一株高效降解佛波酯菌株及其在麻疯树饼粕发酵脱毒中的应用

摘要

本发明涉及一种功能性菌种，涉及一株高效降解佛波酯菌株及其在麻疯树饼粕发酵脱毒中的应用。一株高效降解佛波酯菌株，该菌是阴沟肠杆菌（

说明书

技术领域

本发明涉及一种功能性菌种，涉及一株高效降解佛波酯菌株及其在麻疯树饼粕发酵脱毒中的应用。

背景技术

麻疯树(Jatropha curcas)属大戟科(Euphorbiacea)麻疯树属(Jatropha)植物，分为有毒和无毒两种基因类型，其中无毒品种仅分布在墨西哥。麻疯树的种籽是麻疯树果，其种仁含油量高达60％，是制备生物柴油的理想原料。但由于其饼粕中含有胰蛋白酶抑制剂、植物凝集素、佛波醇酯等抗营养因子和毒素，使其不能直接被用作动物饲料。目前一般将其作为废弃物丢弃，不仅造成了大量的资源的浪费，还污染了环境。近年来，由于世界范围内以麻疯树为原料生产生物柴油的研究已成为热门课题，而且其成果逐步得到推广应用，致使麻疯树制备生物柴油的副产品-麻疯树饼粕的应用受到极大的关注。与其他植物源蛋白饲料类似，麻疯树饼粕通过物理化学方法(热处理、溶剂浸出、碱处理等)也可以降低或去除其抗营养因子和毒物。物理脱毒效率低，且对饼柏中的营养成分造成一定的破坏；化学脱毒操作复杂过程繁琐、易导致化学物残留，而且脱毒范围小、成本高。

利用微生物发酵工程技术进行麻疯树饼粕的全方位脱毒，不仅可降低麻疯树饼粕的毒性，增加产品的适口性，而且还可进一步提高蛋白质含量。目前，麻疯树籽饼粕发酵主要是由棉籽粕和大豆粕发酵方法演变而来，多采用单菌或混菌固态发酵，发酵菌株多是酵母和霉菌。

发明内容

本发明提供一株高效降解佛波酯菌株，该菌种从麻疯树种根系土壤中分离获得，可进行麻疯树饼粕的发酵脱毒。

本发明的技术方案是：

一株高效降解佛波酯菌株，该菌是阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)的菌株Z11，该菌株于2017年9月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，编号为CGMCCNo.14655。

所述的高效降解佛波酯菌株是从四川攀枝花麻疯树种植园麻疯树根系土壤中分离筛选、纯化得到，该菌株的生物学性质如下：

形态学特征：在LB培养基平板上形成明显菌落，乳白色，圆形或稍显圆形，边缘整齐，表面光滑，有光泽，呈扁平状，中间略微凸起，不透明。革兰氏染色为阴性。显微镜下观察，菌株细胞形态为杆状。

培养特征：最适生长温度32℃(图5)，最适生长初始pH为8(图4)，兼性厌氧。生长于LB培养基中，培养基成分：NaCl 0.5g/L，蛋白胨5.0g/L，酵母膏5.0g/L。

一种所述的高效降解佛波酯菌株在麻疯树饼粕的发酵脱毒方面的应用。作为优选，采用所述的高效降解佛波酯菌株进行麻疯树饼粕的发酵脱毒方法是：采用固态发酵或液态发酵的方式，含麻疯树饼粕的底物接种菌株Z11的菌液，菌液接种量为15％-30％，在30℃条件下发酵5-7天。

一种所述的采用高效降解佛波酯菌株进行麻疯树饼粕的发酵脱毒方法，包括如下步骤：

①活化菌株：取-80℃保存的菌液加入灭菌活化培养基中，30±2℃120rpm条件下过夜培养，得到菌株Z11的菌液，活化培养基含有NaCl 0.5g/L，蛋白胨5.0g/L和酵母膏5.0g/L；

②饼粕制作：麻疯树种子干燥后压榨脱油，取脱油麻疯树饼粕，干燥后粉碎过40目筛，121℃灭菌20min；

③固态发酵条件：干燥后的脱油麻疯树饼粕与水混合，接种菌株Z11的菌液，底物初始水分含量30％-50％，菌液接种量为15％-30％，在30℃条件下发酵5-7天。发酵后麻疯树饼粕中佛波酯含量可下降38.6％～50.7％。

本发明的有益效果是：具有高效降解佛波酯的肠杆菌菌株Z11，是为研究麻疯树饼粕脱毒机制提供有效的降解菌株，可以提高麻疯树饼粕的饲用价值。麻疯树饼粕在发酵后，其粗蛋白的含量较发酵前约有30％的提高。发酵后麻疯树饼粕中的赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸等含量都较发酵前有了一定程度的提高，发酵后饼粕中总氨基酸含量较发酵前提高18％左右，其中总必需氨基酸总量提高约16％左右，氨基酸含量平衡，齐全。发酵后麻疯树饼粕中的各类抗营养因子都有不同程度的减少。其中植酸、胰蛋白酶抑制剂和植物凝集素的含量均下降70％以上。

附图说明

图1是肠杆菌Z11在LB培养基上菌落生长结果图；

图2是肠杆菌Z11的扫描电镜图；

图3是肠杆菌Z11的生长曲线图；

图4是不同pH条件下肠杆菌Z11的生长曲线；

图5是不同温度条件下肠杆菌Z11的生长曲线；

图6是添加不同碳源条件下菌株Z11的生长图；

图7是添加不同氮源条件下菌株Z11的生长图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明提供的具有高效降解麻疯树饼粕中佛波酯的肠杆菌Z11对麻疯树饼粕中佛波酯与抗营养因子的降解功效进行说明，详细说明如后。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

佛波酯含量的测定方法：使用Agilent Extend-C18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱，流动相为乙腈：水＝80:20(V:V)，加入0.3％甲酸，检测波长280nm，流速1.0ml/min，柱温25℃，进样量10μL。使用PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate)为标准品。

实施例1：

从四川省攀枝花市麻疯树种植园区麻疯树根系土壤表层下5-10cm处取得土壤样品，经富集、筛选、纯化培养，获得28株可耐受麻疯树饼粕中佛波酯的菌株。将获得的菌株接种到麻疯树饼粕中进行摇瓶培养，通过对发酵后饼粕中佛波酯含量的测定，筛选出对佛波酯降解效果最好的菌株，记为肠杆菌Z11，该菌株在LB培养基上的菌落生长结果如图1所示。肠杆菌Z11的扫描电镜图见图2。

对编号为Z11的菌株进行革兰氏染色及生理生化鉴定，根据显色反应判定Z11为阴沟肠杆菌。肠杆菌Z11的生理生化鉴定部分结果见表1。

表1 Z11菌株生理生化特性鉴定

注：“+”号表示阳性，“-”号表示阴性。

结合形态学和生理生化鉴定结果，确定菌株Z11为Enterobacter cloacae，中文名称阴沟肠杆菌。

采用摇瓶培养基，固定摇瓶培养的其他条件后，测定肠杆菌Z11的生长曲线，见图3，并通过测量菌液于600nm的吸光度(OD₆₀₀)对温度、初始pH、最佳碳源及氮源等进行逐一优化。结果表明肠杆菌Z11最适pH值为8(图4)，最适温度为32℃(图5)，最适碳源为蔗糖(图6)，最适氮源为蛋白胨(图7)。

取一环斜面保存的肠杆菌，接入菌株活化培养基(g/L牛肉膏3g/L，蛋白胨1g/L，NaCl5g/L，pH7.0)中，32℃，150r/min条件下培养过夜。

将活化的肠杆菌Z11接种在摇瓶发酵培养基中(麻疯树饼粕5g，去离子水50mL，pH自然，121℃灭菌20min)，30℃，150rpm培养5d，离心，弃上清液，保留饼粕，65℃烘干，测得麻疯树饼粕中佛波酯含量从发酵前1.22mg/g降低至发酵后的0.37mg/g，降低69.77％。

实施例2：

选择接种量、初始加水量和发酵时间这三个因素进行试验，实验因素与水平如表2。

表2试验设计的因素与水平

试验以佛波酯的降解率为研究目标，记为变量Y，接种量、初始含水量和发酵时间3个因子为考察对象，分别记为变量X1、X2、X3。设计了3因素3水平(接种量15％，20％，30％；初始含水量30％，50％，80％；发酵时间4d，5d，6d)发酵试验。17组试验结果如表3所示。

表3响应面设计与佛波酯降解率实测值

实施例3：

将活化的肠杆菌Z11接种在麻疯树固态发酵培养基中(麻疯树饼粕干燥后，过40目，取5g，加入去离子水5mL，pH自然，121℃灭菌20min)，菌株接种量为20％，湿度50％条件下，发酵5d，发酵结束后对麻疯树饼粕发酵前后抗营养因子含量进行检测，结果见表4。根据结果可知，麻疯树饼粕中佛波酯含量下降51.6％，植酸含量下降82.56％，单宁含量下降37.80％，胰蛋白酶抑制剂含量下降90.45％，凝集素含量下降88.90％。

表4麻疯树饼粕发酵前后抗营养因子含量

根据上述实验结果，得到结论：使用肠杆菌Z11发酵麻疯树饼粕后，在降解佛波酯基础上同时减少麻疯树饼粕中的抗营养因子，并保留其主要营养成分。综合来看，该工艺具有较高的脱毒效率，经济性和环保指标均可满足实际生产需求。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。