一种检测黄疸血样中内毒素和(1-3)-β-D-葡聚糖含量的试剂盒及检测方法

摘要

本发明公开了一种检测黄疸血样中内毒素和(1‑3)‑β‑D‑葡聚糖含量的试剂盒，所述试剂盒至少包括质量浓度为0.5％的磺胺溶液、质量浓度为5％的NaNO

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测黄疸血样中内毒素和(1-3)-β-D-葡聚糖含量的试剂盒及其检测方法。

背景技术

临床研究结果显示，越来越多的证据表明烧伤、细菌感染、肝脏病变和消化道疾病所导致的内毒素血症可以使病情加重，最终导致肾功能衰竭、脑水肿、血压降低、组织损伤等。深部真菌感染的发病率随着广谱抗生素和免疫抑制剂的应用呈逐年上升态势，鲎试剂检测(1-3)-β-D-葡聚糖也应用于深部真菌感染的检测诊断。定量测定血液内毒素和(1-3)-β-D-葡聚糖含量对于临床上及早发现病征，对症施治，避免并发症，挽救患者生命有着重要的价值。目前，这方面的研究已经成为临床检查的新热点，一旦技术成熟，必然发展成为常规检查项目。欧美国家已批准G试验检查用于临床真菌诊断；我国《侵袭性肺部真菌感染的诊断标准与治疗原则(草案)》规定，连续2次G试验阳性可作为诊断侵袭性真菌感染的依据。

但是烧伤、细菌感染、肝脏病变等临床样品常伴有黄疸血，即血液中胆红素增加，血标本中存在胆红素可对鲎试剂检测血液样本中内毒素和(1-3)-β-D-葡聚糖含量造成严重干扰，这需要寻找一种可靠的方法消除血液中胆红素对鲎试剂的干扰。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测黄疸血样中内毒素和(1-3)-β-D-葡聚糖含量的试剂盒，用于黄疸血样本的内毒素和(1-3)-β-D-葡聚糖定量分析；避免胆红素可对鲎试剂检测血液样本中内毒素和(1-3)-β-D-葡聚糖含量造成的干扰。

本发明的另一目的在于提供一种检测黄疸血样中内毒素和(1-3)-β-D-葡聚糖含量的检测方法。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种检测黄疸血样中内毒素和(1-3)-β-D-葡聚糖含量的试剂盒，所述试剂盒至少包括质量浓度为0.5％的磺胺溶液、质量浓度为5％的NaNO₂以及鲎试剂。

作为进一步的方案，本发明所述的鲎试剂为常规鲎试剂、G因子封闭鲎试剂、C因子封闭鲎试剂中的一种。

作为进一步的方案，本发明所述的鲎试剂的灵敏度为0.1～0.015EU/mL。

作为进一步的方案，本发明所述的试剂盒还包括用于在测试时混合磺胺溶液和NaNO₂溶液的空试剂瓶。

作为进一步的方案，本发明所述的试剂盒由装10mL质量浓度为0.5％的磺胺溶液、1mL质量浓度为5％的NaNO₂、空试剂瓶和10支0.1ml规格的鲎试剂或2支0.5ml规格鲎试剂或1支1.25ml规格的鲎试剂。

利用本发明所述的试剂盒检测黄疸血样中的内毒素和(1-3)-β-D-葡聚糖含量的方法，该方法包括

黄疸血样的预处理步骤：将磺胺溶液与NaNO₂溶液混匀，取混匀的溶液，加黄疸血样本中，再混匀，用无热原水稀释10倍，75℃孵育8-15分钟，取样为待检测样本；

检测：将上述待检测样本用鲎试剂做鲎试验检测出内毒素和(1-3)-β-D-葡聚糖的含量。

作为进一步的方案，本发明所述的黄疸血样的预处理步骤还包括对孵育后的样本进行离心处理：用2500-3500转/min的速度离心8-15分钟，取上清液作为待检测样本。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1.本发明所述的检测黄疸血样中内毒素和(1-3)-β-D-葡聚糖含量的试剂盒可以消除血液中胆红素对鲎反应的干扰，临床样本对照显示，该试剂盒完全可以用于黄疸血样本的内毒素和(1-3)-β-D-葡聚糖定量分析；

2.利用本发明所述的试剂盒检测黄疸血样中内毒素和(1-3)-β-D-葡聚糖含量的过程中使用条件无特殊要求，可在室温条件下使用，并且由于消除血液中胆红素对鲎反应干扰，对鲎试剂的灵敏度要求较低，从而降低了检测成本，并与该检测试剂盒和检测方法的推广和应用。

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

具体实施方式

本发明所述的检测黄疸血样中内毒素和(1-3)-β-D-葡聚糖含量的试剂盒，所述试剂盒至少包括质量浓度为0.5％的磺胺溶液、质量浓度为5％的NaNO₂以及鲎试剂。

作为进一步的方案，本发明所述的鲎试剂为常规鲎试剂、G因子封闭鲎试剂、C因子封闭鲎试剂中的一种。这几种鲎试剂均可以通过购买方式获得。

作为进一步的方案，本发明所述的鲎试剂的灵敏度为0.1～0.015EU/mL。具体实施过程可以选用1.0、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03、0.015Eu/ml中的一种进行检测。

作为进一步的方案，本发明所述的试剂盒还包括用于在测试时混合磺胺溶液和NaNO₂溶液的空试剂瓶。

作为进一步的方案，本发明所述的试剂盒由装10mL质量浓度为0.5％的磺胺溶液、1mL质量浓度为5％的NaNO₂、空试剂瓶和10支0.1ml规格的鲎试剂或2支0.5ml规格鲎试剂或1支1.25ml规格的鲎试剂。

利用本发明所述的试剂盒检测黄疸血样中的内毒素和(1-3)-β-D-葡聚糖含量的方法，该方法包括

黄疸血样的预处理步骤：将磺胺溶液与NaNO₂溶液混匀，取混匀的溶液，加黄疸血样本中，再混匀，用无热原水稀释10倍，75℃孵育8-15分钟，取样为待检测样本；优选的，孵育时间为10分钟。

检测：将上述待检测样本用鲎试剂做鲎试验检测出内毒素和(1-3)-β-D-葡聚糖的含量。

作为进一步的方案，本发明所述的黄疸血样的预处理步骤还包括对孵育后的样本进行离心处理：用2500-3500转/min的速度离心8-15分钟，取上清液作为待检测样本。进一步的，离心的速度为3000转/min，离心时间为10分钟。

实施例1

检测黄疸血样中内毒素和(1-3)-β-D-葡聚糖含量的试剂盒，该试剂盒包括：

A瓶：装有10mL的0.5％磺胺溶液；

B瓶：装有1mL的5％NaNO₂溶液；

空瓶：用于混合A瓶和B瓶内的溶液；

鲎试剂：10支0.1ml规格的鲎试剂；

实施例2

用实施例1所述的试剂盒检测黄疸血样中内毒素的含量，具体检测方法如下：

黄疸血样的预处理步骤:将1mL的0.5％磺胺与30μL的5％NaNO₂混匀，取10μL混匀的溶液，加入到0.2mL黄疸血样本中，混匀，用无热原水稀释10倍，75℃孵育10分钟，取样作为检测样本；若样品出现絮状沉淀则3000转离心10分钟，取上清液作为检测样本；

检测：将上述待检测样本用鲎试剂做鲎试验检测出内毒素和(1-3)-β-D-葡聚糖的含量。

实施例3：内毒素和(1-3)-β-D-葡聚糖回收实验

用实施例1所述的试剂盒检测黄疸血样中(1-3)-β-D-葡聚糖的含量，具体检测方法如下：

用健康人血浆添加总浓度胆红素600μmol/L模拟黄疸血样本，加入0.02、0.1、0.5EU/mL内毒素或500、1000、2000pg/mL的(1-3)-β-D-葡聚糖混匀；

将1mL的0.5％磺胺与30μL的5％NaNO₂混匀，取10μL混匀的溶液，加入到0.2mL上述血样本中，混匀，用无热原水稀释10倍，75℃孵育10分钟，取样做检测；如果样品出现絮状沉淀则3000转离心10分钟，取上清液用动态浊度法做鲎试验检测。检测结果参见表1。

表1

表1的结果显示，通过本发明所述的试剂盒检测的灵敏度达到93％以上，对应的内毒素和(1-3)-β-D-葡聚糖回收也达到了93％以上。

应用实施例：临床黄疸血浆或血清样本检测

用实施例1所述的试剂盒检测黄疸血样中(1-3)-β-D-葡聚糖的含量，具体检测方法如下：

收集临床病人黄疸值高而不能用常规鲎试验检测的血标本，将1mL的0.5％磺胺与30μL的5％NaNO₂混匀，取10μL混匀的溶液，加入到0.2mL黄疸血样本中(胆红素浓度均>300μmol/L)，混匀，用无热原水稀释10倍，75℃孵育10分钟，取样做检测。注意：如果样品出现絮状沉淀则3000转离心10分钟，取上清液用动态浊度法做鲎试验检测。检测结果参见表2。

表2

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。