一种分离松材线虫体内病毒的方法

摘要

本发明公开了一种分离松材线虫体内病毒的方法，包括：大量培养松材线虫；收集松材线虫；将松材线虫虫液反复冻融后用玻璃匀浆器匀浆；用细菌过滤器将松材线虫匀浆过滤；低速离心，获得粗提液，再用PEG进行沉淀，然后用蔗糖密度梯度超速离心，分层收集样品，再去蔗糖，即可获得松材线虫病毒粗提物。本发明的分离松材线虫体内病毒的方法，利用反复冻融裂解细胞，再经匀浆器匀浆，将病毒颗粒从松材线虫体内释放出来，采用细菌过滤器过滤和低速离心，去除大的细胞碎片，通过PEG沉淀收集病毒沉淀物，进而用蔗糖密度梯度超速离心，分层收集离心产物，再去蔗糖后获得松材线虫病毒粗提物，是一种简易且成功的方法。

说明书

技术领域

本发明属于松材线虫体内病毒技术领域，具体涉及一种分离松材线虫体内病毒的方法。

背景技术

松材线虫病（又名松树萎蔫病）是由松材线虫（Bursaphelenchu>）引起的松树毁灭性病害。该病害最早于1905年在日本发现，导致当地松树严重死亡，日本松林遭受了毁灭性破坏。松材线虫病于20世纪80年代传播到邻近的东亚国家，包括中国和韩国。我国于1982年，在南京紫金山林区首次发现松材线虫病，在过去短短的30多年时间里，该病已蔓延到江苏、安徽、浙江、广东、广西、福建、江西、湖南、湖北、四川、重庆、贵州、云南、山东、河南、陕西和辽宁共17个省区（直辖市）。韩国于1988年发现松材线虫。尽管许多国家都将松材线虫列为检疫对象，加强监测防控，松材线虫病依然不断扩散蔓延。1999年，欧洲国家葡萄牙首次报道发现松材线虫。2011年，松材线虫病传入西班牙。因此，松材线虫引发的松树萎蔫病已经成为全球性病害，对南北半球林产品国际贸易构成了潜在的威胁。鉴于该病的危险性，各国学者对其进行了系统和深入的研究，但致病机理至今尚未完全弄清。材线虫病的发生涉及寄主、松材线虫、媒介天牛、真菌和细菌等多个生物因子。

在1972年Mamiya et al.从感病松树内分离出线虫之前，天牛、小蠹虫等蛀干害虫一直是被怀疑的对象。现今，天牛-松材线虫-松树三者的关系已十分清楚。自从Mamiya确立了松材线虫与病害发生之间的关系，松材线虫在该病害中的作用以及感病寄主的生理响应机制成为研究的热点。早期研究发现感病松树的生理和组织病理学变化往往在线虫数量快速增长之前，因此有学者推测其他因素参与了该病害的病理学过程。后来的研究发现，松材线虫携带大量伴生微生物类群。从此，真菌和细菌引起了人们的高度关注。

有关真菌与松材线虫的关系，目前结论比较明晰。真菌在松材线虫病的后期阶段松树细胞死亡后可作为线虫的饲料维持线虫正常的种群繁衍，真菌也可以通过松材线虫及其传播媒介在天牛羽化阶段实现真菌生存领域的扩展和种群的扩张，二者形成互惠关系。

Oku等人(1980) 首次提出松树萎蔫与松材线虫携带细菌的代谢产物有关。Tada(1981) 肯定了从松材线虫上分离到的细菌具有产生毒素的能力。Kusunoki（1987）用扫描电子显微镜和透视型电子显微镜观察苗木组织，跟踪接种松材线虫引起发病的病征的发展过程，确认在组织被破坏的轨迹上有细菌分布。Kawazu和Kaneko（1997）用无菌的松材线虫(OKD-3 )接种无菌赤松苗（约30天苗龄），在无菌的条件下松苗不死亡，而带细菌的松材线虫在同样条件下，可导致无菌松苗萎蔫枯死。经鉴定，从松材线虫的体表分离到的这些细菌主要是芽孢杆菌，鉴定出了3个种，有蜡状芽孢杆菌（Bacillus>）、枯草芽孢杆菌（B.>subtilis）和巨大芽孢杆菌(B.>)。赵博光等（2000）通过电子显微镜观察到线虫体表携带大量的细菌。郭道森等（2002）报道来源于感病黑松病组织中的松材线虫和灰葡萄孢菌丝上培养的松材线虫携带活细菌的数量平均分别为2.9×102 个/条和3.0×103个/条。袁为敏等报道松材线虫体内亦存在细菌。世界各国学者对不同地理来源、不同寄主来源及不同致病力的松材线虫虫株进行了细菌分离(王慧利等，2004；谈家金等，2008；巨云为等，2008；Proença et>, 2010；田雪亮等，2010；Vicente et>, 2012；Wu et>,2013)，但迄今尚未发现松材线虫携带有与线虫严格共生的细菌类群或优势种群。

有关线虫体内病毒的研究报道亦较少。2011年，Félix等首次报道在秀丽线虫及其近亲 C.>体内发现了2种诺达病毒。通过荧光免疫及原位杂交手段，发现这些病毒存在于秀丽线虫肠道细胞中（Franz, et>., 2014）。继Félix后，Bekal et>.（2011）采用高通量测序技术等手段在大豆胞囊线虫（Heterodera>）体内发现了4种病毒。2014年，Bekal et>.又报道在大豆胞囊线虫中发现一种新病毒，黄病毒（flavivirus）。这些研究结果为进一步研究病毒对线虫生物学特性的影响、病毒传播的策略、病毒致病机制等奠定了基础。有关松材线虫病毒的研究鲜有报道。最近，Cotton等（2016）在松材线虫中发现一种以逆转座子形式整合到其基因组中的新型内源性病毒序列，这种内源性病毒序列与以往报道过的线虫诺达病毒处于不同的进化分支上；而且，这种内源性病毒序列存在于松材线虫强致病力虫株Ka4C1、S10-P3、S10-P9和T4基因组中，而不存在于弱致病力虫株OKD-1、C14-5和拟松材线虫基因组中。研究者进一步采用PEG沉淀法对松材线虫体内病毒进行了纯化，但是，透射电镜下并未观察到松材线虫匀浆中存在病毒颗粒。目前尚无有关成功分离线虫体内病毒的方法报道。

综上所述，在松材线虫病发生以来的100多年里，研究者对影响该病发生发展所涉及的寄主松树、松材线虫、媒介昆虫、真菌和细菌等多种生物因子进行了广泛而深入的研究，而与病毒相关的研究报道鲜见报道。病毒是否存在于松材线虫体内，它们如何在线虫体内传播，它们的存在是否与松材线虫的致病力相关，目前尚不得而知。因此，松材线虫携带病毒是亟待加强的研究领域。

发明内容

发明目的：针对现有研究中存在的上述不足，本发明的目的是提供一种分离松材线虫体内病毒的方法，以实现为松材线虫病相关研究提供一种可以获得纯病毒的方法。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种分离松材线虫体内病毒的方法，包括以下步骤：

1）制备PDA培养基平板，将灰葡萄孢接种到PDA培养基平板，25℃条件下培养5~7d至菌丝长满平板，将松材线虫接种于长满灰葡萄孢菌丝的平板， 25℃，培养5~7 d，采用贝尔曼漏斗法分离松材线虫，将松材线虫收集于无菌的15 mL离心管中，3500 r/min，离心3分钟，去上清，再用0.1 M的磷酸缓冲液清洗，离心，去上清，重复3次，收集10 mL松材线虫虫液备用；

2）将步骤1）收集的松材线虫虫液置于-20~-80 ℃冷冻，过夜；将冷冻过夜的松材线虫虫液取出于4 ℃解冻，反复至少3次；

3）将步骤2）反复冻融的松材线虫，分批置于玻璃匀浆器中，无菌条件下，冰上研磨；

4）将步骤3）研磨的松材线虫匀浆，于无菌条件下先用0.4 µm的过滤器粗过滤，滤液收集于无菌的离心管中，将0.4 µm过滤器粗过滤的滤液，再用0.2 µm细菌过滤器过滤，去除大的细胞碎片；

5）将步骤4）获得的滤液，6000 r/min，4℃，离心10分钟，取上清，得到液体A；

6）将步骤5）获得的液体A取出，加入PEG6000调节浓度至6%，氯化钠0.125M，4℃以下摇匀，得到液体B；在冰盒里面放置3小时后，放-20℃冰箱过夜；

7）将步骤6）获得的液体B取出，12000 r/min，4℃，离心1小时，去上清，取沉淀，用STE缓冲液溶解；

8）将步骤7）获得的液体B，铺设在蔗糖密度梯度的最上层，100000g，4℃，离心4.5 h，获得明显分层。

9）用细针管吸取步骤8）蔗糖密度梯度超速离心出现的各分层，分装于5mL离心管中，去蔗糖。

10）取去蔗糖的各层分离物，于透射电镜下观察，确定哪层为病毒颗粒。由于分离的是未知病毒，不同病毒颗粒体积及质量不同，可能处于不同分层，因此，步骤8）出现的各分层均应取样，去蔗糖后于透射电镜下观察。

步骤8）中，用蔗糖密度梯度进行离心的方法为：在离心管中依次加入60%，35%，25%蔗糖溶液，将上述步骤7）获得的液体铺设在最上层，100000g离心，4.5 h；离心后看到明显梯度。

步骤9）中，去蔗糖的方法为：用20倍STE溶解分装于5mL离心管中的各分层收集物，150000 g，离心，1小时，去上清，留约500µL底样，用PBS溶解。

有益效果：与现有技术相比，本发明的分离松材线虫体内病毒的方法，首先通过反复冻融使细胞破裂，进而采用匀浆器研磨、细菌过滤器过滤，然后低速离心，PEG沉淀，再用蔗糖密度梯度进行离心，收集分层，去蔗糖，获得透射电镜下观察可见的病毒颗粒，表明采用该方法可对松材线虫体内病毒进行分离，是一种简易且成功的方法。

附图说明

图1是松材线虫弱毒虫株OKD-1匀浆提取物蔗糖密度梯度离心后出现的分层图；

图2是透射电镜下观察到的松材线虫弱毒虫株OKD-1匀浆提取物蔗糖密度梯度离心后第二个分层中的病毒颗粒图；

图3是透射电镜下观察到的松材线虫弱毒虫株OKD-1匀浆提取物蔗糖密度梯度离心后第一个分层中的其他物质图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的解释。

实施例1

一种分离松材线虫体内病毒的方法，包括以下步骤：

1）制备PDA培养基，接种灰葡萄孢（Botrytis>）（南京林业大学森林病理实验保存）到PDA培养基上，控温25℃，经过5-7d培养至菌丝铺满平板。PDA培养基的配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18~20g，自来水1000mL。

2）选取松材线虫弱毒虫株OKD-1（由日本京都大学Yuko Takeuchi副教授提供，南京林业大学森林病理实验室保存）接种于步骤1）中长满灰葡萄孢菌丝的PDA培养基上，控温25℃，培养5-7d，待线虫大量繁殖后采用贝尔曼漏斗法分离线虫，收集于无菌的离心管中，3500 r/min离心3分钟，去上清，再用0.1 M的磷酸缓冲液清洗，离心，去上清，重复3次，收集不少于10 mL松材线虫虫液备用；

3）将步骤2）收集的松材线虫虫液置于-20~-80 ℃冷冻，过夜；将冷冻过夜的松材线虫虫液取出于4 ℃解冻，反复冻融至少3次；

4）将步骤3）反复冻融的松材线虫，分批置于玻璃匀浆器中，无菌条件下，冰上研磨；

5）将步骤4）研磨的松材线虫匀浆，于无菌条件下先用0.4 µm的过滤器粗过滤，滤液收集于无菌的离心管中，将0.4 µm过滤器粗过滤的滤液，再用0.2 µm细菌过滤器过滤，去除大的细胞碎片；

6）将步骤5）获得的滤液，6000 r/min，4℃，离心10分钟，取上清，得到粗提液A；

7）将步骤6）获得的粗提液A取出，加入PEG6000调节浓度到6%，氯化钠0.125M，4℃以下摇匀，得到液体B；在冰盒里面放置3小时后，放-20℃冰箱过夜；

8）将步骤7）获得的液体B取出，12000 r/min，4℃，离心1小时，去上清，取沉淀，用STE缓冲液溶解。STE缓冲液配方为：0.1 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），1 mmol/LEDTA（pH 8.0）。

9）在同一离心管中依次加入60%，35%，25%蔗糖溶液，将步骤8）获得的液体，铺设在蔗糖密度梯度的最上层，100000g，4℃，离心，4.5 h，如图1所示，蔗糖密度梯度离心后出现两个分层。

10）用细针管吸取步骤9）蔗糖密度梯度超速离心出现的分层，分装于5 mL离心管中，用20倍STE缓冲液溶解分装于5 mL离心管中的各分层收集物，150000 g，离心，1小时，去上清，留约500 µL底样，用PBS溶解。PBS（pH7.4）配方：KH₂PO₄>2HPO₄>

如图2所示，透射电镜下观察，蔗糖密度梯度离心后出现的第二个分层中有大量病毒状颗粒，而第一个分离层为其他物质（图3）。

综上所述，本发明利用PEG沉淀法结合蔗糖密度梯度离心法，克服了对线虫体内病毒分离的种种不便，达到了分离松材线虫体内病毒的目标。

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