一种用于生产丁位内酯的霉菌OMK-25及其应用

摘要

本发明公开了一种用于生产丁位内酯的霉菌OMK‑25及其应用，其保藏编号为CCTCC M 2017339，于2017年6月14日保藏于中国典型培养物保藏中心。本发明开发了一条由霉菌OMK‑25转化正烷酸或其酯生成对应的5‑羟基烷酸或其酯，再经后处理生成丁位内酯的路线，该正烷酸或其酯包括C6～C18的烷酸或其酯，工艺简单，收率较高，与其他丁位内酯方法不同，可以工业化生产，所得产物的对映体过量值(ee)为95％‑100％。

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵生产技术领域，具体涉及一种用于生产丁位内酯的霉菌OMK-25及其应用。

背景技术

丁位内酯(delta内酯)是用于食用香精，用作高档食用香料、日用香精和其它功能添加剂。在崇尚天然产品的时代，人们研究了丁位内酯多种生产方法。从最开始的植物提取法，如玛索亚油来源的玛索亚内酯，到现在的生物发酵法，生物转化法和酯酶催化等，如利用微生物代谢亚油酸产生丁位癸内酯，酯酶水解脂肪酸生成丁位癸内酯，酵母菌等催化不饱和内酯生成饱和内酯等各种工艺。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于生产丁位内酯的霉菌OMK-25。

本发明的另一目的在于提供一种丁位内酯的生产方法。

本发明的技术方案如下：

一种霉菌OMK-25(Mucor.sp OMK-25)，其保藏编号为CCTCC M 2017339，于2017年6月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(保藏地点为湖北省武汉市，武汉大学)。

本发明的另一技术方案如下：

上述霉菌OMK-25在生产丁位内酯中的应用。

本发明的再一技术方案如下：

一种丁位内酯的生产方法，其特征在于：以正烷酸或正烷酸酯为底物，经上述霉菌OMK-25进行发酵生产。

在本发明的一个优选实施方案中，包括如下步骤：

(1)菌种活化：将霉菌OMK-25接种于固体斜面培养基上，于28～30℃培养2～5d；上述固体斜面培养基中含有：可溶性淀粉1.5～3.0％，磷酸氢二钾0.1～1.0％，氯化钠0.05～0.3％，酵母抽提物0.1～1.0％，胰蛋白胨0.1～1.0％；

(2)种子培养：将步骤(1)所得的培养物接种至种子培养基中，于28～35℃及150～500rpm的条件下培养至对数生长期；上述种子培养基的初始pH为7.0～7.5，其中含有：可溶性淀粉2.0～3.5％，磷酸氢二钾0.1～0.5％，碳酸钙0.1～0.3％，酵母浸粉0.1～1.0％；

(3)发酵培养：将步骤(2)所得的培养物以8～12％的体积比接种至发酵培养基，于30～40℃及200～500rpm的条件下培养至发酵培养基中的葡萄糖消耗完毕后，添加所述正烷酸或正烷酸酯至终浓度为8～22g/L，并调节pH为7.0～7.5，继续发酵65～100h，生成含有5-羟基烷酸或其酯的发酵液；上述发酵培养基的初始pH为7.2～7.6，其中含有：葡萄糖2.0～5.0％，磷酸氢二钾0.1～0.3％，硫酸镁0.05～0.1％，碳酸钙0.5～2.0％，酵母浸粉0.1～1.0％，硫酸铵0.1～0.5％；

(4)对步骤(3)所得的发酵液进行后处理，得到含有相应丁位内酯的发酵液。

进一步优选的，所述步骤(3)中：将步骤(2)所得的培养物以10％的体积比接种至发酵培养基。

进一步优选的，所述发酵培养基的初始pH为7.5。

进一步优选的，所述步骤(3)中：一次性或分批添加所述正烷酸或正烷酸酯至终浓度为10～20g/L。

进一步优选的，所述步骤(4)中的后处理包括：用10％的硫酸调节步骤(3)所得的发酵液的pH至1.0～2.0所述步骤(4)中的后处理包括。

进一步优选的，所述步骤(4)中的后处理包括：用10％的硫酸调节步骤(3)所得的发酵液的pH至1.0～2.0，加热至60～80℃并保温1～2h所述步骤(4)中的后处理包括。

进一步优选的，所述正烷酸或正烷酸酯为C6～C18的正烷酸或正烷酸酯。

本发明的有益效果：

1、本发明的霉菌OMK-25可以转化正烷酸或其酯生成含有5-羟基烷酸或其酯的发酵液，进而生成丁位内酯。

2、本发明开发了一条由霉菌OMK-25转化正烷酸或其酯生成5-羟基烷酸或其酯，再酸化或升温加热生成丁位内酯的路线，该正烷酸或其酯包括C6～C18的烷酸或其酯，工艺简单，收率较高，与其他丁位内酯方法不同，可以工业化生产，所得产物的对映体过量值(ee)为95％-100％。

附图说明

图1为本发明中丁位癸内酯标准品的GC检测结果图。

图2为本发明中丁位癸内酯消旋标准品的GC手性检测结果图。

图3为本发明实施例1中的发酵液中的丁位癸内酯的GC检测结果图。

图4为本发明实施例2中的发酵液中的丁位癸内酯的GC检测结果图。

图5为本发明实施例2所得的丁位癸内酯成品的GC手性检测结果图。

图6为本发明中丁位十二内酯标准品的GC检测结果图。

图7为本发明中丁位十二内酯消旋标准品的GC手性检测结果图。

图8为本发明实施例3中的发酵液中的丁位十二内酯的GC检测结果图。

图9为本发明实施例4中的发酵液中的丁位十二内酯的GC检测结果图。

图10为本发明实施例4所得的丁位十二内酯成品的GC手性检测结果图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1

(1)菌种活化：从保存霉菌OMK-25的低温甘油管中划一满环菌液均匀涂布无菌固体斜面培养基上，于30℃培养5d；上述固体斜面培养基中含有：可溶性淀粉1.5～3.0％，磷酸氢二钾0.1～1.0％，氯化钠0.05～0.3％，酵母抽提物0.1～1.0％，胰蛋白胨0.1～1.0％；

(2)种子培养：将步骤(1)所得的培养物接种至盛装于500mL三角瓶中的50mL种子培养基中，于30℃及180rpm的条件下震荡培养16～24h至对数生长期；上述种子培养基经121℃灭菌20min，初始pH为7.2，其中含有：可溶性淀粉2.0％，磷酸氢二钾0.5％，碳酸钙0.2％，酵母浸粉1.0％，余量为水；

(3)发酵培养：将步骤(2)所得的培养物以10％的体积比接种至盛装于500mL三角瓶中的45mL发酵培养基中，于35℃及200rpm的条件下震荡培养20～27h(优选24h)至发酵培养基中的葡萄糖消耗完毕后，添加所述正癸酸或正癸酸酯至终浓度达到10g/L，并调节pH为7.0～7.5，继续发酵80h后，生成5-羟基正癸酸或其酯；上述发酵培养基经121℃灭菌20min，初始pH为7.2，其中含有：葡萄糖2.0％，磷酸氢二钾0.3％，硫酸镁0.1％，碳酸钙2.0％，酵母浸粉1.0％，硫酸铵0.5％，余量为水。

(4)用10％的硫酸调节步骤(3)所得的发酵液的pH至1.0～2.0，加热至60～80℃并保温1～2h，得到含有丁位癸内酯的发酵液；发酵结束用GC法测定发酵液中丁位癸内酯的浓度，具体的，选用丁位癸内酯标准品进行比对测定，所用的GC色谱柱型号为RTX-1701(30m*0.25μm*0.25mm ID)，进样口温度240℃，压力82.7kpa，总流量58.3mL/min，柱流量1.09mL/min，线速度27.7cm/sec，分流比50，柱温50℃保温3min，然后以5℃/min速率升温至230℃，保温20min，结果如图1和图3所示，该发酵液中的丁位癸内酯的含量为7.2g/L；

实施例2

固体斜面培养基、种子培养基和发酵培养基同实施例1；

(1)从保存霉菌OMK-25的低温甘油管中划一满环菌液均匀涂布无菌固体斜面培养基上，于30℃培养5d，用50mL无菌水把菌株从斜面上洗脱下来，形成菌悬液。把50mL菌悬液在无菌条件下接种于装有1.8L种子培养基的3L种子罐进行种子培养，通风搅拌转速300rpm，30℃培养13～18h，得到种子液；

(2)将配制好的发酵培养基16.2L装入20L发酵罐中，121℃灭菌20min，然后将培养好的1.8L种子液接入20L发酵罐中进行发酵，发酵温度35℃，搅拌转速400rpm，通气比1：0.2。发酵10h左右，即培养基中葡萄糖消耗完毕，开始添加正癸酸或正癸酸酯，可一次性添加也可以分批流加，使其终浓度达到20g/L，用酸或碱调节pH在7.0～7.5，继续发酵60h，生成含5-羟基正癸酸或其酯的发酵液；

(3)用10％的硫酸调节步骤(2)所得的发酵液的pH至1.0～2.0，加热至60～80℃并保温1～2h，得到含有丁位癸内酯的发酵液；发酵结束用GC法测定发酵液中丁位癸内酯的浓度，具体的，选用丁位癸内酯标准品进行比对测定，所用的GC色谱柱型号为RTX-1701(30m*0.25μm*0.25mm ID)，进样口温度240℃，压力82.7kpa，总流量58.3mL/min，柱流量1.09mL/min，线速度27.7cm/sec，分流比50，柱温50℃保温3min，然后以5℃/min速率升温至230℃，保温20min，结果如图1和图4所示，该发酵液中的丁位癸内酯的含量为15g/L；

(4)将步骤(3)所得的物料冷却至室温，用等量本领域常规的水不溶性有机溶剂，如乙酸乙酯、乙酸丁酯等萃取两次，通过蒸馏的方式除去有机溶剂，得到丁位癸内酯粗品256g。丁位癸内酯粗品通过精馏的方式得到纯度99％以上的丁位癸内酯成品216g，如图2和图5所示，通过GC法对该丁位癸内酯成品的对映体过量值(ee)进行检测，该步骤的GC色谱柱型号为RT-βDEXcst(30m*0.25um*0.32mm ID)，进样口温度240℃，压力20.0kpa，总流量147.1mL/min，柱流量1.43mL/min，线速度44.0cm/sec，分流比100.0，柱温80℃保温5min，然后以5℃/min升温至110℃，保温5min，再以0.5℃/min升温至130℃，保温5min，最后以5℃/min速率升温至230℃保温50min，结果其对映体过量值(ee)为100％；此外，使用WXG-4型圆盘旋光仪测量所得丁位癸内酯成品的旋光度为56°。

实施例3

固体斜面培养基、种子培养基、发酵培养基及步骤(1)和(2)同实施例1；

(3)发酵培养：将步骤(2)所得的培养物以10％的体积比接种至盛装于500mL三角瓶中的45mL发酵培养基中，于35℃及200rpm的条件下震荡培养20～27h(优选24h)至发酵培养基中的葡萄糖消耗完毕后，添加正十二烷酸或正十二烷酸乙酯至终浓度达到10g/L，并调节pH为7.0～7.5，继续发酵95h后，生成含5-羟基十二烷酸或其乙酯的发酵液；

(4)用10％的硫酸调节步骤(3)所得的发酵液的pH至1.0～2.0，加热至60～80℃并保温1～2h，得到含有丁位十二内酯的发酵液；具体的，选用丁位十二内酯标准品进行比对测定，所用的GC色谱柱型号为RTX-1701(30m*0.25μm*0.25mm ID)，进样口温度240℃；压力82.7kpa，总流量58.3mL/min，柱流量1.09mL/min，线速度27.7cm/sec，分流比50，柱温50℃保温3min，然后以5℃/min速率升温至230℃，保温20min，结果如图6和图8所示，该发酵液中丁位十二内酯的含量为6.3g/L；

实施例4

固体斜面培养基、种子培养基同实施例1，发酵培养基同实施例1；

(1)从保存霉菌OMK-25的低温甘油管中划一满环菌液均匀涂布无菌固体斜面培养基上，于30℃培养5d，用50mL无菌水把菌株从斜面上洗脱下来，形成菌悬液。把50mL菌悬液在无菌条件下接种于装有1.8L种子培养基的3L种子罐进行种子培养，通风搅拌转速300rpm，30℃培养13～18h，得到种子液；

(2)将配制好的发酵培养基16.2L装入20L发酵罐中，121℃灭菌20min，然后将培养好的1.8L种子液接入20L发酵罐中进行发酵，发酵温度35℃，搅拌转速400rpm，通气比1∶0.2。发酵10h左右，即培养基中葡萄糖消耗完毕，开始添加正十二烷酸或正十二烷酸酯，可一次性添加也可以分批流加，使其终浓度达到20g/L，并调节pH为7.0～7.5，继续发酵60h，生成含5-羟基十二烷酸或其酯的发酵液；

(3)用10％的硫酸调节步骤(2)所得的发酵液的pH至1.0～2.0，加热至60～80℃并保温1～2h，得到含有丁位十二内酯的发酵液；具体的，选用丁位十二内酯标准品进行比对测定，所用的GC色谱柱型号为RTX-1701(30m*0.25μm*0.25mm ID)，进样口温度240℃，压力82.7kpa，总流量58.3mL/min，柱流量1.09mL/min，线速度27.7cm/sec，分流比50，柱温50℃保温3min，然后以5℃/min速率升温至230℃，保温20min，结果如图6和图9所示，该发酵液中丁位十二内酯的含量为12.0g/L；

(4)将步骤(3)所得的物料冷却至室温，用等量本领域常规的水不溶性有机溶剂，如乙酸乙酯、乙酸丁酯等萃取两次，通过蒸馏的方式除去有机溶剂，得到丁位十二内酯粗品205g；丁位癸内酯粗品通过精馏的方式得到纯度99％以上的丁位癸内酯成品172g，如图7和图10所示，通过GC法对该丁位十二内酯成品的对映体过量值(ee)进行检测，该步骤的GC色谱柱型号为CP-ChirasilDex CB(25.0m*0.25um*0.25mmID)，进样口温度220℃，压力20kpa，总流量147.1mL/min，柱流量1.43mL/min，线速度44.0cm/sec，分流比100.0，柱温80℃保温5min，然后以5℃/min升温至110℃，然后保温5min，以0.5℃/min速率升温至130℃，保温5min，最后以5℃/min升温至200℃保温50min，结果其对映体过量值(ee)为99％；此外，使用WXG-4型圆盘旋光仪测量发酵丁位十二内酯的旋光度为47.8°。

本领域普通技术人员可知，本发明的技术方案在下述范围内变化时，仍然能够得到与本发明声称的技术效果，仍然属于本发明的保护范围：

一种丁位内酯的生产方法，以正烷酸或正烷酸酯为底物，经上述霉菌OMK-25进行发酵生产。优选的，所述正烷酸或正烷酸酯为C6～C18的正烷酸或正烷酸酯。具体包括如下步骤：

(1)菌种活化：将霉菌OMK-25接种于固体斜面培养基上，于28～30℃培养2～5d；上述固体斜面培养基中含有：可溶性淀粉1.5～3.0％，磷酸氢二钾0.1～1.0％，氯化钠0.05～0.3％，酵母抽提物0.1～1.0％，胰蛋白胨0.1～1.0％；

(2)种子培养：将步骤(1)所得的培养物接种至种子培养基中，于28～35℃及150～500rpm的条件下培养至对数生长期；上述种子培养基的初始pH为5～8，其中含有：可溶性淀粉2.0～3.5％，磷酸氢二钾0.1～0.5％，碳酸钙0.1～0.3％，酵母浸粉0.1～1.0％；

(3)发酵培养：将步骤(2)所得的培养物以8～12％的体积比接种至发酵培养基，于30～40℃及200～500rpm的条件下培养至发酵培养基中的葡萄糖消耗完毕后，添加所述正烷酸或正烷酸酯至终浓度为8～22g/L，并调节pH为7.0～7.5，继续发酵65～100h，生成含有5-羟基烷酸或其酯的发酵液；上述发酵培养基的初始pH为7.2～7.6，其中含有：葡萄糖2.0～5.0％，磷酸氢二钾0.1～0.3％，硫酸镁0.05～0.1％，碳酸钙0.5～2.0％，酵母浸粉0.1～1.0％，硫酸铵0.1～0.5％；。

(4)对步骤(3)所得的发酵液进行后处理，得到含有相应丁位内酯的发酵液。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。