一组评估早期流产风险的DNA甲基化标志物、引物及其应用

摘要

本发明属于基因工程领域，具体提供一组用于评估早期流产风险的血液DNA甲基化标记物、引物及其应用。本发明的DNA甲基化标志物包括位于PRDM1基因转录起始区附近的8个DNA甲基化位点；cg25608130,cg19577529，cg10573915，cg11072009，cg02667677，cg23778363，cg24793124，cg07331652。本发明提供的该类差异DNA甲基化生物标志物的成功开发是对以蛋白为主的传统生物标志物的颠覆，将为诊断及防治早期流产开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。本发明取材简单，操作方便，是具有前景的生物标志。

说明书

发明领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一组用于评估早期流产风险及辅助诊断早期流产的DNA甲基化标记物、引物及其应用。

背景技术

自然流产(Spontaneous Abortion/Pregnancy Loss)是指临床上孕20周之前终止妊娠或胎儿体重小于500g的妊娠丢失。它是临床上较为常见的病理妊娠，发生率约为10％-15％。作为一种病理性妊娠，自然流产对育龄妇女的生理、心理及家庭带来了极大伤害。目前关于早期流产的具体发病机制仍不明确，治疗手段也效果甚微。因此，研究早期流产的具体发病机制，从而针对性的诊断和治疗显得尤为重要。

DNA甲基化是基因组研究最深入的一种机制，是一种酶介导的化学修饰过程。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳原子共价键结合一个甲基基团。DNA甲基化对维持染色体的结构、X染色体的失活、基因印记以及许多人类基因病(如癌症、心血管疾病、糖尿病)的发生发展都起重要作用。在正常的胚胎发育进程中,胚层分化特异性表达基因被激活，此过程同时涉及DNA甲基化的调控。胚胎成功着床后，滋养层细胞迅速增生并分化为内层的细胞滋养层和外层的合体滋养层。两层细胞在胚泡表面形成大量绒毛，突入蜕膜中。这些绒毛中央为细胞滋养层，外表为合体滋养层，是最早的干绒毛。绒毛的发育使其与子宫蜕膜的接触面增大，利于胚胎与母体间的物质交换。在绒毛膜的发育过程中，若绒毛内的血管发育不良或与胚体循环未连通，胚体可因营养缺乏而发育迟缓或死亡。有研究报导，DNA甲基化转移酶的多态会改DNA甲基化水平增加流产的风险，且动物实验也证明滋养层细胞DNA甲基化异常会导致绒毛组织的功能异常引起流产。

基因组上存在大量的DNA甲基化位点，修饰稳定，易于定量检测。因此，DNA甲基化作为一类新的基因组修饰，其差异可以作为早期流产诊断的分子标志物，可快速评估早期流产风险。目前还没有将血液DNA甲基化应用于辅助诊断早期流产的报道，若能筛选出流产相关的DNA甲基化作为生物标志物，能够快速评估早期流产风险并为防治提供依据。

发明内容

本发明的第一目的是提供一组评估人类早期流产DNA甲基化标志物，用于辅助诊断早期流产的标记物，以实现快速评估早期流产风险并为防治提供依据。

本发明所采用的技术方案为：

一组评估早期流产风险的DNA甲基化标志物，所述的DNA甲基化标志物包括与PRDM1基因启动子区DMR所对应的8个DNA甲基化位点；

所述的8个DNA甲基化位点为cg25608130,cg19577529，cg10573915，cg11072009，cg02667677，cg23778363，cg24793124，cg07331652。

进一步的，所述的8个DNA甲基化位点在流产病例中甲基化水平显著降低10％以上。

进一步的，所述的8个DNA甲基化位点的扩增引物为，扩增cg25608130和cg19577529标志物的上游引物如SEQ ID No.1，下游引物如SEQ ID No.2；扩增cg10573915、cg11072009、cg02667677、cg23778363、cg24793124标志物的上游引物如SEQ ID No.3，下游引物如SEQ ID No.4；扩增cg07331652标志物的上游引物如SEQ ID No.5，下游引物为如SEQID No.6。

本发明的第二目的是提供上述的DNA甲基化标志物在评估早期流产风险中的应用。

本发明的第三目的是提供上述的DNA甲基化标志物在早期流产辅助诊断试剂盒中的应用。

本发明的第四目的第是提供上述的引物在评估早期流产风险中的应用。

本发明的第五目的是提供上述引物在制备早期流产辅助诊断试剂盒中的应用。

进一步的，上述应用中8个DNA甲基化位点中至少有一个位点发生甲基化变化，且每个位点发生甲基化的位点的平均值显著升高10％

进一步的，上述应用包括如下主要步骤：

(1)基因提取

采用DNA提取试剂盒，取待测者样本的基因组DNA。

(2)亚硫酸氢盐修饰及PCR扩增

利用甲基化试剂盒将对待测者样本DNA进行修饰，利用设计合成的PCR引物扩增修饰后的DNA。

(3)目的片段克隆

将扩增后的PCR产物，克隆进载体并铺板培养过夜。

(4)DNA测序

随机挑选平板上的多个克隆进行测序。

(5)计算甲基化比例

根据测序结果计算cpg位点甲基化比例，评估早期流产风险。

进一步的，上述发明中，所述的DNA样本为血液或绒毛组织。

本发明的有益效果：

(1)基因组DNA甲基化是传统生物标志物，不仅稳定、易于检测，且定量精确，将大大提高评估早期流产风险的敏感性和特异性，本发明提供的该类差异DNA甲基化生物标志物的成功开发是对以蛋白为主的传统生物标志物的颠覆，将为流产的早期诊断与防治开创全新局面，为其他生物标注提供参考。

(2)本发明提供的DNA甲基化标志物通过两阶段验证，均能明确区分早期流产和正常样本，说明本发明提供的DNA甲基化标志物可用于辅助诊断早期流产诊断，为临床医生进一步深入检查提供依据，达到快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度的效果。同时，为下一步及时采取更具个性化的防治方案提供支持，延缓和阻止疾病进展。

(3)本发明采用全基因的分辨率的DNA甲基化分析，并综合考虑单个CpG位点及多个CpG位点的DMR,并对差异的DMR附近的基因功能进行了验证。发现DMR可以很好的代表附近基因的表达，这些CpG存在显著性差异并具有稳定性，以说明该标志物具有特异性，可作为标志物使用。

(4)本发明采用基因组DNA进行甲基化检测，较于传统的RNA检测更具稳定性，是具有前景的生物标志。

附图说明

图1流产组和对照组的全基因组DNA甲基化差异热图

图2采用BSP方法在对照组和流产组绒毛组织中验证差异甲基化位点

图3DMR附近基因PRDM1的表达水平

图4对照组和流产组血液DNA中验证差异甲基化位点

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明人严格按照标准操作程序(SOP)采集符合标准的绒毛组织和血液生物样本，系统收集完整的人群基础信息和临床资料，并采用了高通量测序技术和qRT-PCR等方法进行检测

实施例1研究对象选择和样本采集

(1)根据诊断标准：孕20周前发生妊娠丢失的孕妇为病例组；根据年龄、妊娠周数、BMI等指标，以频数匹配法选择生育能力正常、非医学原因选择流产的孕妇(无流产征兆及体征，无流产史，且至少有一个正常小孩出生)为对照组。

(2)B超显示无胚芽或无胎心搏动，且需排除因单基因遗传病、多基因遗传病、染色体异常以及基因突变等因素引发的流产。

(3)研究对象分组：

A组:非医学原因选择流产孕妇对照组(n＝44，4人测序筛选，20人进行组织DNA甲基化独立验证，20人进行血液DNA甲基化独立人群验证)；

B组：不明原因复发性流产孕妇(n＝42，2人测序筛选，20人进行组织DNA甲基化独立验证，20人进行血液DNA甲基化独立人群验证)。

(4)经知情同意，样本采集纳入此次研究孕妇的血液、蜕膜等生物样本。

注：BMI(即身体质量指数，Body Mass Index，简称BMI)，是体重公斤数与身高米数平方的比值，是目前国际上常用的衡量人体胖瘦程度以及是否健康的一项标准。

实施例2绒毛组织DNA甲基化差异分析

QiagenDNeasy Blood&Tissue试剂盒提取基因组DNA，步骤如下：将绒毛组织用研磨器磨碎，用200μL PBS重悬，加入20μL蛋白酶K及200μL Buffer AL，振荡混匀，56℃下孵育10分钟；加入200μL乙醇，振荡混匀；将混合液转移至2mL离心管中的DNeasy Mini滤柱中，6000g离心1分钟，弃去滤出液及离心管；将滤柱放入新的2mL收集管中，加入500μL BufferAW1，6000g离心1分钟，弃去滤出液及收集管；将滤柱放入新的2mL收集管中，加入500μLBuffer AW2，20000g离心3分钟，弃去滤出液及收集管；将滤柱移至新的1.5mL或2mL离心管；将100μL Buffer AE加至滤柱膜中央以洗提DNA，室温下孵育1分钟，6000g离心1分钟收取DNA。

将两组细胞DNA用“Illumina methylationEPICBeadChip”进行全基因组甲基化水平检测。

利用开源软件ChAMP进行数据分析，根据软件默认的pipeline进行提取甲基化信号值并进行标化比较。步骤如下：将原始数据读入软件进行质控，去掉低质量的cg探针，位于性染色体的探针，SNP位点的探针。将每个cg位点的甲基化值的范围定位0到1，0为完全未甲基化，1为完全甲基化。采用BMIQ方法对所有的甲基化值进行统一标化后进行统计检验。以1KB为窗口研究附近多个cg位点构成的DMR的甲基化差异。

通过分析，我们总共发现了3830个DMR FDR<0.05。流产组跟对照组相比，其中1688个DMR的甲基化水平下调(Hypo DMR)，2142个DMR的甲基化水平上调(Hyper DMR)。图1为对照组及处理组的差异DNA甲基化的DMR热图。

我们选取了PRDM1基因启动子区的低甲基化DMR，包括8个甲基化位点作为标志物。DMR分别包含的甲基化位点的平均甲基化水平在流产组中均降低了约10％以上。如表1所示。

表1差异DMR的区域的甲基化水平

实施例3差异DMR在独立人群中的验证

选取20例独立人群对照和20流产病例，利用QiagenDNeasy Blood&Tissue试剂盒提取基因组DNA，步骤如下：将绒毛组织用研磨器磨碎，用200μL PBS重悬，加入20μL蛋白酶K及200μL Buffer AL，振荡混匀，56℃下孵育10分钟；加入200μL乙醇，振荡混匀；将混合液转移至2mL离心管中的DNeasy Mini滤柱中，6000g离心1分钟，弃去滤出液及离心管；将滤柱放入新的2mL收集管中，加入500μL Buffer AW1，6000g离心1分钟，弃去滤出液及收集管；将滤柱放入新的2mL收集管中，加入500μL Buffer AW2，20000g离心3分钟，弃去滤出液及收集管；将滤柱移至新的1.5mL或2mL离心管；将100μL Buffer AE加至滤柱膜中央以洗提DNA，室温下孵育1分钟，6000g离心1分钟收取DNA。

使用EZ DNA methylation kit(Zymo Research,CA)试剂盒对DNA进行亚硫酸氢盐修饰，未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化。通过本发明中的SEQ ID 1-6引物进行PCR扩增。扩增条件如下：95℃ 10分钟(1个循环)；95℃30秒,60℃ 30秒，72℃ 40秒(共40个循环)；72℃ 10分钟(1个循环)。将扩增后的产物使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化产物，并连接至pMD19-T(Takara,Japan)载体中。将100μl感受态细胞置于冰上解冻，加入上述5μl连接液，轻轻混匀，冰上放置30分钟；然后42℃水浴热休克90秒后再冰上放置5分钟；在体系中加入400μl SOC培养基，37℃ 250rpm振荡培养1h；将悬液均匀涂布在含氨苄青霉素抗性的LB平板上；将平板于37℃培养过夜；用100ul枪头挑取10个单克隆进行测序。

通过独立人群验证发现，流产病例中8个甲基化位点明显低于对照组10％以上。如图2所示，黑色圆圈代表甲基化，白色圆圈代表未甲基化。表2所示为验证人群绒毛组织DNA中DMR甲基化水平。

表2绒毛组织DNA中差异DMR的甲基化水平

CG ID对照组流产组cg256081300.650.05cg195775290.650.05cg105739150.150cg110720090.250.05cg026676770.30.05cg237783630.350.05cg247931240.450.05cg073316520.250

实施例4差异DMR相关的基因表达

针对上述差异DMR，我们通过RT-PCR在独立人群中检测了其附近基因表达。

选取20例独立人群对照和20流产病例，将绒毛组织用研磨器磨碎，使用QiagenRNeasy Mini Kit提取RNA。具体步骤如下：收取对照组及流产组绒毛组织用研磨器磨碎，向EP管中加入900μLTRIzol，充分混匀后，12000rpm离心15分钟，立即取上清至一洁净1.5mL EP管中；向EP管中加入1.5倍上清水相体积的无水乙醇，充分混匀后转移至离心柱，10000rpm离心15秒，弃下层废液；在离心柱上加入700μLRWT缓冲液，10000rpm离心15秒，弃下层废液；在离心柱上加入500μL RPE缓冲液，10000rpm离心15秒，弃下层液；重复一遍。将离心柱加入一个新的2mL的管子，10000rpm离心1分钟，用于去除RPE缓冲液。将离心柱装在一个新的1.5mL的离心管中，并在柱子上加入50μLDEPC处理的水，离心1分钟；-70℃保存处理后的样本。

通过RNA逆转录反应得到cDNA样品，逆转录的反应体系包括4μL5×AMV缓冲液、2μL10mM dNTP混合液(Takara公司)、0.5μL RNA酶抑制剂(Takara公司)、1μL AMV(Takara公司)。反应步骤为16℃孵育15分钟，42℃反应1小时，85℃孵育5分钟。

qRT-PCR进行基因定量：取1μL cDNA，将cDNA倍比稀释，加入0.3μLTaq酶(Takara公司)，1μL 20×EVA GREEN，0.25μL 10μM正向引物(表2)，0.25μL10μM反向引物(表3)，1.2μL25mM MgCl₂，1.6μL>–△G表示，其中△G＝C_Tgroup1–C_Tgroup2。为保证各次实验间的可比性，我们在每板上都设置了管家基因ACTB，以其表达量作为内参调整计算表达量。

从结果分析得出，PRDM1基因表达量在流产组显著上调。如图3所示。

表3引物序列

实施例5血液DNA中PRDM1基因附近DMR甲基化检测

选取20例独立人群对照和20流产病例，利用Qiagen DNeasy Blood&Tissue试剂盒提取基因组DNA，步骤如下：取200ul血液样本，加入200μL PBS，加入20μL蛋白酶K及200μLBuffer AL，振荡混匀，56℃下孵育10分钟；加入200μL乙醇，振荡混匀；将混合液转移至2mL离心管中的DNeasy Mini滤柱中，6000g离心1分钟，弃去滤出液及离心管；将滤柱放入新的2mL收集管中，加入500μL Buffer AW1，6000g离心1分钟，弃去滤出液及收集管；将滤柱放入新的2mL收集管中，加入500μL Buffer AW2，20000g离心3分钟，弃去滤出液及收集管；将滤柱移至新的1.5mL或2mL离心管；将100μL Buffer AE加至滤柱膜中央以洗提DNA，室温下孵育1分钟，6000g离心1分钟收取DNA。

使用EZ DNA methylation kit(Zymo Research,CA)试剂盒对DNA进行亚硫酸氢盐修饰，未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化。通过本发明中的SEQ ID 2-7引物进行PCR扩增。扩增条件如下：95℃ 10分钟(1个循环)；95℃30秒,60℃ 30秒，72℃ 40秒(共40个循环)；72℃ 10分钟(1个循环)。将扩增后的产物使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化产物，并连接至pMD19-T(Takara,Japan)载体中。将100μl感受态细胞置于冰上解冻，加入上述5μl连接液，轻轻混匀，冰上放置30分钟；然后42℃水浴热休克90秒后再冰上放置5分钟；在体系中加入400μl SOC培养基，37℃ 250rpm振荡培养1h；将悬液均匀涂布在含氨苄青霉素抗性的LB平板上；将平板于37℃培养过夜；用100ul枪头挑取10个单克隆进行测序。通过独立人群验证发现，流产病例血液DNA上这8个甲基化位点平均甲基化水平也明显低于对照组10％以上，如图4所示，黑色圆圈代表甲基化，白色圆圈代表未甲基化。表4所示为血液DNA中差异DMR的甲基化8个位点的平均水平。

表4血液DNA中差异DMR的甲基化水平

CG ID对照组流产组cg256081300.350cg195775290.350cg105739150.150cg110720090.150cg026676770.250.05cg237783630.150.05cg247931240.250.05cg073316520.250

综上所述，本发明可从血液及绒毛组织特定区域DNA甲基化水平变化，评价早期流产发生的风险，并提供新的生物标志物。此外，此方法对辅助诊断早期流产发生具有重要提示作用。

序列表

<110> 南京医科大学

<120> 一组评估早期流产风险的DNA甲基化标志物、引物及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

agataatata tggaagtgta ggaag 25

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

aaaacataaa attcctacac tc 22

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

ttattgtttg tgttaaaggg a 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

ataccacctt tactttaaac t 21

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 5

tgagtgtatt tgttatttag aagt 24

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 6

aaaactaact aaaacaccac 20