一种草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗及其制备方法和应用，属于基因工程及分子免疫学技术领域。本发明的技术方案要点为：一种草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗，该亚单位疫苗蛋白的基因序列如序列表SEQ ID No.1所示。本发明还具体公开了该草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗的制备方法及其作为抗草鱼呼肠孤病毒感染疫苗用于提高草鱼感染草鱼呼肠孤病毒后鱼体的存活率。本发明中草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗为新型抗原蛋白疫苗，其制备方法简单，成分明确，安全稳定，能够诱导草鱼鱼体产生较高的非特异性和特异性免疫应答，进而获得较好的免疫保护效果。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程及分子免疫学技术领域，具体涉及一种草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

我国水产养殖以淡水鱼类为主，其中草鱼（Ctenopharyngodon>）养殖是淡水养殖中重要的组成部分，也是国内养殖量最大的鱼类。草鱼由于饲料来源广、生长速度快及经济价值高而广受养殖人员的喜爱，养殖范围广且规模大。但草鱼抗病能力差，各个阶段都易受到病害感染，常见疾病有草鱼肠炎病、赤皮病、烂鳃病和病毒性出血病，其中由草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）引起的草鱼出血病是草鱼养殖中较为严重的传染病之一，对我国淡水养殖造成巨大的经济损失。

目前市场上草鱼呼肠孤病毒的灭活疫苗和减毒活疫苗正逐步推广使用，而草鱼呼肠孤病毒亚单位疫苗仍没有应用，并且病毒疫苗主要针对的是I型草鱼呼肠孤病毒，当前在国内流行最广、毒力较强的是II型草鱼呼肠孤病毒。现有的传统疫苗不能满足草鱼养殖业的发展，所以寻找一种安全、稳定、成分明确的草鱼呼肠孤病毒亚单位疫苗具有非常广阔的发展前景和应用价值，对草鱼养殖业的经济发展、养殖环境的改善以及我国提出绿色可持续养殖理念具有重要意义。

当前草鱼呼肠孤病毒亚单位疫苗的研究现状主要围绕草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP4-VP7研制，已经申报了一些专利，例如申请号为201110189906.9的专利公开了一种草鱼呼肠孤病毒基因工程疫苗的制备方法，采用sf9昆虫细胞增殖重组GCRV外衣壳蛋白VP5和VP7的重组杆状病毒（vAcGCRV-VP5/VP7）制备疫苗与应用；又如申请号为201310513653.5的专利公开了一种草鱼呼肠孤病毒II型S10基因编码的重组蛋白、由其制备的多克隆抗体及应用。但以上疫苗主要针对I型草鱼呼肠孤病毒，近年来随不同地区病毒分离鉴定， 越来越多的II型草鱼呼肠孤病毒强毒力株，如GCRV HZ08、GCRV-GD108、GCReV109等不断被发现，而目前针对II型草鱼呼肠孤病毒的疫苗种类数量极少，已不能满足生产实际需要。

为了适应生态渔业生产需求，以促进草鱼养殖业可持续健康发展，本发明的目的是寻找一种新型的抗原蛋白，为草鱼呼肠孤病毒亚单位疫苗提供更多的候选疫苗蛋白。通过生物信息学的技术方法和实验验证，发现II型草鱼呼肠孤病毒S11节段编码的VP35蛋白具有CxxC-n16-HxC锌指结合基序，是病毒外衣壳蛋白的主要成分，并且具有良好的免疫原性，能够刺激鱼体产生保护性的中和抗体，因此本发明将VP35蛋白制备成了亚单位疫苗，并验证了其应用效果。

目前，未见利用草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白制备亚单位疫苗的相关报道。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供了一种草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗及其制备方法，该亚单位疫苗能够有效预防草鱼呼肠孤病毒引起的草鱼出血病。

本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗，其特征在于：所述亚单位疫苗蛋白的基因序列如序列表SEQ ID No.1所示。

本发明所述的草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗，其特征在于：所述亚单位疫苗蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.4所示。

本发明所述的草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗的制备方法，其特征在于具体步骤为：

（1）质粒VP35-pET32a的构建：以草鱼呼肠孤病毒的双链RNA基因为模板，通过反转录获得cDNA，用引物F1和R1进行PCR扩增，产物纯化后用Kpn I和Hind III双酶切，回收1kp片段，同时将质粒pET32a(+)用Kpn I和Hind III双酶切，回收5.8kb片段，将上述回收的两个DNA片段用T₄>

（2）疫苗蛋白的诱导表达和纯化：将含有VP35-pET32a的阳性菌液在含氨苄的LB液体培养基上于37℃培养过夜活化，按体积比1:100将培养液转接到新鲜的含氨苄LB液体培养基上，于37℃培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度1mM>

本发明所述的草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗的应用，其特征在于：所述VP35蛋白作为抗草鱼呼肠孤病毒感染疫苗用于提高草鱼感染草鱼呼肠孤病毒后鱼体的存活率。

本发明所述的草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗的应用，其特征在于：所述VP35蛋白亚单位疫苗免疫草鱼鱼体后，通过刺激鱼体免疫细胞增殖、诱导鱼体抗病毒基因上调表达以及刺激鱼体特异性抗体产生以提高草鱼抗草鱼呼肠孤病毒感染的能力，进而用于预防水产养殖中因草鱼呼肠孤病毒引起的草鱼出血病。

进一步优选，所述鱼体免疫细胞为单核细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞，所述鱼体抗病毒基因为IFN I、MHC I、IgM和TLR22。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：本发明中草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗为新型抗原蛋白疫苗，其制备方法简单，成分明确，安全稳定，能够诱导草鱼鱼体产生较高的非特异性和特异性免疫应答，进而获得较好的免疫保护效果。

附图说明

图1为草鱼呼肠孤病毒S11目的基因与pET32a质粒酶切电泳图，其中1为草鱼呼肠孤病毒S11目的基因，2为pET32a质粒，M为DNA分子量标准；

图2为亚单位疫苗蛋白在大肠杆菌的诱导表达条件优化，其中1-3分别为IPTG终浓度为0.5mM分别诱导2、4、6h的表达情况，4-7分别为IPTG终浓度为1mM分别诱导2、4、6h的表达情况，M为蛋白分子量标准；

图3为纯化亚单位疫苗蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白分子量标准，1为未加IPTG诱导的菌株，2为IPTG诱导的菌株，3为透析后的亚单位疫苗蛋白；

图4为亚单位疫苗蛋白免疫鱼体后不同时间点白细胞数量变化，其中代表对照组，代表疫苗组，*代表显著高于对照组，P<0.05；

图5为亚单位疫苗蛋白免疫鱼体后不同时间点淋巴细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞的百分比变化；

图6为草鱼主要免疫器官头肾和脾脏中的免疫基因IFN I、MHC I、IgM和TLR22的相对表达量变化；

图7为亚单位疫苗蛋白免疫保护鱼体后血清中特异性抗体效价的变化；

图8为亚单位疫苗蛋白对草鱼免疫保护后的攻毒试验的相对保护率，其中▲代表疫苗组，●代表对照组。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1

草鱼呼肠孤病毒V35蛋白亚单位疫苗表达载体的构建

草鱼呼肠孤病毒分离自河南省新乡市一个养殖池塘，取患草鱼出血病的草鱼内脏，加PBS缓冲液混合研磨匀浆后，取匀浆液8000g离心，取上清用0.22µm孔径的滤器过滤，过滤液接种到体外培养的草鱼肾细胞（CIK）中，培养一周后收集细胞，细胞中含有增殖的草鱼呼肠孤病毒。RT-PCR检测显示该草鱼呼肠孤病毒为II型草鱼呼肠孤病毒。以分离的草鱼呼肠孤病毒的基因组dsRNA为模板，进行反转录分为两步，反转录体系为，提取总RNA 5µL，随机引物1µL，RNase free dH₂O>2O>2+）2.5µL，ddH₂O18.5µL，PCR反应：95℃预变性5min；95℃>2O>4 DNA连接酶>2O>

所述反转录、PCR以及连接试剂均从Takara公司购买；Kpn I、Hind III购自NewEngland Biolabs，美国；LB培养基的组成配方为：胰蛋白胨1g、酵母提取物0.5g、NaCl 1g，加适量蒸馏水溶解，用1M的NaOH调pH值为7.0左右，加蒸馏水定容至100mL（加琼脂粉1.5g即为固体培养基）。

实施例2

草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗的制备

（1）菌液扩大培养以及诱导表达：取含有VP35-pET32a的阳性菌液10µL接种到3mL的含Amp LB培养基中，于37℃振荡培养过夜。将3mL活化菌液接种到300mL新含Amp的LB培养基扩大培养，37℃、200rpm培养4h。取3mL菌液检测OD₆₀₀至0.6。加入终浓度0.5mM或1mM>

（2）蛋白纯化：8000rpm离心30min收集菌体，并用PBS冲洗两次。用20mL的结合缓冲液重悬菌体，冰上超声破碎（功率10%，每超声3s停3s，共1h）。超声破碎后，10000rpm离心10min，收集沉淀。用含1M脲的结合缓冲液振荡溶解2h，10000rpm离心10min，收集沉淀以除去部分杂蛋白。用10mL含6M脲的结合缓冲液溶解沉淀，于4℃过夜溶解。10000rpm离心10min，收集上清，用于后续实验。将Ni-IDA琼脂糖振荡均匀，取2mL加入空柱，静置几分钟，待Ni-IDA琼脂糖沉降均匀。将上清，逐滴加入柱中，每次加1mL，待蛋白液流出后再加入1mL直至所有样品加完。加入10倍柱床体积的含6M脲的结合缓冲液洗脱未结合在柱上的蛋白。用含不同浓度咪唑的洗脱缓冲液各5mL，分别收集洗脱液。通过SDS-PAGE检测每个浓度的洗脱液的蛋白纯度以及浓度。

（3）蛋白透析：根据SDS-PAGE电泳结果，洗脱液进行透析复性，洗脱液加入透析袋中，放入已盛满透析液的大烧杯中，依次在6、4、2、1、0.5和0mol/L脲的20mM Tris溶液透析6h，此过程于4℃进行。

所述试剂组成为：PBS缓冲液：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄•12H₂O>2PO₄0.24g，加适量双蒸水溶解，调pH值为7.4左右，定容至500mL，于121℃高压灭菌后再于4℃保存备用；结合缓冲液：2.4g>

实施例3

草鱼呼肠孤病毒亚单位疫苗的应用

（1）检测疫苗蛋白浓度，用PBS缓冲液稀释至0.3-0.4mg/mL即为疫苗蛋白。

（2）选取规格一致体长10-12cm，体重15-20g，同一批次的草鱼鱼种于27℃水温中充氧饲育，于实验前暂养两周。随机分为2组，每组50条草鱼，继续暂养1周，水温控制在27℃范围内，充气增氧，每天定时投喂一次。组1为对照组，腹腔注射100µL PBS缓冲液；组2为实验组，腹腔注射100µL疫苗蛋白。

（3）VP35蛋白提高免疫细胞数量：将（2）中注射后1、3、5、7、14、21、28、35天随机各取3条，尾静脉取血，一部分全血以体积比1:200稀释后利用Neubauer计数板统计白细胞数目；另一部分1500g离心5min取上层血清用于抗体效价检测，吸取中层细胞进行血涂片制作，通过吉姆萨染色统计一百个单核细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞各占比例。结果显示，白细胞数目在第3、5天明显增加（图4）；嗜中性粒细胞比例在第3、5天增加，单核细胞比例在第3天增加，淋巴细胞比例在第14天增加（图5）。

（4）免疫基因IFN I、MHC I、IgM、TLR22的表达增加：将（2）中注射后1、3、5、7、14、21、28、35天随机各取3条，取头肾和脾脏通过Trizol法提取总RNA，利用PrimeScript™ RTMaster Mix合成cDNA，反应总体系20µL：5×PrimeScript RT Master Mix 4µL，总RNA（500ng）8µL，RNase free dH₂O>2O>

（5）免疫鱼抗体效价分析：检测针对疫苗蛋白的抗体效价，取（3）获得血清进行ELISA实验待测血清作为一抗，兔抗草鱼IgM抗体作为二抗。得到数据分别为：在第28天抗体效价最高，组1=1:(86.66±11.54)，组2=1:(666.67±230.94)。因此，所得疫苗蛋白能刺激草鱼产生特异性抗体（图7）。

（6）亚单位疫苗保护效果分析。将病毒液用PBS稀释为100LD₅₀/ml，即为攻毒液。（2）中的各组实验鱼在注射后21天，取30条，每条注射100µL攻毒液。14天后统计各组鱼的累计死亡数为：组1=27条，组2=10条。根据相对免疫保护率（RPS）公式：RPS=（1-免疫组死亡率/对照组死亡率）×100%，计算亚单位疫苗的免疫保护率为63.0%。因此所得亚单位疫苗能够有效提高草鱼抗草鱼呼肠孤病毒感染的能力，进而用于预防水产养殖中因草鱼呼肠孤病毒引起的草鱼出血病。

以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。

序列表

<110> 河南师范大学

<120> 一种草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗及其制备方法和应用

<130> 2017

<141> 2017-10-27

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 933

<212> DNA

<213> 草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus)

<400> 1

atggaaccag caaaaccatt gacgtttttg gatctcaccc gactcaatga ggcaatctgc 60

tctcgggctc ttttctttga taatgataac aactgctggt ctgtgtctcc aatcgccccg 120

aggcaagcca aattccatga ctcagttgtt tgtattcgat gtggagcgcc catcgacaaa 180

gtccatgcga tgtcaattcc accaccccct gtgcatggct gcatcccgat gctggggcat 240

agccaatggg aagatctgta tgagttggct gatgatatgg gtcgctgtat ttggtgggct 300

aaaaagcaac tgatcatctg gatggagggt atagtgaatc tgaaggctgg taaggtgtat 360

aatgataatg tgagtaaccg cagcgaatgg ccagatgagg tgtgggatga aacatgcaga 420

atcttctgta aatgggcaac gcaaaatcgt gtggcaagcc gttggataca gtcaccatca 480

cgtgtgtaca agtttctttg tgaccaggaa agtaagatga acattgatgc tctggagcta 540

tccaaccatc agatttttca ggcaccaccg aaatggccgg agctagctat ggctgtcccg 600

cattggtccc cgtccgtgca tgagatgcta aatggtcaca aaatggtgac gattgtgccc 660

cgcttgtcca tgccagtcat atttgacccc gccaacggtt acgtcgcccc aatctacacc 720

gcggccatga tcagcctccc gtcccaatgg tgggtgtcac aatacgtaaa agtccatgga 780

agccacatgg tgccacgttt atatggtgat gacgtcccaa ccttacgttc ccgcctgcga 840

aatgcttcta ccacaacctc ccactctcat acgcaactcc tgatgctgcc tgaagctcaa 900

tcgaccttca aacctgagat ccagggacag taa 933

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 2

tcgggtacca tggaaccagc aaaacc 26

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 3

ataagcttgg tactgtccct ggatctcagg 30

<210> 4

<211> 310

<212> PRT

<213> 草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus)

<400> 4

Met Glu Pro Ala Lys Pro Leu Thr Phe Leu Asp Leu Thr Arg Leu Asn

1 5 1015

Glu Ala Ile Cys Ser Arg Ala Leu Phe Phe Asp Asn Asp Asn Asn Cys

202530

Trp Ser Val Ser Pro Ile Ala Pro Arg Gln Ala Lys Phe His Asp Ser

354045

Val Val Cys Ile Arg Cys Gly Ala Pro Ile Asp Lys Val His Ala Met

505560

Ser Ile Pro Pro Pro Pro Val His Gly Cys Ile Pro Met Leu Gly His

65707580

Ser Gln Trp Glu Asp Leu Tyr Glu Leu Ala Asp Asp Met Gly Arg Cys

859095

Ile Trp Trp Ala Lys Lys Gln Leu Ile Ile Trp Met Glu Gly Ile Val

100 105 110

Asn Leu Lys Ala Gly Lys Val Tyr Asn Asp Asn Val Ser Asn Arg Ser

115 120 125

Glu Trp Pro Asp Glu Val Trp Asp Glu Thr Cys Arg Ile Phe Cys Lys

130 135 140

Trp Ala Thr Gln Asn Arg Val Ala Ser Arg Trp Ile Gln Ser Pro Ser

145 150 155 160

Arg Val Tyr Lys Phe Leu Cys Asp Gln Glu Ser Lys Met Asn Ile Asp

165 170 175

Ala Leu Glu Leu Ser Asn His Gln Ile Phe Gln Ala Pro Pro Lys Trp

180 185 190

Pro Glu Leu Ala Met Ala Val Pro His Trp Ser Pro Ser Val His Glu

195 200 205

Met Leu Asn Gly His Lys Met Val Thr Ile Val Pro Arg Leu Ser Met

210 215 220

Pro Val Ile Phe Asp Pro Ala Asn Gly Tyr Val Ala Pro Ile Tyr Thr

225 230 235 240

Ala Ala Met Ile Ser Leu Pro Ser Gln Trp Trp Val Ser Gln Tyr Val

245 250 255

Lys Val His Gly Ser His Met Val Pro Arg Leu Tyr Gly Asp Asp Val

260 265 270

Pro Thr Leu Arg Ser Arg Leu Arg Asn Ala Ser Thr Thr Thr Ser His

275 280 285

Ser His Thr Gln Leu Leu Met Leu Pro Glu Ala Gln Ser Thr Phe Lys

290 295 300

Pro Glu Ile Gln Gly Gln

305 310

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