一种适用于低温环境的解钾菌株及基于该菌株制备微生态制剂的发酵方法

摘要

本发明公开了一种适用于低温环境的解钾菌株及基于该菌株制备微生态制剂的发酵方法，该菌株鉴定为芽孢杆菌，菌株号为BX，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.14769。该菌株能够有效分解钾长石、磷灰石等不溶性无机矿物质，增加作物土壤中速效养分的含量，促进作物生长发育，且该菌在低温环境下也具有较强解钾作用，能够用于高海拔及北方寒冷地区的土质改良，在制备生物有机肥及土壤改良剂等方面有良好的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种适用于低温环境的解钾菌株及基于该菌株制备微生态制剂的发酵方法。

背景技术

钾是农作物必须的三种基本营养元素之一，可促进作物生长发育，增进作物的抗病、抗逆性等。因而，钾元素被大量加工成钾肥应用于农业。土壤是一个天然的钾库，含钾量非常丰富，但95％以上的钾以缓效态形式存在于钾长石或云母等硅酸盐矿物中，不能被作物直接吸收利用，这就导致了土壤既富钾又缺钾的现象。

一方面，由于我国便于利用的钾资源匮乏，且分布极不均匀，从而严重制约钾肥的生产和使用，每年施用的钾肥中有90％以上依赖进口。据土壤普查资料显示，全国约有70％的耕地缺钾，其中45％的耕地严重缺钾，而我国肥料中氮、磷、钾的比例为1：0.4：0.16，远小于发达国家的1：0.5：0.4，这些已成为限制农作物产量提高和品质改善的重要因素。目前普遍使用的化学钾肥不但成本高，利用率低而且对生态环境造成一定的破坏，并影响农产品的品质。因此，开发成本较低，环境友好型的硅酸盐细菌肥料，对改善土壤微域环境和发展绿色、生态农业具有重大理论和实际意义。

另一方面，我国以钾长石为主的难溶性硅铝酸钾资源却十分丰富，分布广泛，在黑龙江、辽宁、河北、河南、江苏、安徽、湖北、陕西、四川、云南、广东、广西等省均有矿藏，总储量近100亿吨。因此，有效开发钾长石资源，从中提取钾制造钾肥将是解决我国可溶性钾资源紧缺现状的重要途径。到目前为止，研究人员围绕不溶性钾矿资源制取钾肥的开发利用已提出了多种方法，概括起来分为高温法和湿法两大类，这些方法因存在能耗高，配料量大，生产成本高，环境污染严重等缺点，一直未能实现大规模工业化生产。

利用微生物法从钾长石中提取钾具有能耗低、成本少、无污染、条件温和和方法简单等优势，被公认为最具前途的钾长石提钾方法。硅酸盐细菌又称为钾细菌，能够分解钾长石、云母等铝硅酸盐类矿物，从中释放出可溶性钾，可供植物吸收利用。此外其代谢产物如激素类物质、多糖、有机酸等可以抑制病原菌生长，改善土壤微域环境，从而有利于农作物的营养吸收，增强作物抗病能力，提高作物产量和改善作物品质。因此，筛选解钾活性较高的硅酸盐细菌，研究其解钾性能，可以为硅酸盐细菌肥料的制备提供一定的理论和物质基础。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种适用于低温环境的解钾菌株及基于该菌株制备微生态制剂的发酵方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案如下：

所述能够适应低温环境的高效解钾菌株已在2017年9月28日保藏于中国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.14769，命名为Bacillus BX菌株，属于芽孢杆菌。

其中，所述解钾菌株适合生长温度为18—37℃，适合解钾温度为20— 37℃。

优选地，所述解钾菌株最适生长温度为35—37℃，最适解钾温度28— 30℃。

所述解钾菌株的菌落表面粗糙不透明，菌落颜色污白色或微黄色；革兰氏阳性菌；能够利用葡萄糖、淀粉、蔗糖、麦芽糖、乳糖、葡甘聚糖、半乳糖；能分解葡萄糖产生丙酮酸，分解色氨酸形成吲哚，能水解淀粉，具有卵磷脂酶水解能力。

所述解钾菌株与作物无共生特点，对作物及作物环境无害。通过降解土壤不溶性的硅铝酸盐无机矿物质从而提高土壤中植物可利用的钾的含量。

基于上述解钾菌株制备微生态菌剂的固体发酵方法包括如下步骤：

(1)挑取解钾菌BX接种到LB液体培养基中，于37℃下震荡培养，培养至菌液OD₆₀₀＝0.5，得解钾菌培养液；

(2)将解钾菌培养液转入发酵罐中，于37℃下通风培养20—28h，优选为24h，得到菌株液体种子；

(3)将菌株种子液接种到已高温灭菌的固体麦麸中，菌株种子液与固体麦麸的质量比为8—12％，优选为10％，于25—37℃下培养24—48h，至活菌数达到 4.0×10¹⁰cfu/g，得达到活菌数要求的菌剂；

(4)将菌剂干燥至含水量≤5％，即得解钾菌微生态菌剂；优选50℃条件下干燥。

基于上述解钾菌株制备微生态制剂的液体发酵方法是将解钾菌株接种至液体培养基，于37℃、转速180rpm条件下发酵培养20—28h，优选为24h，得用于土壤解钾的发酵液，即为解钾菌微生态菌剂；或者，将发酵液进行干燥后得用于土壤解钾的干燥物，即为解钾菌微生态菌剂；所述液体培养基由如下重量份的组分组成：葡萄糖8—12，MgSO₄·7H₂O>2HPO₄>3>2>

优选地，所述液体培养基由如下重量份的组分组成：葡萄糖10， MgSO₄·7H₂O>2HPO₄>3>2>

上述解钾菌株可用于制备生物发酵有机肥，还可以用于制备土壤调理剂、改良剂或松土剂。在应用时，可将高效解钾菌制备成颗粒剂、粉剂、溶液、悬浮液或棒剂，可与有机肥混合使用，也可以单独使用，改善根际微生物环境。

本发明所述解钾菌BX筛选自西藏河谷青稞种植地区的土壤中，将土样适当稀释后涂布于筛选培养基中，分离出具有高活力解钾能力的菌落，接入试管斜面，获得若干解钾菌；摇瓶液体发酵进行复筛，测定解钾活力，获得解钾活力最高的菌株BX；解钾活力的测定主要通过测定发酵前后培养液中K⁺浓度差异来进行评价，解钾细菌BX接种于100mL液体培养基中，37℃，pH>2O₂，沸水浴中消化>+浓度并计算出菌株对钾长石矿粉的分解率。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1.本发明提供的菌株Bacillus BX及其发酵培养制备得到解钾菌剂能够有效分解钾长石、磷灰石等不溶性的硅铝酸盐无机矿物质，促进难溶性的钾、磷、硅、镁等养分元素转化成可溶性养分，增加土壤中速效养分的含量，促进作物生长发育，提高产量。对充分发挥土壤生态肥力、保持农业生态环境的平衡等均具有极其重要意义和应用价值。

2.本发明提供的解钾菌剂不存在生产过程中向环境排放污染物，是一种环保型肥料；且本发明提供的解钾菌剂的制备方法，生产工艺简单，生产效率高，能实现工业化大生产，具有良好的经济效应和社会效应。

具体实施方式

实施例1解钾菌的筛选与分离

从西藏自治区钾长石矿区采集土壤样品数份，保存于无菌塑料袋，空运寄回后立即分离。在无菌操作下，称取1.0g土样溶于9ml无菌生理盐水中，加上玻璃珠，28℃摇床180rpm充分振荡30min后，梯度稀释，涂布于已制好的分离培养基平板上。倒放于28—30℃恒温箱中培养2—3天，用接种针挑起边缘整起、湿润、粘稠、无色透明且富有弹性的菌落，进一步分离、纯化。纯化后的菌株转接到以钾长石为唯一钾源的筛选培养基平板，28℃培养4d，挑取生长良好的、大型光滑、圆形、透明、表面湿润黏稠、富有弹性的菌落进行斜面保存。

初筛菌株接于解钾测定培养基中，用四苯硼钠(1％四苯硼钠+2％氢氧化钾) 覆盖平板，并加入0.04％的溴酚蓝显色，菌落周围变亮蓝色的菌株作为目的菌株。

上述培养基配方如下，分离培养基：葡萄糖10.0g，KH₂PO₄>4·7H₂O0.2g，NaCl>3>4·7H₂O>2HPO₄>3>2>

生长培养基：葡萄糖10.0g，MgSO₄·7H₂O>3>4)₂SO₄>2HPO₄>

实施例2菌株解钾能力的测定

将筛选获得的菌株接种于100mL生长培养基中，以2％接种量接种于解钾测定培养基，对照组接入等量灭活菌液，于28℃，160rpm振荡培养5d。取菌株培养液10ml，加入6％H₂O₂2ml，在沸水浴中消化1h，将上述消化液在>+浓度，计算菌株对钾长石矿粉的分解率。

解钾率计算公式如下：

在筛选获得的菌株中，BX菌株的解钾能力为最高，其发酵液中K⁺浓度是对照组的3.16倍。

实施例3解钾菌BX的鉴定

测定菌株BX在唯一碳源或唯一氮源培养基的生长情况，观察菌落形态，获取解钾菌BX的形态特征。菌株BX在固体培养基上的菌落为淡黄色、圆形，表面粗糙不透明，直径约5mm，中部突起。显微镜下观察，该菌为短杆状，革兰氏染色阴性。能够利用葡萄糖、淀粉、蔗糖、麦芽糖、乳糖、葡甘聚糖、半乳糖；能分解葡萄糖产生丙酮酸，分解色氨酸形成吲哚，能水解淀粉，具有卵磷脂酶水解能力。裂解法提取菌株BX的总DNA，扩增出16s rDNA进行细菌分子鉴定，扩增产物经上海迈浦生物科技有限公司测序，并与GenBank数同源性比对，确定为Bacillus sp.。

实施例4解钾菌Bacillus BX固体发酵生产微生态制剂

挑取解钾菌BX接种到100mL LB液体培养基中，于37℃下震荡培养，培养至菌液OD₆₀₀＝0.5。然后将上述解钾菌培养液转入10mL发酵罐，于37℃下通风培养24小时，得到菌株液体种子。然后将液体种子接种到已高温灭菌的>10cfu/g。将达到活菌数要求的菌剂在50℃下干燥至含水量≤5％，即可得到解钾菌剂。

实施例5解钾菌Bacillus BX液体发酵生产微生态制剂

液体培养基配方为葡萄糖10.0g，MgSO₄·7H₂O>2HPO₄>3>2>