一种团簇结构的四氧化三铁纳米颗粒的制备方法

摘要

本发明涉及一种团簇结构的四氧化三铁纳米颗粒的制备方法，包括：超小四氧化三铁纳米颗粒的制备，活化后的超小四氧化三铁纳米颗粒溶液的制备，团簇结构的四氧化三铁纳米颗粒的制备。本发明简单，制备得到的Fe3O4/Cystamine纳米颗粒具有良好的稳定性和生物相容性，对还原性条件敏感，可以在动物体内实现肿瘤部位的T1‑T2双模态MR成像效果，能够有效地作为MR成像造影剂，具有产业化和商业化的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于磁共振成像(MRI)造影剂的制备领域，特别涉及一种团簇结构的四氧化三铁纳米颗粒的制备方法。

背景技术

一直以来，恶性肿瘤都是危害人类生命的头号杀手，具有死亡率高、难治疗以及恶化迅速等特点。因此，肿瘤的早期诊断和特异性治疗显得尤为重要。目前，肿瘤的检测手段主要有：超声成像、CT成像、核医学(PET或SPECT)成像以及磁共振成像(MRI)。随着磁共振技术的发展，其扫描时间逐渐缩短，分辨率逐渐提高，对于小病灶的检测也更加准确，这也使得磁共振成像技术成为近年来发展起来的新型疾病检测手段。为了提高MRI成像诊断的灵敏度和特异性，有必要选择合适的MRI造影剂。常规的MRI造影剂主要分为两类：一类是T₁加权的MRI造影剂，一类是T₂加权的MRI造影剂。T₂加权的MRI造影剂是检测软组织损伤的首选方法，至今已有大量文献报道利用磁性氧化铁纳米颗粒作为MRI阴性造影剂应用于癌症的诊断。然而，在人体血液中、钙离子富集区、金属离子沉积以及人体组织损伤部位在T₂成像过程中也会出现信号减弱现象而得到负造影图像，这往往会干扰临床诊断，这时则需要成像分辨率较高的T₁加权MRI造影剂。总之，单模态的检测方法往往不能够给出高精确度和全面的诊断结果。随着科技的发展，人们对MRI造影剂研究不仅趋向于弛豫率更高，也趋于多功能、多模态化，通过整合不同的诊断信息，更好地指导制定治疗方案。其中，T₁-T₂双模态核磁共振成像造影剂成为一个新兴研究方向引起人们的广泛关注。

构建T₁-T₂双模态造影剂的常见方法有以下3种：(1)将某种T₂造影剂通过与T₁造影剂相结合，使获得的复合纳米材料具有T₁-T₂双模态MR成像性能；(2)通过对磁性纳米颗粒(如Fe₃O₄纳米颗粒)的合成方法进行调控，合成出具有合适尺寸的磁性纳米材料。研究表明，Fe₃O₄纳米颗粒的磁性与尺寸有很大的关联，粒径<5nm的Fe₃O₄纳米颗粒(超小Fe₃O₄纳米颗粒)磁矩大幅降低，T₂效应被抑制，因此可以用作T₁加权或T₁-T₂双模态MR成像的造影剂；(3)团簇型的纳米颗粒。具有T₁效应的弱磁性纳米颗粒因为形成团簇，尺寸变大磁性增强而获得T₂成像效果。研究表明，本身具有T₁加权MR成像效果的超小Fe₃O₄磁性纳米颗粒形成团簇后尺寸变大，导致其磁性增强，磁矩也随之增加。因此，团簇型超小Fe₃O₄纳米颗粒的T₁效应被抑制，进而转化为T₂成像造影剂。通过合适的方法构建团簇型超小Fe₃O₄纳米颗粒，也可以实现T₁-T₂双模态成像效果。例如，Mao等制备出粒径为3.5nm、低聚糖包裹的Fe₃O₄纳米颗粒。这种单分散的纳米颗粒呈现出良好的T₁效应，但是在酸性的肿瘤微环境下可以形成团簇结构的Fe₃O₄自组装体，并转化成T₂效应，实现肿瘤部位的T₁-T₂双模态MR成像造影(Mao>

检索国内外文献，尚没有发现关于构建团簇型超小四氧化三铁纳米颗粒并用于生物体内T₁-T₂双模态MRI诊断的相关报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种团簇结构的四氧化三铁纳米颗粒的制备方法，该方法简单，反应条件温和，易于操作，成本较低，制备得到的团簇结构的Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒具有良好的稳定性和生物相容性，易于被细胞内吞，在生物体内可以实现T₁-T₂转化的双模态MR成像。

本发明的一种团簇结构的四氧化三铁纳米颗粒的制备方法，具体步骤如下：

(1)将三价铁盐溶于溶剂中，加入稳定剂搅拌，加入反应助剂，溶剂热反应，冷却，离心，干燥，得到超小四氧化三铁纳米颗粒，其中三价铁盐、溶剂、稳定剂和反应助剂的比例为0.62～0.68g:38～40mL:0.47～0.50g:1.312～1.33g；

(2)将步骤(1)中的超小四氧化三铁纳米颗粒分散在溶剂中，超声，经过EDC和NHS活化，得到活化后的超小四氧化三铁纳米颗粒溶液，其中超小四氧化三铁纳米颗粒、EDC和NHS的质量比为13～16:28～36:17～20，超小四氧化三铁纳米颗粒与溶剂的比例为28～32mg:2～4mL；

(3)将胱胺二盐酸盐Cystamine dihydrochloride分散于溶剂中，超声，加入步骤(2)中活化后的超小四氧化三铁纳米颗粒溶液反应，透析，冷冻干燥，得到团簇结构的Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒，其中活化后的超小四氧化三铁纳米颗粒与胱胺二盐酸盐的摩尔比为3～5:1～2，胱胺二盐酸盐与溶剂的比例为15～19mg:2～4mL。

所述步骤(1)中三价铁盐为无水氯化铁；溶剂为二甘醇DEG；稳定剂为柠檬酸钠；反应助剂为无水醋酸钠；加入稳定剂搅拌的条件为：空气气氛下80℃搅拌1～2h。

所述步骤(1)中溶剂热反应温度为190～200℃，溶剂热反应时间为3～4h。

所述步骤(1)中离心的具体步骤为：8500～9000rpm离心10～15min，弃上清液，用无水乙醇回溶，8500～9000rpm离心10～15min，重复操作2～3次。

所述步骤(1)中溶剂热反应是在50mL高压反应釜中进行的；干燥是在60～65℃条件下烘干。

所述步骤(2)、(3)中溶剂均为超纯水。

所述步骤(2)中活化时间为2.5～3h。

所述步骤(3)中加入步骤(2)中活化后的超小四氧化三铁纳米颗粒溶液反应的温度为室温，时间为60～72h。

所述步骤(3)中透析的具体步骤为：用截留分子量为8000～14000的透析袋透析2～3天(每次透析所用蒸馏水1.5～2L，共换水6～9次)。

本发明使用胱胺二盐酸盐(Cystamine dihydrochloride)将超小Fe₃O₄纳米颗粒交联成团簇结构。通过控制交联剂和Fe₃O₄的比例可以制备出性质稳定、尺寸可控的团簇型Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒，并赋予其较高的T₂弛豫率(26.4mM^-1s^-1)。团簇结构的Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒在体外表现出对还原剂GSH响应的特性，还原性条件下，胱胺二盐酸盐中的S-S会断裂，从而使团簇型Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒分散成Fe₃O₄纳米颗粒，获得较高的T₁弛豫率(4.3mM^-1s^-1)，实现材料的T₁-T₂双模态MR成像功能。与单独的超小Fe₃O₄相比，团簇结构的Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒水动力直径更大(134.4nm)，更容易被细胞内吞，并且对4T1细胞内部的还原性环境敏感，可以实现细胞水平的MR成像。除此之外，团簇结构的Fe₃O₄/Cystamine能够通过尾静脉注射或瘤内注射应用于动物体内，荷瘤鼠体内肿瘤部位注射Fe₃O₄/Cystamine后可以清晰的观察到T₁-T₂双模态MR成像的转化过程，通过尾静脉注射Fe₃O₄/Cystamine后可以观察到肿瘤部位的MR成像信号增强。因此，本发明制备的团簇结构的Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒具有潜在MR诊断应用价值。

本发明使用红外(FTIR)、热重分析(TGA)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-OES)、Zeta电势和水合粒径(DLS)等方法表征制备的磁性纳米颗粒的物理及化学性质。并通过MRI成像仪测定纳米颗粒的T₁-T₂双模态成像性能，通过测试材料与GSH溶液混合后的弛豫性能变化，测试其体外还原响应性。然后通过溶血实验和CCK-8法评价纳米颗粒的血液相容性和细胞毒性，再利用普鲁士蓝染色法和ICP-OES法验证4T1细胞对纳米颗粒的吞噬能力。通过对荷瘤鼠瘤内注射或尾静脉注射纳米颗粒，观察材料的T₁-T₂双模态MR成像造影效果。

有益效果

(1)本发明简单，采用高弛豫率的超小Fe₃O₄纳米颗粒，通过胱胺二盐酸盐的交联作用，使超小Fe₃O₄纳米颗粒形成稳定的团簇型Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒，制备得到的团簇型Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒具有良好的稳定性和生物相容性，T₂弛豫率较高(26.4mM^-1s^-1)；

(2)制备得到的团簇型Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒在体外表现出对还原剂GSH响应的特性，还原性条件下，胱胺二盐酸盐中的S-S会断裂，从而使团簇型Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒分散成Fe₃O₄纳米颗粒，获得较高的T₁弛豫率(4.3mM^-1s^-1)，实现材料的T₁-T₂双模态MR成像功能，具有实施商业化的前景；

(3)制备得到的团簇结构的Fe₃O₄/Cystamine能够通过瘤内注射应用于动物体内，荷瘤鼠体内肿瘤部位注射Fe₃O₄/Cystamine后可以清晰的观察到T₁-T₂双模态MR成像的转化过程。通过尾静脉注射以后，Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒具有很好的体内T₁加权MR成像能力，能实现动物体内T₁加权的MRI诊断；这些优点使本发明制备的Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒能够有效地作为MR成像造影剂。

附图说明

图1是实施例3中Fe₃O₄(a)和Fe₃O₄/Cystamine(b)的红外光谱图；

图2是实施例3中Fe₃O₄(a)和Fe₃O₄/Cystamine(b)的热重分析图；

图3是实施例4中Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒的稳定性测试图；

图4是实施例5中Fe₃O₄(a)、Fe₃O₄/Cystamine(b)和谷胱甘肽GSH处理后Fe₃O₄/Cystamine(c和d)纳米颗粒的TEM图；

图5是实施例6中Fe₃O₄，Fe₃O₄/Cystamine和谷胱甘肽GSH处理后的Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒的(a)T₁弛豫率和(b)T₂弛豫率；

图6是实施例6中Fe₃O₄，Fe₃O₄/Cystamine和谷胱甘肽GSH处理后的Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒的(a)T₁加权MR成像图和(b)T₂加权MR成像图；

图7是实施例7中CCK-8法测得4T1细胞经过PBS缓冲液(对照)、Fe₃O₄和Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒在铁浓度5-100μg/mL条件下处理24小时后的细胞活力测试结果；

图8是实施例8中Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒在铁浓度为10-200μg/mL下的溶血实验结果；

图9是实施例9中4T1细胞经过PBS缓冲液(对照a和e)、Fe₃O₄纳米颗粒的PBS溶液(b-d)和Fe₃O₄/Cystamine的PBS溶液(f-h)处理4小时后经普鲁士蓝染色后的结果，其中(b,f)铁浓度为25μg/mL，(c,g)铁浓度为50μg/mL，(d,h)铁浓度为100μg/mL；

图10是实施例9中4T1细胞经过PBS缓冲液、Fe₃O₄纳米颗粒的PBS溶液和Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒的PBS溶液(Fe浓度为5-100μg/mL范围内)处理4小时后收集细胞，经王水消化后利用ICP-OES测定得到每个细胞内吞的铁含量结果；

图11是实施例10中小鼠瘤内注射Fe₃O₄/Cystamine的PBS溶液(Fe浓度为3.2mM，20μL)后不同时间点，肿瘤处的T₁-T₂双模态MR成像图片测试结果；

图12是实施例11中对小鼠尾静脉分别注射Fe₃O₄纳米颗粒的PBS溶液(a)和Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒的PBS溶液(b)(Fe浓度为0.1M，150μL)后不同时间点(0～120分钟)肿瘤部位的T₁加权MR成像图片；

图13是实施例11中对小鼠尾静脉分别注射Fe₃O₄纳米颗粒的PBS溶液和Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒的PBS溶液(Fe浓度为0.1M，150μL)后不同时间点裸鼠肿瘤部位的T₁加权MRI信噪比值变化；

图14是实施例12中对小鼠尾静脉分别注射PBS、Fe₃O₄纳米颗粒的PBS溶液和Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒的PBS溶液(Fe浓度为0.1M，150μL)12小时后，纳米颗粒在裸鼠体内各脏器中的分布结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

(1)将0.65g无水氯化铁溶解在40mL一缩二乙二醇(又名二甘醇，DEG)中，加入0.47g柠檬酸钠(Na₃Cit)，在空气气氛下80℃搅拌1h，待柠檬酸钠完全溶解后再加入1.312g无水醋酸钠粉末，持续搅拌至醋酸钠粉末完全溶解，然后将溶液转移至50mL高压反应釜中，于200℃反应4小时；反应结束后，自然冷却至室温，将产物转移至50mL离心管中8500rpm离心15分钟，弃上清液，用无水乙醇回溶，8500rpm离心15分钟，重复操作3次，然后将沉淀物在60℃烘干，得到超小Fe₃O₄纳米颗粒，即表面柠檬酸钠稳定的超小氧化铁纳米颗粒。

(2)将步骤(1)中超小Fe₃O₄纳米颗粒(30mg)分散于3mL超纯水中，超声10min使其溶解，将EDC(59mg)和NHS(35mg)分别溶于1mL超纯水中，完全溶解后加入到上述超小Fe₃O₄纳米颗粒溶液中反应3小时，活化Fe₃O₄纳米颗粒表面的羧基，得到活化后的超小四氧化三铁纳米颗粒溶液。

(3)将胱胺二盐酸盐(17mg)分散于3mL超纯水中，超声10min使其溶解，然后逐滴加入步骤(2)中活化后的超小四氧化三铁纳米颗粒溶液，室温下反应72h，反应结束后用截留分子量为8000-14000的透析袋透析3天(每次透析所用蒸馏水2L，共换水9次)，真空冷冻干燥，得到团簇的Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒。

实施例2

分别取实施例1中超小Fe₃O₄纳米颗粒和团簇的Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒2mg溶解在2mL超纯水中，得到纳米颗粒悬液，超声均匀，测表面电势和水合粒径，测试结果如表1。测试结果表明：制备得到的超小Fe₃O₄纳米颗粒和团簇的Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒的表面电势分别为-33.2和-21.4mV；水合粒径分别为25.6和134.4nm。从实验结果得出，单分散的超小氧化铁纳米颗粒在交联成团簇之后表面电势升高，并且水动力直径显著增大。表面电势和水合粒径的变化说明团簇的Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒已经形成。

表1

样品电势(mV)水动力直径(nm)多分散系数Fe₃O₄-33.2±1.725.6±1.60.53Fe₃O₄/Cystamine-21.4±2.6134.4±2.60.18

实施例3

分别取实施例1中超小Fe₃O₄纳米颗粒和团簇的Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒5mg进行红外光谱测试(如图1所示)和热重分析(如图2所示)。通过解析红外图谱(如图1)，466-601cm^-1上出现的特征吸收峰为Fe₃O₄上Fe-O的伸缩振动，3451cm^-1附近的峰为水分子上OH的伸缩振动峰，2931cm^-1和2800cm^-1附近的特征吸收峰归属于柠檬酸钠中亚甲基的伸缩振动。同时在1396-1642cm^-1为C＝O的伸缩振动。而曲线b中1736的强吸收峰属于胱胺二盐酸盐的氨基与Fe₃O₄表面的羧基结合后产生的酰胺键。551cm^-1处的特征峰明显增强，应归属于胱胺二盐酸盐当中的S-S键。红外光谱图结果表明Fe₃O₄纳米颗粒成功与胱胺二盐酸盐连接。此外，TGA测试结果(如图2所示)表明，Fe₃O₄的失重量为35.3％，Fe₃O₄/Cystamine的失重量是37.7％，由此定量分析出胱胺二盐酸盐连接到Fe₃O₄纳米颗粒上的质量比为2.4％。

实施例4

称取实施例1中制备的Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒2mg，分别溶于2mL水、PBS、DMEM和FBS当中，监测纳米颗粒分散液在24小时后水动力直径(如图3所示)。实验结果表明，Fe₃O₄/Cystamine溶解在不同介质中的溶液均呈现出澄清的状态，经过24小时静置后并没有出现任何沉淀或聚集的现象，并且纳米颗粒分散在不同介质中的水动力直径在数值上没有明显变化。说明Fe₃O₄/Cystamine具有良好的胶体稳定性。

实施例5

分别取本发明实施例1制备的Fe₃O₄/Cystamine和对照材料(Fe₃O₄纳米颗粒)溶解在100μL超纯水中配制成纳米颗粒悬浮液。各取5μL>3O₄/Cystamine和Fe₃O₄纳米颗粒悬浮液滴在铜网表面，并在空气中晾干后用于TEM测试(如图4所示)。为了观察团簇型Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒在还原性条件下的形貌变化，将谷胱甘肽GSH溶于超纯水中配置成浓度为10mM的还原性溶液，再加入到Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒的水溶液中，取5μL谷胱甘肽处理的Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒在空气中晾干后用于TEM测试(如图4所示)。TEM结果表明：超小Fe₃O₄呈现出单分散的状态并且尺寸比较均一，经过胱胺二盐酸盐的交联作用以后，Fe₃O₄团聚成Fe₃O₄/Cystamine，形成团簇结构并且尺寸变大。而在还原剂GSH的作用下，胱胺二盐酸盐中的S-S断开，团簇的Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒又解散成单分散的超小Fe₃O₄。说明Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒具有团簇型结构，并且对氧化还原条件敏感，可以在还原环境中由聚集态转变为单分散状态。

对照材料(Fe₃O₄纳米颗粒)的具体制备方法为：

将0.65g无水氯化铁溶解在40mL一缩二乙二醇(又名二甘醇，DEG)中，加入0.47g柠檬酸钠(Na₃Cit)，在空气气氛下80℃搅拌1h，待柠檬酸钠完全溶解后再加入1.312g无水醋酸钠粉末，持续搅拌至醋酸钠粉末完全溶解，然后将溶液转移至50mL高压反应釜中，于200℃反应4小时；反应结束后，自然冷却至室温，将产物转移至50mL离心管中8500rpm离心15分钟，弃上清液，用无水乙醇回溶，8500rpm离心15分钟，重复操作3次，然后将沉淀物在60℃烘干，得到超小Fe₃O₄纳米颗粒。

实施例6

弛豫率反映纳米颗粒作为MRI造影剂的效率，可通过不同浓度下的弛豫时间的倒数拟合计算得到。通过ICP-OES测试法测得实施例1中Fe₃O₄/Cystamine和实施例5中Fe₃O₄纳米颗粒中的Fe含量分别为192μg/mg和234μg/mg。再用超纯水配制Fe浓度依次为0.1、0.2、0.4、0.8和1.6mM的水溶液各2mL。为了测试团簇型Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒的还原响应性，将谷胱甘肽GSH溶于超纯水中配置成浓度为10mM的还原性溶液，再加入到Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒的水溶液中，将添加了谷胱甘肽的Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒配制成Fe浓度依次为0.1、0.2、0.4、0.8和1.6mM的水溶液各2mL。分别测定三种材料(Fe₃O₄/Cystamine，Fe₃O₄和添加了谷胱甘肽的Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒)在不同Fe浓度下纳米颗粒的T₁和T₂弛豫时间，将弛豫时间倒数与Fe浓度进行线性拟合(如图5所示)并测试其T₁和T₂加权成像图(如图6所示)。弛豫率测试结果表明，在Fe浓度为0.1-1.6mM范围内，三种材料的T₁和T₂弛豫时间与Fe浓度均具有良好的线性关系。其中，Fe₃O₄的T₁弛豫率较高，r₁为4.3mM^-1s^-1。形成团簇的Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒以后，材料的T₁弛豫率降低(r₁为1.4mM^-1s^-1)，而在GSH条件下，Fe₃O₄/Cystamine重新解散成Fe₃O₄，纳米颗粒的T₁弛豫率也显著升高，达到与单分散Fe₃O₄弛豫率近似的数值。另一方面，Fe₃O₄的T₂弛豫率较低(r₂为7.3mM^-1s^-1)，形成团簇的Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒以后，其T₂弛豫率显著增高至26.4mM^-1s^-1，在GSH条件下，Fe₃O₄/Cystamine重新解散成Fe₃O₄，纳米颗粒的T₂弛豫率也恢复至单分散Fe₃O₄弛豫率的近似数值。此结果说明，Fe₃O₄/Cystamine不仅具有较高的T₂弛豫率，在还原性条件下可以转化为单分散的Fe₃O₄，获得较高的T₁成像性能。Fe₃O₄/Cystamine具有良好的T₁-T₂双模态MR成像性能。从图6中可以看出随着Fe浓度(0.1-1.6mM)的变化，MRI信号呈良好的梯度变化趋势，测试结果说明该材料具有良好的MRI成像能力，可作为MRI分子影像学诊断中的优良T₁-T₂双模态造影剂。

实施例7

以4T1细胞为模型细胞评价制备的Fe₃O₄和Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒对细胞存活的影响。称取实施例5中铁元素的含量为1mg的Fe₃O₄和实施例1中Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒，分散在无菌PBS中配制成铁浓度为1mg/mL的PBS溶液，并用紫外照射过夜杀菌。然后在超净工作台中用无菌PBS配制铁浓度为5、10、25、50和100μg/mL的Fe₃O₄和Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒悬浮液。4T1细胞种植于96孔板后分别与Fe₃O₄和Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒(铁浓度为5、10、25、50和100μg/mL)在37℃下共培养24小时。然后，向培养板孔中加入20μL>3O₄和Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒在实验浓度5～100μg/mL范围内对4T1细胞的活力没有显著性差异，细胞活力都在85％以上。这充分说明实施例5制备的Fe₃O₄和实施例1制备的Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒具有良好的细胞相容性，可以应用到生物体内MRI成像检测。

实施例8

造影剂注入体内时势必会与血液直接接触，而造影剂的介入会不会产生溶血或者其他不良症状便成为科研工作者不得不考虑的重要因素之一。为了确保本发明制备的纳米颗粒能安全地用于体内生物成像诊断，评价了制备得到的Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒的血液相容性。称取实施例1中Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒分散于PBS中配制成铁浓度为1mg/mL的溶液为母液，然后用PBS依次配制铁浓度为10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL的纳米颗粒悬浮液。取适量的人新鲜血液，首先离心(2000rpm，5分钟)去上清液，然后将血红细胞用PBS洗涤5次，收集健康的红细胞并用PBS稀释10倍。再将不同铁浓度的Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒悬浮液分别与红细胞混合，静置1小时后，10000rpm离心1分钟，拍照并测上清液的紫外吸收值(如图8所示)。该过程以超纯水作为阳性对照，PBS作为阴性对照。图8中显示了Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒在给定铁浓度下的溶血性测试结果。通过测量上层清液的吸光度值定量评价纳米材料的溶血性。从测试结果可以看出，在铁浓度达到200μg/mL时，Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒的溶血率仍小于5％，说明实施例1制备的Fe₃O₄/Cystamine具有很好的血液相容性，因而可以安全地用于生物体内MR成像。

实施例9

通过普鲁士蓝染色法检测不同浓度的Fe₃O₄和Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒与4T1细胞共培养4小时后的内吞效果(如图9)。4T1细胞以2×10⁵个/孔种植于12孔板，过夜培养后再分别与实施例1中Fe₃O₄/Cystamine和实施例5中Fe₃O₄纳米颗粒的PBS溶液(Fe浓度为25，50和100μg/mL)在37℃下共培养4小时，并且以PBS处理的细胞作为对照组。共培养后弃去培养基，细胞用PBS洗三次，经过普鲁士蓝染色后用相差显微镜拍照记录，根据细胞染成蓝色的深浅来定性分析细胞吞噬纳米颗粒的多少。在图9中随着Fe浓度的提高，与纳米颗粒共培养的细胞经染色后蓝色逐渐加深，说明4T1细胞对两种纳米颗粒的吞噬均呈浓度依赖性。在相同Fe浓度下，Fe₃O₄/Cystamine处理后的细胞蓝色程度明显深于Fe₃O₄纳米颗粒处理后的细胞，说明4T1细胞对Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒的吞噬效率更高。此外，还采用ICP-OES技术定量分析了平均每个细胞吞噬Fe₃O₄和Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒的量。当不同浓度的纳米颗粒(Fe浓度为5，10，20，50和100μg/mL)PBS溶液与4T1细胞共培养4小时后，用PBS洗涤细胞3次，然后胰酶消化、计数，最后用王水消化细胞，用ICP-OES测试每孔吞噬铁元素的总量，除以细胞数目计算出每个细胞吞噬铁含量，并且以PBS处理的细胞作为对照组。如图10所示，经过PBS处理的细胞内几乎没有铁元素，而Fe₃O₄/Cystamine处理的细胞内随着浓度提高，铁元素的含量明显上升。当铁浓度为100μg/mL时，单个4T1细胞吞噬Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒铁元素量达到6.2pg/cell；而Fe₃O₄处理的细胞内随铁浓度的增加吞噬量增加较少，当铁浓度为100μg/mL时，单个4T1细胞吞噬Fe₃O₄纳米颗粒铁元素仅仅为4.6pg/cell。并且在比较两组材料在相同铁浓度下的吞噬量可以看出，团簇的Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒被4T1细胞的吞噬要明显高于超小Fe₃O₄纳米颗粒。此实验结果说明，Fe₃O₄/Cystamine能够更有效地被4T1细胞内吞，从而为该材料高效地应用于体内MR成像提供了可靠的依据。

实施例10

将实施例1制备的Fe₃O₄/Cystamine配置成Fe浓度为3.2mM的20μL>6个4T1细胞接种到裸鼠体内，二周后待肿瘤直径达到0.6-1cm时，通过小鼠瘤内注射Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒的PBS溶液，使用核磁共振成像仪扫描荷瘤鼠注射材料后的不同时间点(0、5、20分钟)肿瘤部位的MR成像，评价其T₁-T₂双模态MRI造影效果(如图11)。结果表明，在注射Fe₃O₄/Cystamine后，荷瘤鼠肿瘤部位的MR>2成像图明显变暗，并且在注射后5min达到最佳T₂成像效果。而后由于团簇型Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒逐渐解散成单分散的Fe₃O₄，T₂效应逐渐转化为T₁效应。由T₁成像图可以看出，小鼠肿瘤部位的T₁加权MR成像效果在注射后逐渐增强，并且肿瘤T₁成像图在注射后20min时达到最亮。此结果也验证了上述结论，说明团簇型Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒在生物体内肿瘤微环境下可以解散成Fe₃O₄，实现由MR>2成像到T₁成像的效果转换过程。这些结果表明Fe₃O₄/Cystamine具有优良的、可转换的T₁-T₂双模态MRI肿瘤诊断效果，并且能成功应用于生物体内MRI肿瘤诊断。

实施例11

将实施例1制备的Fe₃O₄/Cystamine和实施例5制备的Fe₃O₄按照ICP-OES测定的铁浓度配置成Fe浓度为0.1M的150μL>6个4T1细胞接种到裸鼠体内，二周后待肿瘤直径达到0.6-1cm时，通过尾静脉分别注射Fe₃O₄/Cystamine和Fe₃O₄纳米颗粒PBS溶液来评价肿瘤部位的MR成像效果(如图12)。在注射后0到120分钟内，注射Fe₃O₄的裸鼠肿瘤部位明暗变化并不明显，而注射Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒的裸鼠肿瘤明显变亮，在注射后30分钟时达到最亮。展示出Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒在体内具有优良的T₁加权MR成像效果，其成像效果优于Fe₃O₄纳米颗粒，可能是由于Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒能够更有效地通过增强的肿瘤渗透滞留效应被肿瘤富集导致的。图13是注射后不同时间点肿瘤部位的T₁加权MR成像信噪比值变化，在注射后0到120分钟内，注射Fe₃O₄的裸鼠肿瘤MRI信号值变化不明显，而注射Fe₃O₄/Cystamine的裸鼠肿瘤MRI信号值明显增强，并且在30分钟时信噪比达到最大值。这与图12的结果一致。这些结果说明实施例1制备的Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒具有很好的体内T₁加权MR成像能力，能通过静脉注射实现动物体内T₁加权的MRI诊断。

对小鼠静脉注射团簇结构的Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒和材料Fe₃O₄纳米颗粒，观察其T₂加权MR成像情况，发现两种材料均不表现出的T₂加权的MR成像效果。可能是Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒对生物体氧化还原性条件非常敏感，在体内还原性微环境中很快地分散Fe₃O₄纳米颗粒，从而失去T₂效应导致的。

实施例12

为了研究纳米颗粒的生物组织分布情况，将实施例1制备的Fe₃O₄/Cystamine和实施例5中制备的Fe₃O₄(对照组)分别配置成Fe浓度为0.1M的150μL>6个4T1细胞接种到裸鼠体内，三周后待肿瘤直径达到0.6-1cm时，通过尾静脉分别注射Fe₃O₄和Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒的PBS溶液后，经过12小时，将裸鼠处死并解剖，并且以尾静脉注射PBS的裸鼠作为空白组。取出心、肝、脾、肺、肾、肿瘤称重，剪成2×2mm的碎块，然后用王水消化24小时，再用ICP-OES来测量各个样品的铁元素含量，最后计算出各个重要器官中铁的含量(图14)。从图中可看出在静脉注射实施例1制备的Fe₃O₄/Cystamine纳米颗粒或对照材料Fe₃O₄纳米颗粒12小时之后(Fe浓度为0.1M，150μL)，小鼠的肝和脾中铁的含量较注射前均明显增加，而在其他的器官，比如：心、肺、肾和肿瘤，铁的含量较少。这些结果证明了实施例1制备的纳米颗粒能在小鼠体内正常的代谢清除。