一种来自棉花抗植物真菌病害蛋白GhGLP2及其编码基因与应用

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种来自棉花抗植物真菌病害蛋白GhGLP2及其编码基因与应用，通过棉花类萌发素蛋白基因GhGLP2原核表达获得，所述的蛋白GhGLP2氨基酸序列为SEQ ID NO.1，将GhGLP2蛋白接种到PDA培养基上能有效的抑制番茄灰霉病菌、辣椒疫霉病菌、棉花枯萎病菌、水稻纹枯病菌和小麦根腐病菌等多种真菌病原菌的繁殖生长。将在植物抗病基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。

说明书

技术领域

本发明涉及一种来自棉花抗植物真菌病害相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

农作物真菌病害严重影响作物的产量和质量。各类作物病害中以真菌病害症状类型最多，可以出现在植物的各个部位。传统的病害防治主要依靠培育抗性品种和化学农药，虽然获得一定成效，但是存在严重的弊端。常规作物育种方法普遍周期长、抗病性及优良农艺性状难以兼得；化学农药防治的高残留、易对环境造成污染、危害人畜健康等缺点限制了传统病害防治方法的大规模应用。因此，应用生物技术得到抗病新品种是人类一直在努力进行的重要课题之一，而寻找新的抗真菌蛋白将为抗真菌转基因工程提供重要的理论基础和信息，为抗病品种的培育开辟植物育种的新途径。

病程相关蛋白(Pathogenesis-related genes，PR)是存在于植物的一类防御蛋白，病原菌或其他外界因子的刺激能够诱导其表达，在植物抵御病原菌、响应外界胁迫以适应不良环境过程中发挥重要作用。根据序列相似性、血清或免疫特征以及酶功能将PRs分为17个家族，其中第16家族PR-16是一组很独特蛋白，具有草酸盐氧化酶活性、超氧化物歧化酶活性、多酚氧化酶活性等多种生物学活性，能使细胞壁再塑，阻止病原菌入侵(EdrevaA.Pathogenesis-related proteins:research progress in the last 15years.Bulgarian Journal of Plant Physiology，2005，31：105-124.)。

在研究小麦胚萌芽特异性蛋白质的过程中发现萌发素蛋白(germin)，将与其相似性达到30％-70％蛋白命名为类萌发素蛋白(germin-like proteins，GLPs)(Bernier F O，Berna A.Germins and germin-like proteins:Plant do-all proteins.But what dothey do exactly？Elsevier Masson SAS，2001，545-554.)。GLPs属于PR-16家族，广泛存在于单子叶植物、双子叶植物及低等植物苔藓中，是属于cupin超家族的糖蛋白，由3个高度保守的寡肽Boxes A、B和C、一个与两个半胱氨酸相邻的高度可变区和由许多氨基酸残基组成的保守序列骨架组成，在不同的植物中具有不同的功能(Dunwell J M，Gibbings J G，Mahmood T，Naqvi S M S.Germin and germin-like proteins:evolution structure andfunction.Cirt，Rev.Plant Sci，2008，27:342-375.)。

辣椒受到烟草花叶病毒(TMV)或单胞菌侵染时，CaGLP被诱导大量表达，使植物防御系统被激活，提高了植物抗病性(Park C，An J，Shin Y，Kim K，Lee B，Paek K.Molecularcharacterization of pepper germin-like protein as the novel PR-16family ofpathogenesis-related proteins isolated during the resistance response toviral and bacterial infection.Planta，2004，219(5):797-806.)；甜菜中BvGLP1在拟南芥中过量表达提高了拟南芥抗长孢轮枝菌和丝核菌的能力(Knecht K，Seyffarth M，CaiD.Expression of BvGLP-1Encoding a Germin-Like Protein from Sugar Beet inArabidopsis thaliana Leads to Resistance Against PhytopathogenicFungi.Molecular Plant-Microbe Interactions，2010，23(4):446-457.)；甘蓝型油菜中BnGLP3/12能够起始氧化迸发，达到抗核盘菌的作用(Rietz S，Bernsdorff F，DaguangC.Members of the germin-like protein family in Brassica napus are candidatesfor the initiation of an oxidative burst that impedes pathogenesis ofSclerotinia sclerotiorum.Journal of Experimental Botany，2012，63(15):5507-5519.)；桑叶MaGLP蛋白是种抗菌蛋白，它对多种革兰氏阴性及阳性细菌有抑制作用，且对真菌茄病镰刀菌和尖刀镰孢菌表现出抗性(Patnaik B B,Kim D H,Oh S H,etal.Molecular cloning and characterization of novel Morus alba germin-likeprotein gene which encodes for a silkworm gut digestion-resistantantimicrobial protein.Plos One，2012，7(12):e50900.)。水稻OsGLP2-1在外源茉莉酸的诱导下表达量显著提升，并且OsGLP2-1对真菌性稻瘟病和细性疫病有较强的抑制作用(LiuQ，Yang J，Yan S.The germin-like protein OsGLP2-1enhances resistance to fungalblast and bacterial blight in rice.Plant Molecular Biology，2016，92(4-5):1-13.)。

本发明的GhGLP2蛋白属于GLP家族，来自陆地棉(Gossypium hirsutum)中植棉2号(棉花品种)。中植棉2号是我国审定的高抗枯、黄萎病的品种，可作为抗病虫害基因克隆的合适材料。通过GhGLP2基因的原核表达，获得纯化蛋白GhGLP2，同时抑菌实验发现该基因编码的蛋白GhGLP2对番茄灰霉病菌、辣椒疫霉病菌、棉花枯萎病菌、水稻纹枯病菌、小麦根腐病菌、西瓜枯萎病菌、水稻稻瘟病菌、菜豆炭疽病菌、棉花黄萎病菌等均有显著抗性。

发明内容

本发明目的在于提供一种来自棉花抗植物真菌病害相关的蛋白GhGLP2,以及其编码基因与应用。

本发明涉及分离GhGLP2的DNA片段并鉴定其功能，具有该基因GhGLP2的植物在一定程度上具有抵抗特定真菌侵染的表型。其中所述DNA片段如序列表SEQ ID NO.2所示，或者基本相当于SEQ ID NO.2所示的GhGLP2核苷酸序列，或者其功能相当于SEQ ID NO.2所示序列的部分片段。对GhGLP2基因进行序列分析，表明GhGLP2全长cDNA为983bp，具有738bp的开放阅读框，15bp的5’非翻译区和230bp的3’非翻译区。

本发明的GhGLP2蛋白由245个氨基酸残基组成，为序列表中的SEQ ID NO.1。开放阅读框的起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，理论分子量为25.9kDa，等电点为6.94。GhGLP2编码蛋白具有cupin超家族的保守结构域，与其他物种的GLPs和PR-16蛋白高度相似，表明其属于棉花中的GLP家族。

GhGLP2基因原核表达蛋白制备的方法，包括以下步骤：

步骤一：将上述基因与适宜的原核表达载体如pET-22b、pET-28a、pET-29a等连接，构建原核表达载体。

步骤二：将上述原核表达载体转化到大肠杆菌BL21中。

步骤三：GhGLP2基因原核表达蛋白的诱导表达和纯化。

本发明通过原核表达获得GhGLP2纯化蛋白，并判定其为一种新的抗真菌蛋白。抗真菌蛋白GhGLP2对典型的植物致病真菌番茄灰霉、辣椒疫霉、棉花枯萎病菌、水稻纹枯病菌和小麦根腐病菌的抑制活性显著，显示出其在作物抗真菌方面具有潜在的应用前景。

附图说明

图1为GhGLP2基因PCR扩增结果图。在图1中右侧泳道M表示DL2000DNA Marker,左边泳道P表示PCR产物。

图2为T克隆质粒pMD-T-GhGLP2酶切鉴定图。在图2中左侧泳道P表示T克隆质粒pMD-T-GhGLP2酶切产物,右边泳道P表示DL2000DNA Marker。

图3为原核表达载体pET-22b-GhGLP2的构建流程图。

图4为原核表达质粒pET-22b-GhGLP2酶切鉴定图。在图4中右侧泳道M表示DL2000DNA Marker,左边泳道P表示原核表达质粒pET-22b-GhGLP2酶切产物。

图5为诱导原核表达蛋白GhGLP2的优化条件SDS-PAGE电泳图谱。在图5中泳道1为蛋白分子量标准Marker；泳道2、3、4、5分别为37℃、含有质粒pET-22b-GhGLP2的BL21，IPTG诱导后3h、4h、5h、6h；泳道6、7、8、9分别为28℃、含有质粒pET-22b-GhGLP2的BL21，IPTG诱导后3h、4h、5h、6h。

图6为原核表达GhGLP2蛋白的可溶性分析SDS-PAGE电泳图谱。在图6中泳道1为蛋白分子量标准Marker；泳道2、3为超声破碎悬浮液；泳道4、5为超声破碎的悬浮液沉淀；泳道6、7为超声破碎的悬浮液上清。

图7为纯化原核表达GhGLP2的SDS-PAGE电泳图谱。在图7中泳道1为蛋白分子量标准Marker，泳道2、3、4、5为梯度洗脱的GhGLP2蛋白。

图8A-8E为抗真菌蛋白GhGLP2平板抑菌实验。其中A、B、C、D、E分别表示番茄灰霉、辣椒疫霉、棉花枯萎病菌、水稻纹枯病菌和小麦根腐病菌的PDA平板，在滤纸片1上滴加10μL的起始缓冲溶液(20mM PBS溶液)、滤纸片2、3上分别滴加2μg、4μg GhGLP2蛋白溶液。

具体实施方式

实施例1、GhGLP2全长基因以及序列分析

用液氮把棉花幼苗叶片研磨成粉末后，转入离心管中，采用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒(博迈德)提取总RNA。采用高效反转录酶FastQuant RT Enzyme(天根)以总RNA为模板合成第一链cDNA，反应体系和操作过程为：1、gDNA去除反应体系：取1.5μg TotalRNA，依次加入2μL 5×gDNA Buffer，RNase-free ddH₂0至反应体系体积为10μL，彻底混匀，简短离心，置于42℃孕育3min，置于冰上放置；2、反转录反应体系：配制2μL>20至反应体系体积为10μL的混合液，加到gDNA去除步骤的反应液中，混匀并简短离心，42℃孕育15min，95℃孕育3min，终止反应。第一链cDNA合成后置于-20℃保存备用。

以合成的第一链cDNA为模板，扩增目的基因，所用引物序列分别为：5'-ATGGACATACCTTCAAGGAC-3'和5'-ACCAGTTCCTCCAAGAACA-3'。选用Taq DNA聚合酶(天根)扩增出目的基因。PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，52℃30s，72℃60s,33个循环；72℃10min。反应体系为25μL，包含1μL cDNA、2.5μL 10×Buffer、2μL dNTP、0.5μL正向(20mM)、0.5μL反向引物(20mM)、0.5μL Taq DNA Polymerae(2U/μL)、18μL ddH₂0。PCR结束后，取5μL用于琼脂糖凝胶电泳，如图1所示，经PCR扩增出750bp左右的片段。

用冻融法进行PCR产物的回收。将PCR产物进行0.7％琼脂糖凝胶电泳，切取目的条带，将切取的胶块放入1.5mL离心管，12,000rpm常温离心5min；往离心管中加入30μL的1mol/L Tris-HCl(pH 8.0)、30μL的3mol/L NaAC(pH 5.2)和100μL的H₂O，65℃水浴15min，期间多次振荡；迅速加入300μL>2O溶解，-20℃保存备用。

采用pMD^TM>2O补充至5μL；加入5μL的SolutionⅠ；混匀上述反应液，16℃连接过夜。

采用热激发将连接产物转入大肠杆菌DH5α中，转化方法如下：将感受态细胞DH5α放于冰上溶解，加入5μL连接产物和45μL的TFB3(1mol/L Tris-HCl 10μL、1mol/L CaCl₂>2>2O>

实施例2、原核表达蛋白的制备

本发明是利用Novogen公司的pET-22b高效表达载体的多克隆位点来实现GhGLP2原核表达的。本实验采用的酶切位点使pET-22b表达载体表达出的产物是3’端附加6个连续的His融合蛋白，这6个连续的His构成Ni-Agarose特异结合的位点，因此可利用亲和层析来纯化表达产物。设计并合成一对特异性引物，按分子克隆常规实验程序用PCR扩增出两端带有特定酶切位点的基因编码序列，引物：

22b-GLP2-F 5’-GGACCATATGATGGACATACCTTCAAGGAC-3’

22b-GLP2-R 5’-ACCCAAGCTTACCAGTTCCTCCAAGAACA-3’

一、构建原核表达载体

以棉花总RNA合成的cDNA为模板进行PCR。产物回收后，转化、酶切、测序。

对原核表达载体pET-22b和带有酶切位点的GhGLP2基因片段分别用Nde I、HindⅢ进行双酶切，所得DNA片段用T4连接酶连接，将连接产物转化大肠杆菌菌株DH5 α，用含Amp(50mg/L)的LB平板筛选重组子。载体的构建流程见图3。经质粒酶切鉴定(如图4所示，泳道1为DL2000 DNA Marker,泳道2、3为Nde I、Hind Ⅲ酶切的质粒pET-22b-GhGLP2)，再经过PCR鉴定，将筛出的连接正确的重组子进行测序，证明插入载体的DNA序列的阅读框架是正确的，把构建带有GhGLP2基因的表达载体，命名为pET-22b-GhGLP2。提取pET-22b-GhGLP2质粒，转入大肠杆菌菌株BL21中，进行原核表达。

二、诱导表达条件优化

将含质粒pET-22b-GhGLP2的BL21菌种，接种于含Amp(50mg/L)的3mL LB培养基中，培养过夜。按1％取过夜培养菌液接入含Amp(50mg/L)的100mL LB培养基，37℃培养2h以上，至对数中期(OD₆₀₀＝0.6)。在培养物中加入10μL>

三、蛋白纯化

将100mL扩大培养的含质粒pET-22b-GhGLP2的BL21培养液8,000rpm离心10min，收集菌体并用PBS溶液悬浮，将悬浮液超声破碎，破碎程序为：工作4sec，停止2sec，200W，120次。将超声破碎的悬浮液10,000rpm，4℃离心10min，对上清和沉淀分别取样，制成蛋白上样样品。配制15％的SDS-PAGE胶并上样，确定GhGLP2蛋白表达在上清或包涵体中，结果如图6所示：泳道1为蛋白分子量标准Marker；泳道2、3为超声破碎悬浮液；泳道4、5为超声破碎的悬浮液沉淀；泳道6、7为超声破碎的悬浮液上清，从图中看出，表达蛋白为可溶性蛋白。蛋白纯化使用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)(Cwbio,China)方法进行。将菌体超声破碎后10,000rpm，4℃离心3min，收集上清中的可溶性蛋白，用Binding Buffer将菌体裂解液等倍稀释后负载上柱，收集流穿液。使用15倍柱体积的Binding Buffer冲洗柱子，洗去杂蛋白。使用适量Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰，纯化GhGLP2蛋白如图7所示，泳道1为蛋白分子量标准Marker，泳道2、3、4、5为梯度洗脱的GhGLP2蛋白。

实施例3、GhGLP2蛋白对多种病原菌抑制活性的分析

采用菌丝生长抑制法，挑取直径为0.6cm的番茄灰霉病菌、辣椒疫霉病菌、棉花枯萎病菌、水稻纹枯病菌和小麦根腐病菌圆形菌块接种于普通PDA培养基平板上，在28℃条件下倒置培养，使菌丝在平板上呈圆形伸展，在距离菌丝边缘0.8cm-1cm处放置直径为0.65cm无菌滤纸片，在滤纸上滴加2μg、4μg的GhGLP2抗真菌蛋白溶液，在作为空白对照的另一滤纸片上，滴加等体积溶解GhGLP2蛋白的起始缓冲溶液(20mM PBS溶液)。在超净台中将平板中所有的液体样品吹干，将做好的PDA抑菌板在28℃条件下倒置培养，不同指示菌培养时间不同。如图8A、8B、8C、8D、8E所示，GhGLP2蛋白分别对番茄灰霉病菌、辣椒疫霉病菌、棉花枯萎病菌、水稻纹枯病菌和小麦根腐病菌有明显抑制作用，图中滤纸片1上滴加10μL的起始缓冲溶液(20mM PBS溶液)、滤纸片2、3上分别滴加2μg、4μg GhGLP2蛋白溶液。

用同样的实验方法测定GhGLP2蛋白对西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.niveum)、水稻稻瘟病菌(Piricularia oryzae)、菜豆炭疽病菌(Colletotrichumlindemuthianum)和棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)的抑制活性，结果见表1。

表1为抗真菌蛋白GhGLP2的抑菌活性

病原菌抑菌活性^※西瓜枯萎病菌+++水稻稻瘟病菌++菜豆炭疽病菌++棉花黄萎病菌++

^※+++,++表示相对抑菌活性，由强到弱

实施例4、GhGLP2蛋白对5种病原真菌最低抑制浓度的测定

挑取直径为0.6cm的番茄灰霉病菌、辣椒疫霉病菌、棉花枯萎病菌、水稻纹枯病菌和小麦根腐病菌圆形菌块接种于普通PDA培养基平板上，在28℃条件下倒置培养，使菌丝在平板上呈圆形伸展，在距离菌丝边缘0.8cm-1cm处放置直径为0.65cm的无菌滤纸片。采用二倍稀释法将高浓度的GhGLP2抗真菌蛋白溶液依次进行梯度稀释，稀释液使用起始缓冲溶液(20mM PBS溶液)，在每个滤纸片上滴加10-20μL各浓度的GhGLP2抗真菌蛋白溶液，以起始缓冲液作为阴性对照，在超净台中将平板中所有的液体样品吹干，将做好的PDA抑菌板在28℃条件下倒置培养，不同指示菌培养时间不同。采用二倍稀释法，最低抑制浓度(MIC，minimalinhibtion concentration)可定义为随着各滤纸片上抗真菌蛋白含量的降低，滤纸片周围出现的对菌丝的抑制程度逐渐降低，最终与阴性对照无差别，即能够观察到对菌丝抑制现象的最低浓度，记为μg/disc。

通过二倍稀释法，可得到GhGLP2对番茄灰霉病菌、辣椒疫霉病菌、棉花枯萎病菌、水稻纹枯病菌和小麦根腐病菌的最低抑制浓度分别为1.5μg/disc、1.5μg/disc、1.5μg/disc、2μg/disc和1.8μg/disc。

实施例5、温度对抗真菌蛋白GhGLP2抗菌活性的影响

将GhGLP2抗真菌蛋白溶液于30℃、50℃、70℃、90℃条件下分别处理20min以及121℃高温灭菌条件下处理20min；处理后GhGLP2抗真菌蛋白溶液于4℃放置1h后离心，以未处理GhGLP2抗真菌蛋白溶液为阳性对照，以起始缓冲液作为阴性对照，检测各样品对5株指示菌的抑菌活性。

挑取直径为0.6cm的番茄灰霉病菌、辣椒疫霉病菌、棉花枯萎病菌、水稻纹枯病菌和小麦根腐病菌圆形菌块接种于普通PDA培养基平板上，在28℃条件下倒置培养，使菌丝在平板上呈圆形伸展，在距离菌丝边缘0.8cm-1cm处放置直径为0.65cm的无菌滤纸片。在滤纸片上滴加10-20μL经不同温度处理后的GhGLP2抗真菌蛋白溶液，在超净台中将平板中所有的液体样品吹干，将做好的PDA抑菌板在28℃条件下倒置培养，不同指示菌培养时间不同。检测到GhGLP2在90℃及121℃高温灭菌条件下处理20min会失去抗菌活性。

实施例6、pH对抗真菌蛋白GhGLP2抗菌活性的影响

将GhGLP2抗真菌蛋白溶液分别与pH为2、4、6、8、10、12起始缓冲溶液(20mM PBS溶液)等体积混合，于4℃放置6h。以未处理GhGLP2抗真菌蛋白溶液为阳性对照，以起始缓冲液作为阴性对照，检测各样品对5株指示菌的抑菌活性。

挑取直径为0.6cm的番茄灰霉病菌、辣椒疫霉病菌、棉花枯萎病菌、水稻纹枯病菌和小麦根腐病菌圆形菌块接种于普通PDA培养基平板上，在28℃条件下倒置培养，使菌丝在平板上呈圆形伸展，在距离菌丝边缘0.8cm-1cm处放置直径为0.65cm的无菌滤纸片。在滤纸片上滴加10-20μL不同pH的GhGLP2抗真菌蛋白溶液。在超净台中将平板中所有的液体样品吹干，将做好的PDA抑菌板在28℃条件下倒置培养，不同指示菌培养时间不同。检测到GhGLP2分别在pH为2、4和12的缓冲液环境中会失去抗菌活性。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种来自棉花抗植物真菌病害蛋白GhGLP2及其编码基因与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 245

<212> PRT

<213> Gossypium hirsutum

<400> 1

Met Asp Ile Pro Ser Arg Thr Asn Cys Asn Gly Ser Lys Tyr Pro Cys

1 5 1015

Phe Leu Phe Tyr Ile Lys Gly Glu Leu Ser Leu Gln His Tyr Phe His

202530

Pro Ser Lys Thr Ser Ala Ile Asn Met Phe Ile Pro Ile Phe Phe Ile

354045

Leu Ser Phe Leu Phe Ser Ser Thr Asn Ala Ala Asp Phe Cys Val Gly

505560

Asp Leu Asn Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Tyr Ser Cys Lys Lys Thr

65707580

Val Thr Val Asn Asp Phe Val Tyr Ser Gly Leu Ala Ala Thr Gly Asn

859095

Thr Ser Asn Leu Ile Lys Ala Ala Val Thr Pro Ala Phe Ser Ala Gln

100 105 110

Phe Pro Gly Val Asn Gly Leu Gly Ile Ser Ile Ala Arg Leu Asp Leu

115 120 125

Ala Val Gly Gly Val Ile Pro Met His Thr His Pro Gly Ala Ser Glu

130 135 140

Val Leu Val Val Ile Gln Gly Thr Ile Cys Ala Gly Phe Ile Ser Ser

145 150 155 160

Ala Asn Lys Val Tyr Phe Lys Ser Leu Asn Lys Gly Asp Ile Met Val

165 170 175

Phe Pro Gln Gly Leu Leu His Phe Gln Ile Asn Ala Gly Lys Thr Gln

180 185 190

Ser Leu Ala Phe Val Ser Phe Ser Ser Pro Asp Pro Gly Leu Gln Ile

195 200 205

Leu Asp Phe Ala Leu Phe Ala Asn Asp Leu Pro Thr Asp Ile Ile Glu

210 215 220

Glu Thr Thr Phe Leu Asp Ala Ala Gln Ile Lys Lys Leu Lys Gly Val

225 230 235 240

Leu Gly Gly Thr Gly

245

<210> 2

<211> 983

<212> DNA

<213> Gossypium hirsutum

<400> 2

cacgtgaaag tatgcatgga cataccttca aggaccaatt gcaacggctc aaaatatcca 60

tgctttttgt tctatataaa gggtgagctc agcttgcaac attattttca cccctcaaaa 120

accagtgcca taaacatgtt tatcccaatc tttttcattt tatctttcct attttcctcc 180

accaacgcag ccgacttctg tgttggggac ttgaatggcc ctgtaggccc tgcaggctat 240

tcttgcaaga agacagtcac cgtaaatgac ttcgtttact ccggcctcgc tgccacaggc 300

aacacttcga acctcataaa agctgcagta acaccagcct tttcggctca attcccgggt 360

gttaacggac tcggcatttc aatagctcgt ttggatttag ctgttggtgg agtgatacct 420

atgcatacac accctggggc ttctgaagtc cttgttgtta ttcaaggcac aatttgtgct 480

ggtttcatat cctcagctaa caaagtttac ttcaaatctc tgaataaagg agacattatg 540

gtattcccac aaggtttatt acatttccaa atcaatgcag gcaaaactca atccttggca 600

tttgtatcct tcagcagtcc agaccctggt ctccaaatcc tcgactttgc cttgtttgca 660

aatgacttgc cgactgacat tattgaagaa accacttttc tggatgctgc tcagattaag 720

aagctgaagg gtgttcttgg aggaactggt taatattatc tgaacttgtt gagagtccct 780

tttttttttt ttgtatgctt ccacgtttgc ttgtgtcttc ttgtcagtgg tagtttgttt 840

gaaattacta gcaaaagagc gagtctctgt tgtgtttctt tatgttcctt cttcaggttc 900

tattgtgaac caaaaatgta ataaaaaaag accatccctt tctcgatctg aaaatgttta 960

aataaatgca attatgttgt tta 983