一种甜瓜白粉病病菌的离体保存方法

摘要

本发明属于生物病原菌保存技术领域，具体涉及一种甜瓜白粉病病菌的离体保存方法。该方法包括以下步骤：步骤1：配制培养基，然后将培养基加入到高压蒸汽灭菌后的培养皿中；步骤2：培养基凝固后，在培养基上放入1～2层吸水纸。步骤3：将感白粉病甜瓜品种的种子进行水培，待幼苗长出第1片真叶后，取幼苗的子叶，然后将消毒后的子叶平放在吸水纸上；步骤4：取白粉病病菌，对子叶进行接种。步骤5：接种后盖上培养皿盖子，并将培养皿置于温度20℃、光照度2000勒克斯、光周期（白天/黑夜）12小时/12小时环境下进行培养；步骤6：35～42天后，对所述子叶上的白粉病病菌进行转接。该方法操作非常简便，成本低，病菌保存时间较长。

说明书

技术领域

本发明属于生物病原菌保存技术领域，具体涉及一种甜瓜白粉病病菌的离体保存方法。

背景技术

甜瓜是葫芦科（Cucurbitaceae）黄瓜属（Cucumis>2，产量占到了世界总产量的50.04%。然而，随着近年来保护地甜瓜栽培面积的扩大，甜瓜病害日趋严重。白粉病是保护地甜瓜生产中的重要病害之一，主要侵染甜瓜幼苗期和成株期的植株叶片，严重时期茎和果实上也会受到侵染。在适宜的环境条件下，白粉病发展非常迅速，几天时间即可蔓延至整个温室或瓜田，造成叶片发黄、干枯，严重影响植株的光合作用，进而影响甜瓜果实的产量和品质。

鉴于甜瓜白粉病的严重危害，其已经成为科研工作者研究的一个热点。然而，甜瓜白粉病属于专性寄生菌，无论其菌丝体还是无性阶段的分生孢子，离开活体寄主后，其生活力的维持时间都很短，因此白粉病菌必须进行活体保存。当前研究人员在进行甜瓜白粉病研究中，为了保证白粉病病菌的周年保存，通常需要不断培养感病植株幼苗，通过孢子悬浮液喷雾接种，并不断转接病菌。尽管也有报道当植株长到5片真叶时，剪取茎尖扦插到盛有苯并咪唑-甘露醇琼脂糖培养基的三角瓶中，然后在茎尖上接种保存。由于必须等到植株长至5～6叶时才能取茎尖，费时费工，成本较高，并且茎尖培养过程中容易造成污染。传统的孢子悬浮液喷雾接种保存方法，必须进行育苗，等到植株长到3～4片真叶时进行接种，并且植株发病后叶片很快变黄、干枯，不仅育苗成本高，保存时间也短。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种甜瓜白粉病病菌的离体保存方法，该方法通过子叶离体接种，大大缩短了前期甜瓜幼苗的培养时间，操作简便，成本低；同时由于种子萌发后大部分营养贮存在子叶中，因此与真叶相比，用子叶接种病菌保存时间更长；另外，子叶与培养基间有吸水纸的隔离，降低了污染的几率。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种甜瓜白粉病病菌的离体保存方法，包括以下步骤：

步骤1：配制培养基：每1000毫升无菌水中加入8克琼脂、6.8克蔗糖、18.2克甘露醇和400微升质量分数25%的那他霉素溶液；然后将培养基加入到高压蒸汽灭菌后的培养皿中。

步骤2：培养基凝固后，在培养基上放1～2层高压蒸汽灭菌后的吸水纸。

步骤3：将感白粉病甜瓜品种的种子进行水培，待幼苗长出第1片真叶后，在超净工作台上取幼苗的子叶，将子叶在体积百分数75%的酒精中浸泡3秒钟后用无菌水冲洗3次，然后将子叶平放在培养皿中，所述子叶的下表面向下。

所述水培包括以下步骤：

将感白粉病甜瓜品种的种子在55℃温水中浸种3～4小时，然后放入铺有润湿滤纸的培养皿中，并盖上培养皿盖子；

将培养皿放在温度28～30℃的黑暗环境下培养18～24小时进行催芽；

待种子发芽后，将培养皿放在温度25℃、光照度6000勒克斯、光周期12小时/12小时（光照/黑暗）环境下进行培养；

待幼苗高度接近培养皿高度时，打开培养皿盖子进行培养；

观察幼苗生长情况，及时向培养皿中补充1/2 Hogland营养液，保持滤纸润湿直至幼苗第一片真叶完全展开。

步骤4：在甜瓜产区选取甜瓜白粉病感病植株，先用洗耳球将甜瓜白粉病感病植株叶片上的白粉病病斑表面的老孢子吹掉，第二天用接种环取直径3mm白粉病病斑内的新鲜孢子，接种到步骤3中所述子叶上。

步骤5：接种后盖上培养皿盖子，并将培养皿放在温度20℃、光照度2000勒克斯、光周期12小时/12小时（光照/黑暗）环境下进行培养。

步骤6：35～42天后，对所述子叶上的白粉病病菌进行转接。

进一步地，所述吸水纸上具有圆孔，所述圆孔的直径为4～6mm，所述子叶的叶柄下端位于圆孔内，并与培养基接触。

进一步地，所述培养皿中的培养基厚度为2～4mm。

进一步地，所述感白粉病甜瓜品种为中感白粉病或高感白粉病的甜瓜品种。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明通过在甜瓜离体子叶上接种白粉病病菌来对其进行保存，在两片子叶完全展开、第一片真叶长出后即可进行接种白粉病病菌，与传统的利用孢子悬浮液接种植株相比，无需等到植株长大，大大提高了效率；并且由于子叶中贮存有比真叶更多的营养，因而保存时间也较长。

2、本发明所用的培养基中加入了那他霉素，能够有效预防培养基被其他细菌和放线菌的污染，另外在培养基上面加盖了吸水纸，避免子叶与培养基的大面积接触，进一步降低了污染的几率。

3、在本发明优化方案中，吸水纸上具有圆孔，子叶的叶柄下端位于圆孔内，可使子叶能够直接吸收到营养，另外子叶的叶片部分位于吸水纸上，不与培养基接触，污染几率较小。

4、本发明方法使用培养皿进行白粉病病菌保存，培养基用量少，节约了成本。

5、本发明方法主要用于白粉病病菌短期保存，满足短时间内使用白粉病病菌的需求，培养周期短，操作非常简便，成本低。

附图说明

图1为本发明实施例2中甜瓜白粉病病菌离体保存图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限定本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

一种甜瓜白粉病病菌的离体保存方法，包括以下步骤：

步骤1：配制培养基：向1000毫升无菌水中加入8克琼脂、6.8克蔗糖、18.2克甘露醇和400微升质量分数25%的那他霉素溶液；然后将培养基加入到高压蒸汽灭菌后的培养皿中。

步骤2：培养基凝固后，在培养基上放1层高压蒸汽灭菌后的吸水纸。

步骤3：将感白粉病甜瓜品种的种子进行水培，待幼苗长出第1片真叶后，在超净工作台上取幼苗的子叶，将子叶在体积百分数75%的酒精中浸泡3秒钟后用无菌水冲洗3次，然后将子叶平放在培养皿中的吸水纸上，所述子叶的下表面向下；所述感白粉病甜瓜品种为中感白粉病的甜瓜品种。

所述水培包括以下步骤：

将感白粉病甜瓜品种的种子在55℃温水中浸种3小时，然后放入铺有润湿滤纸的培养皿中，并盖上培养皿盖子；

将培养皿放在温度28℃的黑暗环境下培养24小时进行催芽；

待种子发芽后，将培养皿放在温度25℃、光照度6000勒克斯、光周期12小时/12小时（光照/黑暗）环境下进行培养；

待幼苗高度接近培养皿高度时，打开培养皿盖子进行培养；

观察幼苗生长情况，及时向培养皿中补充1/2Hogland营养液，保持滤纸润湿直至幼苗第一片真叶完全展开。

步骤4：在甜瓜产区选取甜瓜白粉病感病植株，先用洗耳球将甜瓜白粉病感病植株叶片上的白粉病病斑表面的老孢子吹掉，第二天用接种环取直径3mm白粉病病斑内的新鲜孢子，接种到步骤3中所述子叶上。

步骤5：接种后盖上培养皿盖子，并将培养皿放在温度20℃、光照度2000勒克斯、光周期12小时/12小时（光照/黑暗）环境下进行培养。

步骤6：35天后，对所述子叶上的白粉病病菌进行转接。

实施例2

一种甜瓜白粉病病菌的离体保存方法，包括以下步骤：

步骤1：配制培养基：向1000毫升无菌水中加入8克琼脂、6.8克蔗糖和18.2克甘露醇，然后加热至琼脂融化，接着在培养基凝固前加入400微升质量分数25%的那他霉素溶液；然后将培养基加入到高压蒸汽灭菌后的培养皿中，所述培养皿中的培养基厚度为4mm。

步骤2：培养基凝固后，在培养基上放1层高压蒸汽灭菌后的吸水纸，所述吸水纸上具有圆孔，所述圆孔的直径为6mm。

步骤3：将感白粉病甜瓜品种的种子进行水培，待幼苗长出第1片真叶后，在超净工作台上取幼苗的子叶，将子叶在体积分数75%的酒精中浸泡3秒钟后用无菌水冲洗3次，然后将子叶平放在培养皿中的吸水纸上，所述子叶的下表面向下，子叶的叶柄下端位于步骤2中所述圆孔内，并与培养基接触；所述感白粉病甜瓜品种为高感白粉病的甜瓜品种。

所述水培包括以下步骤：

将感白粉病甜瓜品种的种子在55℃温水中浸种4小时，然后放入铺有润湿滤纸的培养皿中，并盖上培养皿盖子；

将培养皿放在温度30℃的黑暗环境下培养18小时进行催芽；

待种子发芽后，将培养皿放在温度25℃、光照度6000勒克斯、光周期12小时/12小时（光照/黑暗）环境下进行培养；

待幼苗高度接近培养皿高度时，打开培养皿盖子进行培养；

观察幼苗生长情况，及时向培养皿中补充1/2Hogland营养液，保持滤纸润湿直至幼苗第一片真叶完全展开。

步骤4：在甜瓜产区选取甜瓜白粉病感病植株，先用洗耳球将甜瓜白粉病感病植株叶片上的白粉病病斑表面的老孢子吹掉，第二天用接种环取直径3mm白粉病病斑内的新鲜孢子，接种到步骤3中所述子叶上。

步骤5：接种后盖上培养皿盖子，并将培养皿放在温度20℃、光照度2000勒克斯、光周期12小时/12小时（光照/黑暗）环境下进行培养。

步骤6：42天后，对所述子叶上的白粉病病菌进行转接。

实施例3

一种甜瓜白粉病病菌的离体保存方法，包括以下步骤：

步骤1：配制培养基：向2000毫升无菌水中加入16克琼脂、13.6克蔗糖和36.4克甘露醇，然后加热至琼脂融化，接着在培养基凝固前加入800微升质量分数25%的那他霉素溶液；然后将培养基加入到高压蒸汽灭菌后的培养皿中，所述培养皿中的培养基厚度为3mm。

步骤2：培养基凝固后，在培养基上放1层高压蒸汽灭菌后的吸水纸，所述吸水纸上具有圆孔，所述圆孔的直径为5mm。

步骤3：将感白粉病甜瓜品种的种子进行水培，待幼苗长出第1片真叶后，在超净工作台上取幼苗的子叶，将子叶在体积分数75%的酒精中浸泡3秒钟后用无菌水冲洗3次，然后将子叶平放在培养皿中的吸水纸上，所述子叶的下表面向下，子叶的叶柄下端位于步骤2中所述圆孔内，并与培养基接触；所述感白粉病甜瓜品种为中感白粉病的甜瓜品种；所述水培步骤同实施例2。

步骤4：在甜瓜产区选取甜瓜白粉病感病植株，先用洗耳球将甜瓜白粉病感病植株叶片上的白粉病病斑表面的老孢子吹掉，第二天用接种环取直径3mm白粉病病斑内的新鲜孢子，接种到步骤3中所述子叶上。

步骤5：接种后盖上培养皿盖子，并将培养皿放在温度20℃、光照度2000勒克斯、光周期12小时/12小时（光照/黑暗）环境下进行培养。

步骤6：40天后，对所述子叶上的白粉病病菌进行转接。

实施例4

一种甜瓜白粉病病菌的离体保存方法，包括以下步骤：

步骤1：配制培养基：向1000毫升无菌水中加入8克琼脂、6.8克蔗糖和18.2克甘露醇，然后加热至琼脂融化，接着在培养基凝固前加入400微升质量分数25%的那他霉素溶液；然后将培养基加入到高压蒸汽灭菌后的培养皿中，所述培养皿中的培养基厚度为2mm。

步骤2：培养基凝固后，在培养基上放2层高压蒸汽灭菌后的吸水纸，所述吸水纸上具有圆孔，所述圆孔的直径为4mm。

步骤3：将感白粉病甜瓜品种的种子进行水培，待幼苗长出第1片真叶后，在超净工作台上取幼苗的子叶，将子叶在体积分数75%的酒精中浸泡3秒钟后用无菌水冲洗3次，然后将子叶平放在培养皿中的吸水纸上，所述子叶的下表面向下，子叶的叶柄下端位于步骤2中所述圆孔内，并与培养基接触；所述感白粉病甜瓜品种为高感白粉病的甜瓜品种。

所述水培包括以下步骤：

将感白粉病甜瓜品种的种子在55℃温水中浸种3.5小时，然后放入铺有润湿滤纸的培养皿中，并盖上培养皿盖子；

将培养皿放在温度29℃的黑暗环境下培养20小时进行催芽；

待种子发芽后，将培养皿放在温度25℃、光照度6000勒克斯、光周期12小时/12小时（光照/黑暗）环境下进行培养；

待幼苗高度接近培养皿高度时，打开培养皿盖子进行培养；

观察幼苗生长情况，及时向培养皿中补充1/2Hogland营养液，保持滤纸润湿直至幼苗第一片真叶完全展开。

步骤4：在甜瓜产区选取甜瓜白粉病感病植株，先用洗耳球将甜瓜白粉病感病植株叶片上的白粉病病斑表面的老孢子吹掉，第二天用接种环取直径3mm白粉病病斑内的新鲜孢子，接种到步骤3中所述子叶上。

步骤5：接种后盖上培养皿盖子，并将培养皿放在温度20℃、光照度2000勒克斯、光周期12小时/12小时（光照/黑暗）环境下进行培养。

步骤6：37天后，对所述子叶上的白粉病病菌进行转接。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理及工艺条件所做的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。