法律状态公告日
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法律状态
2022-07-12
专利实施许可合同备案的生效 IPC(主分类):C07J17/00 专利申请号:2018100336862 专利号:ZL2018100336862 合同备案号:X2022530000005 让与人:云南省药物研究所 受让人:云南白药集团股份有限公司 发明名称:三七中三种具有抗肿瘤活性的化合物、制备方法和药物用途 申请日:20180115 申请公布日:20180706 授权公告日:20200804 许可种类:普通许可 备案日期:20220624
专利实施许可合同备案的生效、变更及注销
2020-08-04
授权
授权
2018-07-31
实质审查的生效 IPC(主分类):C07J17/00 申请日:20180115
实质审查的生效
2018-07-06
公开
公开
技术领域
本发明涉及中药化学及医药技术领域,具体涉及从三七中分离鉴定的三种新化合物及其制备方法和在抗肿瘤领域中的应用。
背景技术
三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)为五加科植物三七的干燥根,别名山漆、金不换、田三七、田漆、田七,主产云南、广西、四川等地。三七用于治疗疾病有悠久的历史,在《本草纲目》以前的《医门秘旨》、《跌损妙方》中已有记载。其主要成份有三七素(三七氨酸)、三七总皂苷(PNS)、黄酮、挥发油、氨基酸、糖类等有效成分。
三七总皂苷是三七的主要有效成分之一,在维持血液循环、改善心肌缺血、抗心律失常、抗休克、镇静、提高智力、抗衰老、抗氧化、抗细胞增殖和抗肿瘤等方面均显示出一定的药理作用。目前已报道的三七皂苷的种类已超过100种,但仍有部分皂苷未发现,三七总皂苷作为活性先导化合物的来源仍有很大的研究价值。
临床用于心脑血管疾病类的药品血塞通注射液、血栓通注射液、三七总甙片、三七总甙胶囊等均以三七总皂苷为主要成分,但对于其微量组成研究甚少,而微量成分的研究,对于质量控制和指导临床安全用药具有重要的意义。因此本发明对三七皂苷的微量成分及其制备方法和抗肿瘤活性进行了研究。
发明内容
本发明旨在提供从三七中分离的三种新化合物。
本发明的另一目的是提供三个化合物的制备方法。
本发明的另一目的是上述新化合物在制备抗肿瘤的药物和保健品方面的应用。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:
具有抗肿瘤活性的三七皂苷化合物,结构式如下:
化合物1:
式Ⅰ的化合物C36H60O9(3β,6α,12β,22-tetrahydroxy-dammar-20(21),24-diene-6-O-β-D-glucopyranoside)
化合物2:
式Ⅱ的化合物C36H60O10(22-hydroperoxyl-3β,6α,12β-trihydroxy-dammar-20(21),24-diene-6-O-β-D-glucopyranoside)
化合物3:
式Ⅲ的化合物C36H60O9(3β,6α,12β,24-tetrahydroxy-dammar-20(21),25-diene-6-O-β-D-glucopyranoside)
所述的三种新化合物均由三七中分离得到。
本发明所述的三种新化合物的制备方法,其步骤如下:步骤一:将干燥后得三七根用乙醇-水连续提取三次,合并滤液减压浓缩,得乙醇提取浸膏;
步骤二:将步骤一中浓缩浸膏用蒸馏水溶解后上大孔吸附树脂进行粗分离,用乙醇-水梯度洗脱,将洗脱液减压浓缩得浸膏;
步骤三:将步骤二中的浓缩浸膏进行硅胶柱层析分离,依次用氯仿-甲醇梯度洗脱,根据薄层色谱检测结果进行合并,得到8个洗脱段(Fr.B1-Fr.B8);
步骤四:将步骤三中Fr.B5利用ODS柱色谱以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱,分离得到10个洗脱段(Fr.B5-1-Fr.B5-10);
步骤五:将步骤四中Fr.B5-7部分利用半制备液相色谱以乙腈-水(27:73)为流动相分离得到本发明所述新化合物1;
步骤六:将步骤三中的Fr.B1段(10g)依次用氯仿-甲醇进行硅胶柱层析梯度洗脱,并通过薄层色谱将洗脱流份分为5个部分(Fr.B1-1-Fr.B1-5);
步骤七:将步骤六中Fr.B1-2利用ODS柱色谱用甲醇-水洗脱得到本发明所述新化合物2;
步骤八:将步骤六中Fr.B1-3利用硅胶柱色谱以氯仿-甲醇梯度洗脱分离得到3个部分(Fr.B1-3a-Fr.B1-3c);
步骤九:将步骤八中的流份进一步利用半制备液相色谱以乙腈-水(28:72)分离得到本发明所述新化合物3。
本发明实施例提供了所述的3种新化合物的体外抗肿瘤活性。
有益效果:本发明提供的具有肝癌、肺癌、乳腺癌细胞的三七皂苷化合物与现有技术相比具有以下优点:
本发明通过对三七根化学成分进行系统深入研究,经过波谱和质谱数据分析表明从三七根中分离得到3个新三七皂苷化合物。体外抗肿瘤活性研究表明,本发明提供的三七皂苷化合物对人肝癌细胞株、人肺癌细胞株、人乳腺癌细胞株具有很强的抑制作用,可开发成为新的抗肿瘤药物或保健食品。另外本发明提供的制备方法,根据三七根所含化学成分的结构性质,进行科学分离纯化,采用大孔树脂,硅胶柱和凝胶柱色谱和反向ODS柱连用,进行系统分离纯化,得到最佳的制备工艺,所得化合物纯度高。
附图说明:
附图:化合物1-3的HMBC相关谱
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明,但不作为对本发明的限制。
实施例1新化合物的制备方法
步骤一:取干燥的三七根10kg粉碎,用70%的乙醇回流提取3次,料液比大致为1:10,每次回流时间2h,在65℃下减压浓缩,得浸膏1.6kg;
步骤二:将步骤一中浓缩浸膏用蒸馏水溶解后上大孔吸附树脂(型号D101),树脂量10.5kg,依次用10%、60%和90%乙醇-水以五倍柱体积洗脱。将60%乙醇段洗脱液65℃减压浓缩;
步骤三:将步骤二中的浓缩浸膏进行硅胶柱层析分离,硅胶80~100目1:1拌样,硅胶200~300目1:20上样。依次用氯仿-甲醇(50:1→40:1→30:1→20:1→10:1→8:1→6:1→4:1)梯度洗脱,各5个柱体积,经薄层色谱检测合并相同洗脱流份,水浴45℃减压浓缩蒸干,共分离得到8个洗脱段(Fr.B1-Fr.B8);
步骤四:将步骤三中Fr.B5(23.5g)所得物经预处理ODS中压柱层析分离,用甲醇-水(40:60→45:55→50:50→55:45→60:40→65:35→70:30→75:25→80:20→100:0)为流动相进行梯度洗脱,共分离得到10个洗脱段(Fr.B5-1-Fr.B5-10);
步骤五:将步骤四中Fr.B5-7部分利用半制备液相色谱进行制备,色谱条件:色谱柱:YMC-pack C18(10×250mm,5um)流动相A:27%乙腈、流动相B:73%水检测波长:203nm流速:3ml/min进样量:100-200μL。收集保留时间27min的馏分,50℃水浴减压浓缩分离得到新化合物1;
步骤六:将步骤三中的Fr.B1段(10g)进行硅胶柱层析分离,硅胶80~100目1:1拌样,硅胶200~300目1:20上样。依次用氯仿-甲醇(50:1→40:1→30:1→20:1→10:1)进行洗脱,经薄层色谱检测将流份分为5个部分(Fr.B1-1-Fr.B1-5);
步骤七:将步骤六中Fr.B1-2所得物经预处理的ODS中压柱层析分离,用甲醇-水(70:30→75:25→80:20→100:0)为流动相进行梯度洗脱,其中80%甲醇-水流份60℃水浴减压浓缩回收浸膏,进行二次ODS柱分离,得到新化合物2;
步骤八:将步骤六中Fr.B1-3进行硅胶柱色谱分离,硅胶80~100目1:1拌样,硅胶200~300目1:20上样。依次用氯仿-甲醇(15:1→14:1→13:1)洗脱,经薄层色谱检测合并相同流份,水浴45℃减压浓缩,分离得到3个部分(Fr.B1-3a-Fr.B1-3c);
步骤九:将步骤八中的流份进一步利用半制备液相色谱进行制备分离,色谱条件:色谱柱:YMC-pack C18(10×250mm,5um)流动相A:28%乙腈、流动相B:72%水检测波长:203nm流速:3ml/min进样量:100-200uml。收集保留时间22min的馏分,50℃水浴减压浓缩分离得到新化合物3。
本发明所述新化合物的结构鉴定
化合物1,白色无定形粉末,分子式为C36H60O9,高分辨质谱m/z>+(计算值C36H60O9Na,659.4135)。13C>C>1H>H>H>H>C>H>C111.2(C-20),122.4(C-24)和40.2(C-17)相关,δH>C>H>C>
化合物2,白的无定形粉末,分子式C36H60O10,高分辨质谱给出分子量m/z>+(计算值C36H60O10Na675.4084)。13C>1H>H>
化合物3,白的无定形粉末,分子式C36H60O9,高分辨质谱给出分子量m/z>+(计算值C36H60O9Na>13C>1H>H>
表1本发明所述的新化合物1-3的核磁数据
实施例2新化合物对肿瘤细胞的生长抑制作用研究
1.实验材料
1.1实验仪器
SQP型电子天平,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司生产;DMIL-LED型荧光倒置相差显微镜,德国莱卡公司生产;AC2-6S1型二级生物安全柜,新加坡ESCO公司生产;DW-86L486型超低温冰箱,中国海尔公司生产;CCL-170A-8型CO2恒温培养箱,新加坡ESCO公司生产;3H12RI型高速冷冻离心机,湖南赫西仪器装备有限公司生产;Multiskan>
1.2实验试剂
二甲基亚砜(DMSO),Sigma公司生产,批号:BCBN8235V;顺铂注射液(DDP),江苏豪森药业股份有限公司生产,批号:141203;十二烷基硫酸钠(SDS),德国Sigma公司生产,批号:L-5750;盐酸,重庆川东化工(集团)有限公司,批号:20150901;异丁醇,广东光华科技股份有限公司,批号:20130416;胎牛血清(FBS),Gibco公司生产,批号:1739464;RPMI 1640培养液,Gibco公司生产,批号:8117030;DMEM培养液(1×),Gibco公司生产,批号:1848410;噻唑蓝(MTT),Sigma公司生产,批号:MKBS4732V;胰蛋白酶(0.25%Trypsin-EDTA,1×),Gibco公司生产,批号:1697785;磷酸盐缓冲液(PBS,1×),Gibco公司生产,批号:8116525。
1.3细胞株
HepG-2人肝癌细胞株、NCI-H460人肺癌细胞株、MCF-7人乳腺癌细胞株,均购自中国科学院昆明动物所细胞库,密封保存于本研究室液氮容器中。
2.试验方法
以改良MTT法测定受试样品对人肿瘤细胞株增殖的影响。取处于对数生长期的人肿瘤细胞株,消化、离心收集细胞,显微镜下计数后调细胞浓度为5×104个/mL,加入96孔培养板中,90μL/孔,细胞培养24h待细胞贴壁后加入受试样品。样品设5个受试浓度(样品的终浓度为100、50、25、12.5和6.25μg/mL),每个浓度设3个平行孔,10μL/孔;溶媒对照为0.2%和0.02%等体积DMSO;阳性对照为DDP,终浓度为8、4、2、1和0.5μg/mL。加药后细胞在37℃、5%CO2培养箱中孵育72h,然后加入MTT(5mg/mL),20μL/孔,继续培养4h后加入三联液100μL/孔。继续置37℃、5%CO2培养箱孵育12h后,用酶标仪在570nm波长下测定各孔的OD值,根据OD值进行结果计算。
按下列公式计算细胞增殖抑制率:抑制率(%)=(OD对照孔-OD给药孔)/OD对照孔×100%。
3.实验结果
药理实验结果如表2所示,结果表明本发明所述来自中药三七中的新化合物1-3均具有显著的细胞毒活性,因为常规抗肿瘤化合物的体外活性筛选是以化合物的细胞毒活性来体现的,所以本发明化合物具有抗肿瘤活性,可以用来制备抗肿瘤药物或保健品。
表2本发明所述的新化合物1-3对肿瘤细胞的抑制作用
机译: 具有抗肿瘤活性的新化合物,制备方法(及其药物组合物)
机译: 具有抗肿瘤活性的新化合物,制备方法(及其药物组合物)
机译: 具有抗肿瘤活性的新化合物,其制备方法及其药物组合物。