一种基于并行探测的超分辨荧光寿命成像方法和装置

摘要

本发明公开一种基于并行探测的超分辨荧光寿命成像装置，包括光源，光源发出的激发光由显微物镜聚焦到样品上并收集样品发出的信号光，其中，接收信号光的探测系统包括：光纤束，内的多根光纤束同时接收到所述的信号光；探测器阵列，具有分别连接每根光纤的多个探测器，得到对应的光强信号；时间相关单光子计数器阵列，具有分别连接每个探测器并与光源脉冲同步的时间相关单光子计数器，用于计算荧光寿命并实现超分辨荧光寿命成像。本发明还公开一种基于并行探测的超分辨荧光寿命成像方法。本发明利用并行APD和并行TCSPC，不仅实现了成像分辨率的提升，还显著提高了寿命成像速度。

说明书

技术领域

本发明属于超分辨显微荧光寿命成像领域，尤其是涉及一种基于并行 探测的超分辨荧光寿命成像方法和装置。

背景技术

光与物质的作用是自然界中最基础的作用过程，尤其是单个原子与单 个光子的相互作用是实现光与物质作用的最普遍的元素。而在这个领域， 超分辨荧光显微成像一直是生物医学研究的重点，通过对生物分子的特殊 标记，荧光光学显微镜在观察亚细胞结构扮演着重要的角色。

荧光信息具有四个基本的物理维度，包括强度信息，波长信息(吸收 光谱和发射光谱)，寿命信息和偏振信息。目前的超分辨显微技术主要集 中利用在强度和波长上，包括利用荧光的吸收与发射谱，实现强度上的“开 关”调制(STED技术，PALM/STORM技术等)，或者利用结构上的强度 调制技术包括SIM技术或者饱和SIM技术。而在偏振方面，目前也有不少技术实现偏振解调，获取偏振信息从而实现分辨率的提高。除了这些之 外，寿命信息是生物微结构成像方面非常重要的一个信息，荧光寿命成像 是一个越来越广泛应用的光谱技术，它能够提供特定的荧光团的定位信息 和荧光分子的微环境变化信息，包括许多生物物理、生物化学参数如离子 浓度、PH值、氧浓度、折射率、黏性、和温度等，特别的，荧光寿命成 像也能够应用于对荧光分子对的荧光共振能量转移(FRET)的探测，能 够用于研究蛋白质与细胞的相互动力作用。荧光寿命成像的主要优点在于 其成像结果对荧光浓度和聚焦情况并不敏感，因此不需要得到荧光强度即 可获取所需的寿命信息。同时荧光寿命成像也可以与共聚焦、STED技术 相结合，为生物医学研究提供新的研究手段。

目前的荧光寿命成像方式主要有两大类，一类是时域寿命成像方法， 另一类是频域寿命成像方法，但两种方法的本质是相同的。频域寿命成像 方法更适合对寿命分布呈多指数衰减的样品，而时间寿命成像则适用于更 为灵活、大的动态范围和长寿命的样品。基于共聚焦系统和TCSPC计数 装置来进行寿命测量是时域寿命成像方法的一种，它能够提供较好的寿命 成像分辨率，同时能够灵活的测量各种动态范围的长短寿命样品，但是这 种方法由于受到探测器和计数器死程时间的影响，对光子的探测和计数效 率较低，因此成像速度很慢，这也是这种方法最大的缺点。

发明内容

本发明提供了一种基于并行探测的超分辨荧光寿命显微成像方法和 装置，利用并行雪崩光电二极管(APD)阵列和并行时间相关单光子计数 器(TCSPC)阵列相结合，在共聚焦点扫描的情况下，用光纤束收集荧光 样品所激发出来的荧光信号，并通过光纤束中的各个光纤将荧光信号收集 到各个单独的APD中，再经过TCSPC计数实现寿命信息的获取，再利用 并行探测的相关算法，实现对样品的超分辨荧光寿命成像，在提高强度成 像分辨率的同时，提高寿命成像的精度，实现寿命成像速率的显著提高。 该种方法和装置具有成像速度快、分辨率高、装置简单、操作方便等特点， 可以很好地应用于生物细胞的超分辨荧光寿命成像当中。

本发明所采用的具体技术方案如下：

一种基于并行探测的超分辨荧光寿命成像装置，包括光源、承载待测 样品的扫描平台，所述光源与扫描平台之间依次设有：

用于保证激光出射偏振方向不变的保偏光纤；

用于对激光源发出的光束进行准直的准直透镜；

用于将光源发出的光束改变为纯净线偏振光的1/2波片和1/4波片， 和将线偏振光转换为圆偏振光的1/4波片；

用于实现对激光光束扩束和点扫描的4f系统，包括扫描镜和场镜；

用于将激发光聚焦到样品上的显微物镜；

用于实现扫描的电动压电平台；

用于反射激发光、透射荧光的二色镜；

并设有用于控制激光光源和平台的控制器及收集所述待测样品发出 的信号光的探测系统。

本发明中通过探测系统接收样品发出的信号光，该探测系统包括：

用于滤去背景噪声、提高成像信噪比的窄带滤波片；

用于调整待探测的信号光斑大小的4f透镜系统；

用于将信号光束聚焦到收集信号光的光纤束内的聚焦透镜；

用于将信号光子传递到雪崩光电二极管(APD)阵列的光纤束；

用于探测信号光的APD阵列和进行光子计数、荧光寿命计算的时间 相关单光子计数器(TCSPC)阵列。

本发明提供的基于并行探测的超分辨荧光寿命成像方法，包括以下步 骤：

1)对激光器发出的激光光束在经过保偏光纤后进行准直；

2)光束通过1/2波片和1/4波片，变成纯净的线偏振光，再经过一个 1/4波片变成圆偏振光；

3)光束在经过偏振调制后经过二色镜和反射镜进入显微镜架，在经 过扫描镜和场镜组成的4f系统扩束后，经过大数值孔径的浸油物镜后会 聚在样品表面激发荧光样品产生荧光；

4)激发出来的荧光沿原光路返回后，透过二色镜，经过窄带滤波片 和相对应的4f系统实现荧光信号的过滤以及扩束，最终会聚到光纤束端 口，光纤束端口分布如图2所示，利用光纤束对荧光信号进行收集，而光 纤束中的每根光纤连接着探测器阵列中的每个APD，此时每个APD所接 收到的光强信号为：

其中，代表样品上被扫描的位置矢量，代表物空间上的物的位置 矢量，代表探测器所在的位置矢量，代表物空间的强度分布， 有效点扩散函数可以表示为

其中，代表激发点扩散函数，代表探测点扩散函 数。

本方法利用APD阵列接收到的光强信号，采用光子重组的方法，实 现成像分辨率的提高。在式(2)中，在探测器阵列中的某个探测器不在共轭 焦点上时，这时它成像的有效PSF就会发生偏移，继而成像发生偏移， 将偏移的成像结果平移到原本应该在的中心位置，用q表示平移系数，即：

再通过将每个探测器探测到的经过重组的光强信号叠加起来，就得到 最终的超分辨成像结果：

另一方面，探测器阵列中的每个APD都与一个TCSPC相连，TCSPC 与光源脉冲进行同步，通过计算在各个同步周期内APD接收到的光子的 到达时间，从而实现寿命的计算。

本发明原理如下：

荧光显微镜目前已经成为了现代生物学和医学补课或缺的工具，对细 胞内不同结构染上不同的荧光光谱信息的染料可以有效的帮助现代科学 对活细胞的相关动力学进行研究。荧光寿命成像则是其中最为有效的一种 研究细胞内外微环境的成像方法，它的成像机理决定了它不受到荧光强度 的影响，它能够提供特定的荧光团的定位信息和荧光分子的微环境变化信 息，包括许多生物物理、生物化学参数如离子浓度、PH值、氧浓度、折 射率、黏性、和温度等，特别的，荧光寿命成像也能够应用于对荧光分子 对的荧光共振能量转移的(FRET)探测，能够用于研究蛋白质与细胞的 相互动力作用显微系统成像的分辨率受光学系统衍射的影响。

但目前的荧光寿命成像还存在着一些明显的问题，对于利用共聚焦系 统，采用TCSPC计数测量荧光寿命的系统，最主要的问题就是成像速度 的问题。由于APD和TCSPC死程时间的限制导致光子堆积效应，使得真 正被记录下来的光子远小于真实有效的信号光子，从而严重影响荧光寿命 的准确性，而为了确保荧光寿命计算的准确性，则需要用很弱的激发光强 和长时间的扫描时间来进行补偿，导致荧光寿命成像速度非常慢。而本方 法采用并行APD阵列和并行TCSPC阵列，APD本身具有很高的量子效 率，对荧光的探测效率很高，而在相同的扫描时间下，并行探测的方式能 削弱光子堆积效应，当某个APD受到死程时间的影响无法探测到光子时， 其他的APD可以接收光子，因此本发明可以探测到更多的有效信号，提 高寿命成像的准确度。而在保证荧光寿命成像的精确度的前提下，采用并 行探测的方法由于可以削弱堆积效应，在相等的时间内收集更多的光子， 可以明显的提高荧光寿命成像的速度，解决荧光寿命成像速度慢的问题。 而在成像分辨率方面，本发明采用并行探测光子重组的方法，将每个APD 获得的偏移的图像平移回它原本的位置进行叠加，获得分辨率更高的成像 结果。同时首次利用APD阵列作为探测器，利用其高的时间分辨率和量 子效率，能够进一步提高寿命成像的精度和信噪比。

本方法虽然基于共聚焦系统，但是采用并行探测和并行计数的方式， 利用并行APD和并行TCSPC，不仅实现了成像分辨率的提升，还显著提 高了寿命成像速度。相对于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果：

(1)首次利用并行APD阵列和TCSPC阵列实现对光子的并行探测 计数，实现荧光寿命成像速度的显著提高；

(2)首次利用APD阵列实现并行探测的光子重组算法，实现荧光寿 命成像的分辨率的显著提高，信噪比也得到进一步的提升；

(3)在共聚焦系统的基础上进行了简单的改进，装置简单，操作方 便。

附图说明

图1为本实施例的基于并行探测的超分辨荧光寿命成像装置的结构示 意图；

图2为本实施例中连接探测器阵列的光纤束端面示意图；

图3为本实施例中共聚焦和并行探测情况下荧光强度成像分辨率比较 图；其中，图3(a)为普通共聚焦的情况下对100nm荧光颗粒的成像结果， 而图3(b)为利用本发明的成像结果；

图4为本实施例中相同的单点停留时间，共聚焦和并行探测情况下荧 光寿命分布直方图的比较图；其中，图4(a)为本发明与共聚焦方法探测到 光子数对比图，图4(b)为对荧光颗粒的寿命统计直方图；

图5为本实施例中在共聚焦单点停留时间为并行探测单点停留时间的 2.5倍时，各自的荧光寿命分布直方图的比较图，其中，图5(a)荧光寿命 统计直方图，图5(b)为标准化的荧光寿命统计直方图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。

如图1所示的基于并行探测的超分辨荧光寿命成像装置，包括：激光 光源1，保偏光纤2，准直透镜3，1/4波片4，1/2波片5，1/4波片6，二 色镜7，反射镜8，扫描镜9，场镜10，高数值显微物镜11，样品12，扫 描平台13，反射镜14，窄带滤波片15，透镜16，孔阑17，透镜18，会 聚透镜19，光纤束20，APD阵列21，TCSPC阵列22和电脑及控制器23。

准直透镜3、1/4波片4、1/2波片5和1/4波片6依次位于激光光源1 出射光束的光轴之上。激发光束被二色镜7反射后再经过反射镜显微镜系 统，扫描镜9、场镜10和显微物镜11位于经反射镜8反射后的光轴上， 其中，扫描镜9和场镜10组成了一个4f系统，使得入射激发光的光束大 小匹配物镜的数值孔径，并且保证在物镜入瞳位置为平行光。激发光激发样品所产生的荧光沿着原光路返回，透过二色镜7进入探测路，窄带滤波 片15、透镜16、孔阑17、透镜18、会聚透镜19和光纤束20(如图2所 示)位于反射镜14反射后的光轴之上。APD阵列21接收光纤束收集的光 子信号并与TCSPC阵列22相连实现光子计数，TCSPC阵列22与激发 光源用同步信号线相连实现脉冲同步实现荧光寿命的测量，电脑和控制器 23与激光光源1、扫描平台13和TCSPC阵列相连，用于控制整个成像过 程。

本实施例中，显微物镜11的数值孔径NA＝1.4。

采用图1所示的装置实现并行探测下超分辨荧光寿命成像方法，其过 程如下：

从激光光源1发出的激光光束，经过保偏光纤2出射后经准直透镜3 完成准直。经过准直后的光束经过1/4波片4和1/2波片5的调整为纯净 线的偏振光，线偏振光再经过快轴与线偏振方向成45度角时可以将线偏 振光转换为圆偏振光，从而有利于对荧光的激发。二色镜7将已经调整为 圆偏振光的激发光反射，激发光再经过反射镜8的反射进入由扫描镜9和 场镜10组成的4f系统，虽然本实例中采用的平台扫描而非振镜扫描，但 是该4f系统可以将激发光束进行扩束使其匹配物镜的数值孔径，同时确 保在物镜入瞳处为平行光。入射激光在被显微物镜11聚焦后激发固定在 扫描平台13上的荧光样品12，激发出来的荧光沿原光路返回，透过二色 镜7后进入探测系统，在经过窄带滤波片15对背景噪声进行过滤后，经 过透镜16和透镜18组成的4f系统进行缩束，实现探测数值孔径的减小， 让最终被会聚透镜19会聚的荧光信号光斑变大从而匹配光纤束20的大 小，其中孔阑17用来过滤一些离轴和离焦的信号，光纤束20是由61根 光纤组合而成，其光纤端面如图2所示，本方法可以实现61路并行探测。 荧光光子被光纤束收集进入探测器APD阵列21中，再利用与激光光源同 步的TCSPC阵列22的计数处理，最终能够生成快速超分辨荧光寿命成像 结果。

本发明的主要优势在于荧光寿命成像分辨率的提高和成像速度的显 著加快。图3-5为验证本方法优越性的结果图，其均为对100nm颗粒的扫 描结果的分析图，本实施例中光纤束只使用了其中7根光纤，因此也只用 了7路并行APD阵列和TCSPC阵列，作为比较的共聚焦系统所使用的是 直径大小与所使用光纤束(7根光纤)总大小相同的单根光纤。如图3所 示为100nm荧光颗粒的成像结果图，图3(a)为普通共聚焦的情况下对 100nm荧光颗粒的成像结果，而图3(b)为利用本发明的成像结果，通过 APD阵列实现了成像信噪比的显著提高，同时光子重组的算法也让成像的 分辨率有着明显提高。

而在寿命成像速度方面，对于在相同的单点扫描时间下，如图4所示， 本发明中光纤束所对应的并行探测所探测到的绝对光子数明显高于单个 光纤对应的共聚焦方法探测到的光子数(如图4(a)所示)，从而导致共聚 焦得到的荧光寿命统计直方图经过拟合后精度远逊色于本方法，在图4(b) 中为对荧光颗粒的寿命统计直方图，可以看出并行探测对应的拟合高斯曲 线的标准差要小于共聚焦所对应的拟合曲线(并行探测的拟合高斯曲线的标准差为0.2881，共聚焦的相应标准差为0.3097)，这意味着在相同的单 点扫描时间下，本发明所测得的荧光寿命成像精度要高于共聚焦系统。而 为了保证共聚焦系统和本方法都得到较为准确的荧光寿命，则必须保证两 种方法探测的光子数相当，即如图5(a)所示，而此时并行探测所测得的荧 光寿命直方图所对应的拟合高斯曲线与普通共聚焦系统所测得曲线比较 接近，各自拟合曲线的标准差也很接近，如图5(b)所示，但此时共聚焦的 单点扫描时间为本方法的2.5倍，意味着在使用7个APD和TCSPC组成 的并行探测模块，能够实现成像速度至少提高2.5倍。

以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本 发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在 本发明的保护范围之内。