一种中性粒细胞缺失动脉粥样硬化模型小鼠的建立方法

摘要

本发明涉及一种中性粒细胞缺失动脉粥样硬化模型小鼠的建立方法，属于基因工程和遗传修饰技术领域。本发明首次将Gfi1点突变引入到ApoE敲除小鼠基因组，构建出了首例中性粒细胞缺失动脉粥样硬化小鼠遗传模型。通过实验证实，在该模型小鼠中，动脉粥样硬化斑块显著减少，动脉粥样硬化症状明显减轻，表明中性粒细胞缺失动脉粥样硬化模型小鼠构建是成功的，而且中性粒细胞缺失会减轻动脉粥样硬化的病变程度。本发明所获得的中性粒细胞缺失并发动脉粥样硬化的模型小鼠将对于揭开中性粒细胞对动脉粥样硬化的形成与修复的作用及动脉粥样硬化诊断治疗具有十分重要的潜在应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种中性粒细胞缺失动脉粥样硬化模型小鼠的建立方法，属于基因工程和遗传修饰技术领域。

背景技术

心脑血管疾病由于治愈困难、死亡率高，已经成为全球造成死亡人数最多的疾病，而动脉粥样硬化是心脑血管疾病发生的主要原因之一，其发病因素复杂，对健康的危害程度严重，所以有必要对其机理进行深入研究。动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是冠心病、脑梗死、外周血管病的主要原因，但研究其发病机制及临床治疗时缺乏合适的动物模型。

中性粒细胞(Neutrophil，或Neutrophil granulocyte)是血液中血细胞成分之一，具趋化作用、吞噬作用和杀菌作用。动脉粥样硬化是严重威胁人类健康的慢性炎症性疾病，而中性粒细胞是炎症反应的主要细胞群。《原发性高血压患者颈动脉粥样硬化与中性粒细胞/淋巴细胞比值和血清总胆红素水平的关系，南方医科大学，刘东风等》中指出血动脉粥样硬化越严重，患者的中性粒细胞/淋巴细胞比值NLR明显增高，多因素分析也证实了此结果，NLR是原发性高血压患者颈动脉粥样硬化的独立危险因素，提示外周血细胞介导的炎在反应在动脉内膜增厚中起重要作用。

但是目前由于缺乏可以用于研究动脉粥样硬化与中性粒细胞之间相互联系的合适的动物模型，因此中性粒细胞在动脉粥样硬化形成中的作用一直被忽视。研究动脉粥样硬化，需要对动物模型长时间跟踪，而目前已有的中性粒细胞缺失小鼠只能存活数周时间，且需要在SPF环境下加抗生素喂养。目前，在研究动脉粥样硬化形成过程是否需要中性粒细胞，及中性粒细胞是否参与动脉粥样硬化的修复等问题时，还没有有合适的动物模型可以使用。

发明内容

本发明的目的是提供一种中性粒细胞缺失动脉粥样硬化模型小鼠的建立方法，该方法简单、快捷，得到的模型小鼠可以较为方便的用于研究中性粒细胞在动脉粥样硬化形成中的作用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种中性粒细胞缺失动脉粥样硬化模型小鼠的建立方法，包括如下步骤：

1)将Gfi1点突变小鼠与ApoE基因敲除小鼠杂交，获得双基因均为杂合子的F1代小鼠；

2)将所述双基因均为杂合子的F1代小鼠自交，获得F2代小鼠，并对所述F2代小鼠进行基因型鉴定；从F2代小鼠中挑选出Gfi1点突变和ApoE基因敲除均为纯合子的雄鼠、Gfi1点突变为杂合子和ApoE基因敲除为纯合子的雌鼠；

3)将所述雄鼠和雌鼠进行杂交，后代中Gfi1点突变和ApoE基因敲除均为纯合子的小鼠，即为中性粒细胞缺失动脉粥样硬化的模型小鼠。

本发明中所选用的Gfi1点突变小鼠是能长期存活的中性粒细胞缺失小鼠模型，本发明为了明确动脉粥样硬化形成过程是否需要中性粒细胞，及中性粒细胞是否参与动脉粥样硬化的修复两个问题，首次将Gfi1点突变引入到ApoE敲除小鼠基因组，构建出了首例中性粒细胞缺失动脉粥样硬化小鼠遗传模型。本申请中选用Gfi1点突变为杂合子和ApoE基因敲除为纯合子的雌鼠进行繁育，其免疫系统与野生型一致，表现完全正常，可以正常繁育和哺乳，这就保证后续实验可以获得足够数量的Gfi1点突变和ApoE基因敲除均为纯合子的模型小鼠。

步骤2)中采用以下引物对F2代小鼠的Gfi1基因型进行鉴定：

Gfi1-f：GGAGCTACGCTTTTGTCCTG，Gfi1-r：CCTGTGTGGATGAAGGTGTG。该对引物扩增出的正常Gfi1基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，点突变Gfi1基因片段核苷酸序列的第288位由G突变为A。具体的，可使用Sanger测序对Gfi1基因点突变进行检测，使用该方法能方便、快捷的检测出小鼠的Gfi1基因型。如第288位核苷酸仅为G，则为正常基因；如第288位核苷酸仅为A，则为点突变纯合子；第288位核苷酸为G/A，则为点突变杂合子。

步骤2)中采用以下引物对F2代小鼠的ApoE基因型进行鉴定：

ApoE-1：GCCTAGCCGAGGGAGAGCCG，

ApoE-2：TGTGACTTGGGAGCTCTGCAGC，

ApoE-3：GCCGCCCCGACTGCATCT，这三条引物为购买ApoE小鼠时JacksonLaboratory实验室提供。

其中ApoE-1为共用引物，其中ApoE-1和ApoE-2扩增出的片段如SEQ ID NO.7所示，全长155bp；ApoE-1和ApoE-3扩增出的片段如SEQ ID NO.8所示全长245bp。可使用凝胶电泳对ApoE基因进行检测。如扩增产物仅为155bp的一条带，则为正常基因；如扩增产物仅为245bp的一条带，则为敲除基因纯合子；如扩增产物有两条带，一条为155bp，另一条为245bp，则为敲除基因杂合子。

具体的，步骤2)中在对F2代小鼠进行基因型鉴定后，采用流式细胞术对F2代小鼠的免疫表型进行分析。所述抗体为CD4、CD5、CD8、CD11B、CD11C、CD19、CD25、CD44、CD45、LY6G和NK1.1。更为具体的，首先配制抗体混合物，然后吸取40μl新鲜血液，加入10μl抗体混合物，充分震荡混匀以后，置于4℃冰箱避光孵育30min，孵育结束以后，加入400μl红细胞裂解液，充分震荡混匀以后，置于室温避光孵育10min，反应结束，然后采用流式细胞仪进行检测。采用该方法可以对F2代小鼠的中性粒细胞是否缺失进行进一步确定，可以进一步筛选出中性粒细胞完全缺失的小鼠个体。

在所述模型小鼠的繁育过程中，均选择Gfi1点突变和ApoE基因敲除均为纯合子的雄鼠、Gfi1点突变为杂合子和ApoE基因敲除为纯合子的雌鼠进行繁殖后代。雌鼠免疫系统完全正常，不会影响繁育，这样可以获得足够多的子代小鼠，而且其中多达50％的子代均为纯合子，保障了后续实验的顺利开展。

本发明首次将导致小鼠中性粒细胞缺失但是能正常存活的的小鼠突变位点Gfi1^C318Y通过杂交引入ApoE基因缺失遗传背景的动脉粥样硬化小鼠模型(ApoE^-/-)，经过杂交和筛选，获得了双基因缺失的纯合子小鼠ApoE^-/-Gfi1^C318Y/C318Y，通过实验证实，在ApoE^-/-Gfi1^C318Y/C318Y小鼠中，动脉粥样硬化症状明显减轻，表明中性粒细胞缺失动脉粥样硬化模型小鼠构建成功。

上述的建立方法得到的中性粒细胞缺失动脉粥样硬化模型小鼠在研究中性粒细胞缺失与动脉粥样硬化的相互作用的应用。具体的，所述中性粒细胞缺失动脉粥样硬化模型小鼠在研究中性粒细胞对动脉粥样硬化的形成与修复的作用中的应用。或者所述中性粒细胞缺失动脉粥样硬化模型小鼠在研究动脉粥样硬化诊断治疗方法中的应用。

本发明中对获得的中性粒细胞缺失并发动脉粥样硬化的模型小鼠进行进一步的实验研究，结果表明中性粒细胞缺失能显著减轻动脉粥样硬化斑块形成。本发明所获得的中性粒细胞缺失并发动脉粥样硬化的模型小鼠将对于揭开中性粒细胞对动脉粥样硬化的形成与修复的作用及动脉粥样硬化诊断治疗具有十分重要的潜在应用价值。

本发明的有益效果如下：

1.首次获得了中性粒细胞缺失且能正常存活的动脉粥样硬化模型小鼠；

2.首次提出了在针对具有严重免疫缺陷的小鼠繁育过程中，使用具有免疫缺陷但是能正常繁育的雄鼠作为父本(基因型为ApoE^-/-Gfi1^C318Y/C318Y)，使用免疫表型正常的杂合子小鼠为母本(基因型为ApoE^-/-Gfi1^+/C318Y)，进行杂交，这样可以保证繁育能顺利进行的同时，也可以获得足够多的具有免疫缺陷的纯合子小鼠(基因型为ApoE^-/-Gfi1^C318Y/C318Y)来用于后续实验，这为具有类似免疫缺陷小鼠的繁育提供了新的思路；

3.首次确定了中性粒细胞和动脉粥样硬化的关系，即中性粒细胞缺失会显著减轻动脉粥样硬化疾病症状，这为深入开展动脉粥样硬化的研究开启了暂新的方向，也为动脉粥样硬化的临床治疗提供了更多的选择，具有非常重要的理论和实际意义。

附图说明

图1为F2代小鼠Gfi1点突变位点测序验证结果图；

图2为F2代小鼠ApoE基因型检测结果图；

图3为性粒细胞缺失的动脉粥样硬化模型小鼠的免疫表型结果图；

图4为模型小鼠和对照小鼠饲喂高脂饲料12周以后血清生化指标检测结果图；

图5为模型小鼠和对照小鼠饲喂高脂饲料12周以后心脏冰冻切片油红O和H&E染色结果图；

图6为模型小鼠和对照小鼠饲喂高脂饲料12周以后主动脉油红O染色结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。以下实施例及试验例中Gfi1点突变小鼠(基因型为Gfi1^C318Y/C318Y)由法国院士Bernard>-/-)由美国Jackson>

实施例1

本实施例中的中性粒细胞缺失动脉粥样硬化模型小鼠的建立方法，包括如下步骤：

1)将Gfi1点突变小鼠(基因型为Gfi1^C318Y/C318Y)与ApoE基因敲除小鼠(基因型为ApoE^-/-)进行杂交，获得F1代小鼠，此F1代小鼠双基因位点均为杂合子(基因型为ApoE^+/-Gfi1^+/C318Y)。

2)将F1代双基因位点均为杂合子的小鼠自交，获得F2代小鼠。

A、利用sanger测序，可以挑选出Gfi1点突变位点为杂合子和纯合子的小鼠，检测引物序列为：Gfi1-f：GGAGCTACGCTTTTGTCCTG(如SEQ ID NO.1所示)，Gfi1-r：CCTGTGTGGATGAAGGTGTG(如SEQ ID NO.2所示)，扩增产物大小为429bp。

PCR体系为：(Vazyme，P111)2*Taq Master PCR MIX：10μL，Gfi1-F(5μM)和Gfi1-R(5μM)各0.5μL；基因组DNA：10ng；补充ddH₂O至总体积20μL；程序为：95℃，5min；95℃，30s，60℃，30s，72℃，40s；72℃，10min；PCR循环数为35。

检测结果如SEQ ID NO.3所示，其中第288位核苷酸仅为G，则为正常基因(WT)；第288位核苷酸仅为A，则为点突变纯合子(Gfi1^C318Y/C318Y)；288位核苷酸为G/A，则为点突变杂合子(Gfi1^+/C318Y)。

B、利用1.5％的琼脂糖凝胶电泳，可以挑选出ApoE基因位点为纯合子的小鼠，检测引物序列为：ApoE-1：GCC TAG CCG AGG GAG AGC CG(如SEQ ID NO.4所示)，ApoE-2：TGTGAC TTG GGA GCT CTG CAG C(如SEQ ID NO.5所示)，ApoE-3：GCC GCC CCG ACT GCA TCT(如SEQ ID NO.6所示)。

PCR体系为：(Vazyme，P111)2*Taq Master PCR MIX：10μL，Gfi1-F(5μM)和Gfi1-R(5μM)各0.5μL；基因组DNA：10ng；补充ddH₂O至总体积20μL；程序为：95℃，5min；95℃，30s，60℃，30s，72℃，40s；72℃，10min；PCR循环数为35。

检测结果如图2所示，其中扩增产物仅为155bp的一条带，则为正常基因(WT)；扩增产物仅为245bp的一条带，则为敲除基因纯合子(ApoE^-/-)；扩增产物有两条带，一条为155bp，另一条为245bp，则为敲除基因杂合子(ApoE^+/-)。

C、利用流式细胞术，可以进一步检测并挑选获得中性粒细胞缺失的纯合子小鼠，检测使用流失细胞仪型号为CANTO II(BD,USA)，检测使用抗体组合见表1。

步骤如下：首先配制抗体混合物，然后吸取40μl新鲜血液，加入10μl抗体混合物，充分震荡混匀以后，置于4℃冰箱避光孵育30min，孵育结束以后，加入400μl红细胞裂解液，充分震荡混匀以后，置于室温避光孵育10min，反应结束，然后采用流式细胞仪进行检测。

表1流式细胞术所使用抗体名称及品牌

检测结果如图3所示，可以看到，CD11B⁺LY6G⁺阳性细胞(即中性粒细胞，图中方框标注部分)已经消失，说明构建获得的模型小鼠中成熟的中性粒细胞已经完全缺失。

3)因为Gfi1点突变位点为纯合子的小鼠(基因型为Gfi1^C318Y/C318Y)缺失中性粒细胞，具有严重的免疫缺陷，繁殖力低下，如果使用其作为亲本进行繁育，则很难获得足够多的双基因纯合子小鼠用于实验，所以本发明从F2代小鼠中挑选出Gfi1点突变和ApoE基因均为纯合子的雄鼠(基因型为ApoE^-/-Gfi1^C318Y/C318Y，具有免疫缺陷，但是可以正常进行交配繁育)、Gfi1点突变为杂合和ApoE基因为纯合子的雌鼠(基因型为ApoE^-/-Gfi1^+/C318Y，具有正常的中性粒细胞，无免疫缺陷，健康状态良好)进行杂交，后代即可以获得Gfi1点突变和ApoE基因均为纯合子的小鼠(基因型为ApoE^-/-Gfi1^C318Y/C318Y)，用于后续实验，此小鼠即为一种新的中性粒细胞缺失动脉粥样硬化小鼠模型。

通过对F2小鼠进行基因型检测(图1和图2)和免疫表型分析(图3)，成功挑选获得双基因缺失(基因型为ApoE^-/-Gfi1^C318Y/C318Y)而且中性粒细胞缺失的子代小鼠。在后续的模型小鼠的繁殖过程中，均选用Gfi1点突变和ApoE基因敲除均为纯合子的雄鼠、Gfi1点突变为杂合子和ApoE基因敲除为纯合子的雌鼠进行繁殖后代。

试验例1

将实施例1中获得的中性粒细胞缺失动脉粥样硬化小鼠模型(基因型为ApoE^-/-Gfi1^C318Y/C318Y)和对照小鼠(基因型为ApoE^-/-)进行高脂饲喂。

对中性粒细胞缺失动脉粥样硬化模型小鼠(基因型为ApoE^-/-Gfi1^C318Y/C318Y)和对照小鼠(基因型为ApoE^-/-)进行高脂饲料喂养，过程中每周监测其体重变化，注意在每一周的相同时间点进行称重。结果发现，中性粒细胞缺失动脉粥样硬化模型小鼠与对照小鼠相比体重没有显著差异。

对中性粒细胞缺失动脉粥样硬化模型小鼠(基因型为ApoE^-/-Gfi1^C318Y/C318Y)和对照小鼠(基因型为ApoE^-/-)进行高脂饲料喂养12周后，获取其血清，测定血清总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)等生化指标(使用仪器为ADVIA2400，SIEMENS)，并对数据进行统计分析。

统计结果：中性粒细胞缺失动脉粥样硬化模型小鼠与对照小鼠相比血清生化指标没有显著差异(如图4所示)。

试验例2

对中性粒细胞缺失动脉粥样硬化模型小鼠(基因型为ApoE^-/-Gfi1^C318Y/C318Y)和对照小鼠(基因型为ApoE^-/-)进行高脂饲料喂养12周后，获取其心脏组织，进行固定(4％多聚甲醛，过夜固定)和包埋(使用OCT进行包埋)以后，冰冻切片(10um)，然后进行油红O染色和H&E染色，统计斑块面积，并对数据进行统计分析。

油红O染色及H&E染色结果如图5-A所示，图5-A为对照组ApoE^-/-小鼠及实验组ApoE^-/-Gfi1^C318Y/C318Y心脏部分样本示意图。由此可以看出实验组小鼠心脏斑块面积显著减小；斑块面积统计结果如图5-B所示，通过对其饲喂高脂饲料诱导动脉粥样硬化，发现中性粒细胞缺失动脉粥样硬化模型小鼠(ApoE^-/-Gfi1^C318Y/C318Y)与动脉粥样硬化模型小鼠(ApoE^-/-)相比，斑块面积有显著减少，结果表明中性粒细胞缺失会减轻动脉粥样硬化的病变程度。

本发明的建立方法得到的中性粒细胞缺失动脉粥样硬化模型小鼠可以用于研究中性粒细胞对动脉粥样硬化的形成与修复的作用。本发明的建立方法得到的中性粒细胞缺失动脉粥样硬化模型小鼠也可以用于研究动脉粥样硬化诊断治疗方法。

试验例3

对中性粒细胞缺失动脉粥样硬化模型小鼠(基因型为ApoE^-/-Gfi1^C318Y/C318Y)和对照小鼠(基因型为ApoE^-/-)进行高脂饲料喂养12周后，获取其主动脉组织，展开使用4％多聚甲醛进行固定以后，进行油红O染色，统计斑块面积，并对数据进行统计分析。

油红O染色结果如图6-A所示，图6-A为对照组ApoE^-/-小鼠及实验组ApoE^-/-Gfi1^C318Y/C318Y小鼠心脏部分样本示意图，由此可以看出实验组主动脉斑块面积显著减小；斑块面积统计结果如图6-B所示，通过对其饲喂高脂饲料诱导动脉粥样硬化，同样的，发现中性粒细胞缺失动脉粥样硬化模型小鼠(ApoE^-/-Gfi1^C318Y/C318Y)的斑块面积显著小于动脉粥样硬化模型小鼠(ApoE^-/-)。

从以上实验结果可以看出，与野生型对照相比，在Gfi1和ApoE双基因纯合子的小鼠中，动脉粥样斑块显著减少，动脉粥样硬化症状明显减轻，表明中性粒细胞缺失动脉粥样硬化模型小鼠构建是成功的，而且中性粒细胞缺失会减轻动脉粥样硬化的病变程度。

<110> 新乡医学院

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<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Gfi1-f

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ggagctacgc ttttgtcctg 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Gfi1-r

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cctgtgtgga tgaaggtgtg 20

<211> 429

<212> DNA

<213> 小鼠

<221> Gfi1基因片段

<400> 3

ggagctacgc ttttgtcctg gggtgtggag ggttgtggct gtaaagtgtt ttagtagtta 60

atcagtaggt gttgaatgat ggggtggagg gagagaggag agggtttctg gctctgggag 120

atcagtagat gttggagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 180

gagagagaga gagcacaagc gccaaggagg ctgctgaagg agcggcacat ttcttcctcc 240

tctcttcctc tctgctctgc aggaacgcag ctttgactgt aagatctgtg gcaagagctt 300

caagaggtca tccacgctgt ccacacatct gctcattcac tcggacaccc ggccctatcc 360

ctgtcagtac tgtggcaaaa gattccacca gaagtcagat atgaagaaac acaccttcat 420

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