细胞数综合计分，分析KLOTHO蛋白的表达情况。

首先，对阳性细胞数进行评分，方法为：阳性细胞数≤25％为1分，25％<阳性细胞数≤50％为2分，50％<阳性细胞数≤75％为3分，75％<阳性细胞数≤100％为4分。

进一步将染色强度与评分后的阳性细胞数相乘即为总的分数。分数≤4记为KLOTHO蛋白表达阴性，分数>4记为KLOTHO蛋白表达阳性。

(四)统计分析

结合临床病理资料，利用统计学软件SPSS 17.0对GISTs组织中KLOTHO蛋白表达情况进行统计分析，统计学显著性差异定义为P＜0.05。

其中根据《中国胃肠间质瘤专家共识2015版》，依据肿瘤大小、核分裂相数以及肿瘤原发部位对进行GISTs的危险度进行判断。

(五)结果

结果如图1a、图1b、图2a、图2b、表1所示，结果表明KLOTHO蛋白表达阳性率与患者年龄(P＝0.008)、GISTs大小(P＝0.011)、GISTs的有丝分裂数(P＝0.001)呈正相关；KLOTHO蛋白在低危险度GISTs中低表达、在高危险度GISTs中高表达(P＝0.001)。为避免衰老对KLOTHO表达的影响，进一步对年龄进行分层分析(如表2所示)，在≥60岁的老龄人群中，KLOTHO的表达同样与GISTs的危险度分级正相关，这一结果表明通过检测GISTs组织中KLOTHO蛋白及其相关组成成分的表达情况，能够预测胃肠道间质瘤的危险度，从而能够为患者治疗措施的选择提供有效的分子依据，临床应用前景良好。

本研究首次报道了KLOTHO的表达与GISTs的危险性正相关。这一结果提示klotho基因可能参与促进GISTs从良性到恶性的转化，与以往“klotho在恶性肿瘤或癌症中发挥抑癌基因样作用”的研究结论相反，表明klotho在GISTs中的功能有其特殊性，对后续临床与基础研究的开展具有重要的指导意义。

表1 KLOTHO蛋白表达与GISTs临床病理特征的关系

表2 根据年龄分层分析KLOTHO蛋白表达与GISTs危险度间的关系

序列表

<110>黄曙

<120>KLOTHO蛋白在制备诊断胃肠道间质瘤危险度的试剂中的用途

<160>1

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>1012

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

Met Pro Ala Ser Ala Pro Pro Arg Arg Pro Arg Pro Pro Pro Pro Ser

1 5 1015

Leu Ser Leu Leu Leu Val Leu Leu Gly Leu Gly Gly Arg Arg Leu Arg

202530

Ala Glu Pro Gly Asp Gly Ala Gln Thr Trp Ala Arg Val Ser Arg Pro

354045

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Leu Phe Gln Gly Thr Phe Pro Asp Gly

505560

Phe Leu Trp Ala Val Gly Ser Ala Ala Tyr Gln Thr Glu Gly Gly Trp

65707580

Gln Gln His Gly Lys Gly Ala Ser Ile Trp Asp Thr Phe Thr His His

859095

Pro Leu Ala Pro Pro Gly Asp Ser Arg Asn Ala Ser Leu Pro Leu Gly

100 105 110

Ala Pro Ser Pro Leu Gln Pro Ala Thr Gly Asp Val Ala Ser Asp Ser

115 120 125

Tyr Asn Asn Val Phe Arg Asp Thr Glu Ala Leu Arg Glu Leu Gly Val

130 135 140

Thr His Tyr Arg Phe Ser Ile Ser Trp Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly

145 150 155 160

Ser Ala Gly Val Pro Asn Arg Glu Gly Leu Arg Tyr Tyr Arg Arg Leu

165 170 175

Leu Glu Arg Leu Arg Glu Leu Gly Val Gln Pro Val Val Thr Leu Tyr

180 185 190

His Trp Asp Leu Pro Gln Arg Leu Gln Asp Ala Tyr Gly Gly Trp Ala

195 200 205

Asn Arg Ala Leu Ala Asp His Phe Arg Asp Tyr Ala Glu Leu Cys Phe

210 215 220

Arg His Phe Gly Gly Gln Val Lys Tyr Trp Ile Thr Ile Asp Asn Pro

225 230 235 240

Tyr Val Val Ala Trp His Gly Tyr Ala Thr Gly Arg Leu Ala Pro Gly

245 250 255

Ile Arg Gly Ser Pro Arg Leu Gly Tyr Leu Val Ala His Asn Leu Leu

260 265 270

Leu Ala His Ala Lys Val Trp His Leu Tyr Asn Thr Ser Phe Arg Pro

275 280 285

Thr Gln Gly Gly Gln Val Ser Ile Ala Leu Ser Ser His Trp Ile Asn

290 295 300

Pro Arg Arg Met Thr Asp His Ser Ile Lys Glu Cys Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Asp Phe Val Leu Gly Trp Phe Ala Lys Pro Val Phe Ile Asp Gly Asp

325 330 335

Tyr Pro Glu Ser Met Lys Asn Asn Leu Ser Ser Ile Leu Pro Asp Phe

340 345 350

Thr Glu Ser Glu Lys Lys Phe Ile Lys Gly Thr Ala Asp Phe Phe Ala

355 360 365

Leu Cys Phe Gly Pro Thr Leu Ser Phe Gln Leu Leu Asp Pro His Met

370 375 380

Lys Phe Arg Gln Leu Glu Ser Pro Asn Leu Arg Gln Leu Leu Ser Trp

385 390 395 400

Ile Asp Leu Glu Phe Asn His Pro Gln Ile Phe Ile Val Glu Asn Gly

405 410 415

Trp Phe Val Ser Gly Thr Thr Lys Arg Asp Asp Ala Lys Tyr Met Tyr

420 425 430

Tyr Leu Lys Lys Phe Ile Met Glu Thr Leu Lys Ala Ile Lys Leu Asp

435 440 445

Gly Val Asp Val Ile Gly Tyr Thr Ala Trp Ser Leu Met Asp Gly Phe

450 455 460

Glu Trp His Arg Gly Tyr Ser Ile Arg Arg Gly Leu Phe Tyr Val Asp

465 470 475 480

Phe Leu Ser Gln Asp Lys Met Leu Leu Pro Lys Ser Ser Ala Leu Phe

485 490 495

Tyr Gln Lys Leu Ile Glu Lys Asn Gly Phe Pro Pro Leu Pro Glu Asn

500 505 510

Gln Pro Leu Glu Gly Thr Phe Pro Cys Asp Phe Ala Trp Gly Val Val

515 520 525

Asp Asn Tyr Ile Gln Val Asp Thr Thr Leu Ser Gln Phe Thr Asp Leu

530 535 540

Asn Val Tyr Leu Trp Asp Val His His Ser Lys Arg Leu Ile Lys Val

545 550 555 560

Asp Gly Val Val Thr Lys Lys Arg Lys Ser Tyr Cys Val Asp Phe Ala

565 570 575

Ala Ile Gln Pro Gln Ile Ala Leu Leu Gln Glu Met His Val Thr His

580 585 590

Phe Arg Phe Ser Leu Asp Trp Ala Leu Ile Leu Pro Leu Gly Asn Gln

595 600 605

Ser Gln Val Asn His Thr Ile Leu Gln Tyr Tyr Arg Cys Met Ala Ser

610 615 620

Glu Leu Val Arg Val Asn Ile Thr Pro Val Val Ala Leu Trp Gln Pro

625 630 635 640

Met Ala Pro Asn Gln Gly Leu Pro Arg Leu Leu Ala Arg Gln Gly Ala

645 650 655

Trp Glu Asn Pro Tyr Thr Ala Leu Ala Phe Ala Glu Tyr Ala Arg Leu

660 665 670

Cys Phe Gln Glu Leu Gly His His Val Lys Leu Trp Ile Thr Met Asn

675 680 685

Glu Pro Tyr Thr Arg Asn Met Thr Tyr Ser Ala Gly His Asn Leu Leu

690 695 700

Lys Ala His Ala Leu Ala Trp His Val Tyr Asn Glu Lys Phe Arg His

705 710 715 720

Ala Gln Asn Gly Lys Ile Ser Ile Ala Leu Gln Ala Asp Trp Ile Glu

725 730 735

Pro Ala Cys Pro Phe Ser Gln Lys Asp Lys Glu Val Ala Glu Arg Val

740 745 750

Leu Glu Phe Asp Ile Gly Trp Leu Ala Glu Pro Ile Phe Gly Ser Gly

755 760 765

Asp Tyr Pro Trp Val Met Arg Asp Trp Leu Asn Gln Arg Asn Asn Phe

770 775 780

Leu Leu Pro Tyr Phe Thr Glu Asp Glu Lys Lys Leu Ile Gln Gly Thr

785 790 795 800

Phe Asp Phe Leu Ala Leu Ser His Tyr Thr Thr Ile Leu Val Asp Ser

805 810 815

Glu Lys Glu Asp Pro Ile Lys Tyr Asn Asp Tyr Leu Glu Val Gln Glu

820 825 830

Met Thr Asp Ile Thr Trp Leu Asn Ser Pro Ser Gln Val Ala Val Val

835 840 845

Pro Trp Gly Leu Arg Lys Val Leu Asn Trp Leu Lys Phe Lys Tyr Gly

850 855 860

Asp Leu Pro Met Tyr Ile Ile Ser Asn Gly Ile Asp Asp Gly Leu His

865 870 875 880

Ala Glu Asp Asp Gln Leu Arg Val Tyr Tyr Met Gln Asn Tyr Ile Asn

885 890 895

Glu Ala Leu Lys Ala His Ile Leu Asp Gly Ile Asn Leu Cys Gly Tyr

900 905 910

Phe Ala Tyr Ser Phe Asn Asp Arg Thr Ala Pro Arg Phe Gly Leu Tyr

915 920 925

Arg Tyr Ala Ala Asp Gln Phe Glu Pro Lys Ala Ser Met Lys His Tyr

930 935 940

Arg Lys Ile Ile Asp Ser Asn Gly Phe Pro Gly Pro Glu Thr Leu Glu

945 950 955 960

Arg Phe Cys Pro Glu Glu Phe Thr Val Cys Thr Glu Cys Ser Phe Phe

965 970 975

His Thr Arg Lys Ser Leu Leu Ala Phe Ile Ala Phe Leu Phe Phe Ala

980 985 990

Ser Ile Ile Ser Leu Ser Leu IlePhe Tyr Tyr Ser LysLys Gly Arg

995 1000 1005

Arg SerTyr Lys

1010