一种基于隔离法的电化学水体急性生物毒性评价方法

摘要

本发明公开一种基于隔离法的电化学水体急性生物毒性评价方法，包括：制备微生物分散液；将微生物分散液、微生物液体培养基分别与待测物溶液、去离子水混合后放置，离心，清洗，得到实验组和对照组菌体；实验组和对照组菌体分别分散到电子介体溶液后放置，得到实验组和对照组混合液；将实验组和对照组混合液分别离心，取上清液，搅拌并施加电压，用电化学工作站进行计时电流法检测；将实验组的稳态电流i

说明书

技术领域

本发明涉及急性生物毒性检测领域。更具体地，涉及基于隔离法的一种电化学水体急性生物毒性评价方法。

背景技术

工业化的快速发展给人类生活的方方面面都带来了极大的便利，但是水污染问题也日益突出。因此，如何对水体水质进行全面、有效的检测和评价已成为一种迫切的需求。常规的理化分析方法虽然能精确分析污染物的成分，但并不能反映污染物对生物体的危害。为了弥补常规理化分析方法的不足，近几十年来人们开发出了多种基于鱼、植物、无脊椎动物、微生物等生物评价环境污染物急性毒性的方法。由于微生物具有繁殖速度快、易培养、成本低、灵敏度高、对有毒有害物质响应快、无伦理道德争议等优势，基于微生物评价环境污染物急性毒性成为研究的热点。近年来已经开发出了多种基于微生物评价环境污染物急性毒性的方法，如发光细菌法、硝化细菌法、电化学法等。

由于氧在水中的溶解浓度较低，并且不稳定，因此，利用电子介体取代溶解氧的介体型微生物传感器评价水体急性毒性是一种常用的方法。根据实验步骤的差异，该方法主要有以下两种模式：(1)微生物、电子介体和待测物直接混合，在适当条件下放置一段时间后离心分离，取上清液通过计时电流法分析还原态的电子介体的量，进而判断待测物毒性大小；(2)在计时电流法条件下先将电子介体加入到微生物溶液中产生氧化电流，待氧化电流稳定后再向溶液中加入待测物，对比加入待测物前后氧化电流的变化判断待测物毒性大小。

目前，常用的电子介体主要有中性红、甲萘醌、硫堇、苯醌、铁氰化钾、二茂铁甲醇等，而重金属离子与这些电子介体的标准还原电极电势之间存在交叉重叠，如Fe³⁺/Fe²⁺和Cu²⁺/Cu⁺的氧化还原电位分别为0.77V和0.34V，均高于苯醌/对苯二酚的氧化还原电位(0.28V)，所以电子介体的还原产物有可能被重金属离子氧化造成检测电流较真实值偏低。另外，重金属离子和一些电子介体之间还会存在鳌合作用，这也会对最终实验结果造成很大的偏差。除了电子介体与重金属离子之间的作用，重金属离子还会与缓冲溶液发生反应。这一方面会导致溶液中重金属离子的实际浓度发生变化，另一方面会改变溶液体系的pH值，从而使电子介体的电化学行为发生变化，这些最终都可能导致毒性评价结果出现偏离。

然而由目前的两种检测模式来看，尽管在步骤上存在一定的差异，但实验过程中微生物、电子介体和待测物三者都是直接接触混合。目前的研究完全忽视了电子介体与待测物之间的化学反应、待测物与缓冲溶液之间的反应以及pH的变化对电子介体的影响这些干扰因素的存在。所以，以往介体型微生物传感器评价水体急性生物毒性的实验过程中观察到的电流值的变化不一定是由于待测物毒性所造成的，实验结果存在很大的误差。

因此，需要提供一种水体急性生物毒性评价的新方法，以解决上述至少一个问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于将待测物同电子介体、缓冲液分开的隔离法的电化学水体急性生物毒性评价方法，该方法先将待测物溶液和微生物分散液混合放置，待毒性效果产生后通过离心分离除去待测物，再将得到的微生物分散在电子介体溶液中放置一段时间，最后离心分离取上清液通过计时电流法进行毒性评价，可以有效避免目前检测过程中电子介体与待测物之间的化学反应、待测物与缓冲溶液之间的反应以及pH的变化对电子介体的影响等干扰因素的影响，使实验更加真实、可靠地反映出水体急性生物毒性。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明提供了一种基于隔离法的电化学水体急性生物毒性评价方法，包括以下步骤：

1)微生物菌种接种于微生物液体培养基中培养，离心，清洗，得到湿菌体，将湿菌体分散到去离子水中，调整吸光度值OD₆₀₀，得到微生物分散液；

2)将微生物分散液、微生物液体培养基和待测物溶液混合后放置，离心，清洗，得到实验组菌体；

将微生物分散液、微生物液体培养基和去离子水混合后放置，离心，清洗，得到对照组菌体；

3)将实验组菌体和对照组菌体分别分散到电子介体溶液后放置，得到实验组混合液和对照组混合液；

4)将实验组混合液和对照组混合液分别离心，取上清液，搅拌并施加电压，用电化学工作站进行计时电流法检测，得到实验组的稳态电流和对照组的稳态电流；

5)将实验组的稳态电流和对照组的稳态电流通过以下公式进行抑制率计算，评价待测物溶液的毒性：

抑制率(inhibition，％)＝(1-i_e/i_c)×100％

式中i_c为对照组的稳态电流，i_e为实验组的稳态电流；

当抑制率为50％时的有毒物质的浓度为该有毒物质的IC₅₀值，IC₅₀值能够间接反应水体急性生物毒性的大小。将上述得到的抑制率结果进行拟合得到抑制率曲线，从而算得对应物质的IC₅₀值。

进一步，所述微生物分散液的吸光度值OD₆₀₀为2.5～3.5。

进一步，所述微生物菌种包括但不限于大肠杆菌、酵母细胞、枯草芽孢杆菌。

进一步，步骤2)中微生物分散液、微生物液体培养基和待测物溶液的体积比为1:1:1～1:1:2；微生物分散液、微生物液体培养基和去离子水的体积比为1:1:1～1:1:2。所述微生物分散液、微生物液体培养基和待测物溶液的混合液与所述微生物分散液、微生物液体培养基和去离子水的混合液体积相同。

进一步，步骤2)所述微生物分散液、微生物液体培养基和待测物溶液的混合液和步骤3)所述电子介体溶液体积比为2:5。

进一步，步骤3)所述电子介体溶液的浓度为30mM～50mM；所述电子介体包括但不限于铁氰化钾、苯醌、二茂铁甲醇；电子介体溶液的制备方法为：将电子介体溶于呼吸基质溶液中；其中，所述呼吸基质溶液的各组分及浓度为：5mM～20mM葡萄糖、5mM～20mM丁二酸钠；其制备方法为：将各组分按照浓度配比溶于缓冲液中，即可；优选的为磷酸缓冲液。

进一步，步骤4)所述施加的电压为0.5V～0.8V vs Ag/AgCl。

进一步，所述微生物液体培养基的各组分及浓度为：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L和氯化钠5g/L；制备方法为：将各组分按照浓度配比加入到去离子水中进行调配，配好后用2M氢氧化钠溶液调节pH到7.3～7.5，在120℃高温高压灭菌20min，即可。

进一步，所述培养的条件为在37℃恒温摇床中培养16h；所述放置的温度均为37℃，时间均为30min～60min；所述离心的条件均为在5000～6000rpm下，离心5～10min；所述清洗均为用去离子水清洗两次，每次5～10min。

本发明表明金属离子同电子介体作用、金属离子同缓冲液作用和pH对电子介体电化学性能影响均对水体急性生物毒性评价结果产生一定的影响，因此将待测物同电子介体、缓冲液进行隔离，相对于以往的介体型微生物传感器检测水体急性生物毒性的方法来说，最大限度地避免检测过程中电子介体与待测物之间的化学反应、待测物与缓冲溶液之间的反应以及pH的变化对电子介体的影响等干扰因素，有效地提高检测的灵敏度以及准确性。

本发明的有益效果如下：

本发明基于隔离法的电化学水体急性生物毒性评价方法操作简单，适用于各种重金属离子以及实际样品的急性生物毒性的检测，对水体急性生物毒性评价有很大的指导意义。

利用本发明方法进行水体急性生物毒性评价时，将待测物同电子介体、缓冲液进行隔离，一方面，有效避免了电子介体与待测物的接触，从而排除重金属离子与电子介体发生氧化还原作用或者鳌合作用对实验结果造成的误差；另一方面，有效避免了缓冲液与待测物的接触，从而排除重金属离子与缓冲液的沉降作用所导致的重金属离子浓度变化以及体系pH变化所造成的实验结果误差。而这种缓冲液与待测物之间的作用不能通过更换缓冲液得到改善。通过排除上述干扰因素的影响，提高了实验结果的灵敏性以及准确度，能够更加真实、可靠地反映出待测物质的生物毒性。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出本发明方法基于隔离法的电化学水体急性生物毒性评价方法的流程图。

图2示出实施例1的检测不同浓度的Cu²⁺的计时电流曲线。

图3示出实施例2的检测不同浓度的Cd²⁺的计时电流曲线。

图4示出实施例3的检测不同浓度的Zn²⁺的计时电流曲线。

图5示出实施例4的检测不同浓度的Fe³⁺的计时电流曲线。

图6示出实施例5的检测不同实际样品的计时电流曲线。

图7示出金属离子同电子介体作用对毒性评价影响结果图。

图8示出金属离子同缓冲溶液作用对毒性评价影响结果图。

图9示出pH对电子介体电化学性能影响结果图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1 一种基于隔离法的电化学水体急性生物毒性评价方法

一种基于隔离法的电化学水体急性生物毒性评价方法，如图1所示，包括以下步骤：

1)用接种环取定量大肠杆菌(E.coli)纯菌种接种于100mL的微生物液体培养基中在37℃恒温摇床中培养16h后，6000rpm离心5min，用去离子水离心清洗2次，得到湿菌体，将得到的湿菌体分散在去离子水中，并在紫外分光光度计下调整其OD₆₀₀为3.0，得到大肠杆菌分散液，保存在4℃下，备用；

其中，E.coli的微生物液体培养基成分及浓度为：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L和氯化钠5g/L，制备方法为：将各组分按照浓度配比加入到去离子水中进行调配，配好后用2M的氢氧化钠溶液调节pH到7.4，在120℃高温高压灭菌20min；

2)取6个5mL的试管，编号1～6，分别向各个试管中加入1mL步骤1)得到的大肠杆菌分散液和1mL的微生物液体培养基，1试管作为对照组，向其中加入2mL的去离子水，2～6试管作为实验组，并向其中分别加入2mL不同浓度的Cu²⁺待测液，使1～6试管中Cu²⁺的最终浓度依次为0，5，10，15，20，25mg/L，混合均匀，在37℃下混合放置60min，待毒性效果产生后，将混合液在5000rpm离心分离5min，并用去离子水清洗两次，每次7min，得到对照组菌体和实验组菌体；

3)将步骤2)最终得到对照组菌体和实验组菌体分别分散到浓度为45mM的10mL电子介体溶液中在37℃下放置1h，得到对照组混合液和实验组混合液；

其中，所述的电子介体溶液得制备方法为将铁氰化钾溶于呼吸基质溶液中；其中，所述呼吸基质溶液的各组分及浓度为：10mM葡萄糖、10mM丁二酸钠；其制备方法为：将各组分按照浓度配比溶于磷酸缓冲液中；

4)将步骤3)中放置好的对照组混合液和实验组混合液在6000rpm下离心分离5min，取上清液在连续恒定的搅拌条件下施加0.5V vs Ag/AgCl的电压，用电化学工作站进行计时电流法检测，得到实验组的稳态电流和对照组的稳态电流；

5)将步骤4)得到的实验组的稳态电流和对照组的稳态电流通过以下公式进行抑制率计算，以评价待测物溶液的毒性：

抑制率(inhibition，％)＝(1-i_e/i_c)×100％

式中i_c为对照组的稳态电流，i_e为实验组的稳态电流。

图2是实施例1中检测不同浓度Cu²⁺对大肠杆菌生物毒性的计时电流曲线，其中1～6中Cu²⁺的浓度依次为0，5，10，15，20，25mg/L，对应的抑制率分别为0，11.32％，16.83％，24.10％，40.62％，72.31％，所得到的IC₅₀为21.3mg/L。从图中可以看出，Cu²⁺的浓度越大，稳定电流越小；稳定电流越大，表明大肠杆菌的呼吸作用越强，该浓度下Cu²⁺对大肠杆菌的毒害作用较低，所产生的抑制率越小；稳定电流越小，表明大肠杆菌的呼吸作用越弱，该浓度下Cu²⁺对大肠杆菌的毒害作用较高，所产生的抑制率越大。

实施例2 一种基于隔离法的电化学水体急性生物毒性评价方法

一种基于隔离法的电化学水体急性生物毒性评价方法，包括以下步骤：

1)用接种环取定量大肠杆菌(E.coli)纯菌种接种于100mL的微生物液体培养基中在37℃恒温摇床中培养16h后，6000rpm离心5min，用去离子水离心清洗2次，得到湿菌体，将得到的湿菌体分散在去离子水中，并在紫外分光光度计下调整其OD₆₀₀为2.5，得到大肠杆菌分散液，保存在4℃下，备用；

其中，E.coli的微生物液体培养基成分及最终浓度为：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L和氯化钠5g/L，制备方法为：将各组分按照浓度配比加入到去离子水中进行调配，配好后用2M的氢氧化钠溶液调节pH到7.3，在120℃高温高压灭菌20min；

2)取6个5mL的试管，编号1～6，分别向各个试管中加入2mL步骤1)得到的大肠杆菌分散液和2mL的微生物液体培养基，1试管作为对照组，向其中加入2mL的去离子水，2～6试管作为实验组，并向其中分别加入2mL不同浓度的Cd²⁺待测液，使1～6试管中Cd²⁺的最终浓度依次为0，2，4，8，12,16mg/L，混合均匀，在37℃下混合放置30min，待毒性效果产生后，将混合液在5000rpm离心分离5min，并用去离子水清洗两次，每次5min，得到对照组菌体和实验组菌体；

3)将步骤2)最终得到对照组菌体和实验组菌体分别分散到浓度为30mM的15mL电子介体溶液中并均匀混合，再在37℃下放置1h，得到对照组混合液和实验组混合液；

其中，所述的电子介体溶液得制备方法为将铁氰化钾溶于呼吸基质溶液中；其中，所述呼吸基质溶液的各组分及浓度为：5mM葡萄糖、5mM丁二酸钠；其制备方法为：将各组分按照浓度配比溶于磷酸缓冲液中；

4)将步骤3)中放置好的对照组混合液和实验组混合液在6000rpm下离心分离5min，取上清液在连续恒定的搅拌条件下施加0.8V vs Ag/AgCl的电压，用电化学工作站进行计时电流法检测，得到实验组的稳态电流和对照组的稳态电流；

5)将步骤4)得到的实验组的稳态电流和对照组的稳态电流通过以下公式进行抑制率计算，以评价待测物溶液的毒性：

抑制率(inhibition，％)＝(1-i_e/i_c)×100％

式中i_c为对照组的稳态电流，i_e为实验组的稳态电流。

图3是实施例2中检测不同浓度Cd²⁺对大肠杆菌生物毒性的计时电流曲线，其中1～6中Cd²⁺的浓度依次为0，2，4，8，12,16mg/L，对应的抑制率分别为0，33.33％，52.46％，59.02％，65.81％，75.91％，所得到的IC₅₀为3.7mg/L。稳定电流越大，表明大肠杆菌的呼吸作用越强，该浓度下Cd²⁺对大肠杆菌的毒害作用较低，所产生的抑制率越小；稳定电流越小，表明大肠杆菌的呼吸作用越弱，该浓度下Cd²⁺对大肠杆菌的毒害作用较高，所产生的抑制率越大。

实施例3 一种基于隔离法的电化学水体急性生物毒性评价方法

一种基于隔离法的电化学水体急性生物毒性评价方法，包括以下步骤：

1)用接种环取定量大肠杆菌(E.coli)纯菌种接种于100mL的微生物液体培养基中在37℃恒温摇床中培养16h后，5000rpm离心10min，用去离子水离心清洗2次，每次10min得到湿菌体，将得到的湿菌体分散在去离子水中，并在紫外分光光度计下调整其OD₆₀₀为3.5，得到大肠杆菌分散液，保存在4℃下，备用；

其中，E.coli的微生物液体培养基成分及最终浓度为：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L和氯化钠5g/L，制备方法为：将各组分按照浓度配比加入到去离子水中进行调配，配好后用2M的氢氧化钠溶液调节pH到7.5，随后在120℃高温高压灭菌20min。

2)取6个5mL的试管，编号1～6，分别向各个试管中加入1mL步骤1)得到的大肠杆菌分散液和1mL的微生物液体培养基，1试管作为对照组，向其中加入2mL的去离子水，2～6试管作为实验组，并向其中分别加入2mL不同浓度的Zn²⁺待测液，使1～6试管中Zn²⁺的最终浓度依次为0，10，20，30，40,50mg/L，混合均匀，在37℃下混合放置60min，待毒性效果产生后，将混合液在6000rpm离心分离5min，并用去离子水清洗两次，每次5min，得到对照组菌体和实验组菌体；

3)将步骤2)最终得到对照组菌体和实验组菌体分别分散到浓度为50mM的10mL电子介体溶液中并均匀混合，再在37℃下放置1h，得到对照组混合液和实验组混合液；

其中，所述电子介体溶液得制备方法为将铁氰化钾溶于呼吸基质溶液中；其中，所述呼吸基质溶液的各组分及浓度为：20mM葡萄糖、20mM丁二酸钠；其制备方法为：将各组分按照浓度配比溶于磷酸缓冲液中；

4)将步骤3)中放置好的对照组混合液和实验组混合液在6000rpm下离心分离5min，取上清液在连续恒定的搅拌条件下施加0.6V vs Ag/AgCl的电压，用电化学工作站进行计时电流法检测，得到实验组的稳态电流和对照组的稳态电流；

5)将步骤4)得到的实验组的稳态电流和对照组的稳态电流通过以下公式进行抑制率计算，以评价待测物溶液的毒性：

抑制率(inhibition，％)＝(1-i_e/i_c)×100％

式中i_c为对照组的稳态电流，i_e为实验组的稳态电流。

图4是实施例3中检测不同浓度Zn²⁺对大肠杆菌生物毒性的计时电流曲线，其中1～6中Zn²⁺的浓度依次为0，10，20，30，40，50mg/L，对应的抑制率分别为0，26.04％，37.85％，55.94％，65.41％，63.82％，所得到的IC₅₀为26.7mg/L。稳定电流越大，表明大肠杆菌的呼吸作用越强，该浓度下Zn²⁺对大肠杆菌的毒害作用较低，所产生的抑制率越小；稳定电流越小，表明大肠杆菌的呼吸作用越弱，该浓度下Zn²⁺对大肠杆菌的毒害作用较高，所产生的抑制率越大。

实施例4 一种基于隔离法的电化学水体急性生物毒性评价方法

一种基于隔离法的电化学水体急性生物毒性评价方法，包括以下步骤：

1)用接种环取定量大肠杆菌(E.coli)纯菌种接种于100mL的微生物液体培养基中在37℃恒温摇床中培养16h后，6000rpm离心5min，用去离子水离心清洗2次，每次8min,得到湿菌体，将得到的湿菌体分散在去离子水中，并在紫外分光光度计下调整其OD₆₀₀为3.5，得到大肠杆菌分散液，保存在4℃下，备用；

其中，E.coli的微生物液体培养基成分及最终浓度为：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L和氯化钠5g/L，制备方法为：将各组分按照浓度配比加入到去离子水中进行调配，配好后用2M的氢氧化钠溶液调节pH到7.5，随后在120℃高温高压灭菌20min；

2)取6个5mL的试管，编号1～6，分别向各个试管中加入1mL步骤1)得到的大肠杆菌分散液和1mL的微生物液体培养基，1试管作为对照组，向其中加入2mL的去离子水，2～6试管作为实验组，并向其中分别加入2mL不同浓度的Fe³⁺待测液，使1～6试管中Fe³⁺的最终浓度依次为0，50，100，150，200，250mg/L，混合均匀，在37℃下混合放置60min，待毒性效果产生后，将混合液在5000rpm离心分离5min，并用去离子水清洗两次，每次10min，得到对照组菌体和实验组菌体；

3)将步骤2)最终得到对照组菌体和实验组菌体分别分散到浓度为45mM的10mL的电子介体溶液中在37℃下放置1h，得到对照组混合液和实验组混合液；

其中，所述的电子介体溶液得制备方法为将铁氰化钾溶于呼吸基质溶液中；其中，所述呼吸基质溶液的各组分及浓度为：10mM葡萄糖、10mM丁二酸钠；其制备方法为：将各组分按照浓度配比溶于磷酸缓冲液中；

4)将步骤3)中放置好的对照组混合液和实验组混合液在6000rpm下离心分离5min，取上清液在连续恒定的搅拌条件下施加0.5V vs Ag/AgCl的电压，用电化学工作站进行计时电流法检测，得到实验组的稳态电流和对照组的稳态电流；

5)将步骤4)得到的实验组的稳态电流和对照组的稳态电流通过以下公式进行抑制率计算，以评价待测物溶液的毒性：

抑制率(inhibition，％)＝(1-i_e/i_c)×100％

式中i_c为对照组的稳态电流，i_e为实验组的稳态电流。

图5是实施例4中检测不同浓度Fe³⁺对大肠杆菌生物毒性的计时电流曲线，其中1～6中Fe³⁺的浓度依次为0，50，100，150，200，250mg/L，对应的抑制率分别为0，13.65％，10.90％，15.97％，17.54％，14.36％。稳定电流越大，表明大肠杆菌的呼吸作用越强，该浓度下Fe³⁺对大肠杆菌的毒害作用较低，所产生的抑制率越小；稳定电流越小，表明大肠杆菌的呼吸作用越弱，该浓度下Fe³⁺对大肠杆菌的毒害作用较高，所产生的抑制率越大。

实施例5 一种基于隔离法的电化学水体急性生物毒性评价方法

一种基于隔离法的电化学水体急性生物毒性评价方法，包括以下步骤：

1)用接种环取定量大肠杆菌(E.coli)纯菌种接种于100mL的微生物液体培养基中在37℃恒温摇床中培养16h后，6000rpm离心8min，用去离子水离心清洗2次，每次10min，得到湿菌体，将得到的湿菌体分散在去离子水中，并在紫外分光光度计下调整其OD₆₀₀为3.5，得到大肠杆菌分散液，保存在4℃下，备用；

其中，E.coli的微生物液体培养基成分及浓度为：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L和氯化钠5g/L，制备方法为：将各组分按照浓度配比加入到去离子水中进行调配，配好后用2M的氢氧化钠溶液调节pH到7.5，在120℃高温高压灭菌20min；

2)取5个5mL的试管，编号1～5，分别向各个试管中加入2mL步骤1)得到的大肠杆菌分散液和2mL的微生物液体培养基，1试管作为对照组，向其中加入2mL的去离子水，2～5试管作为实验组，向其中分别加入2mL自来水、垃圾填埋场废水、化学实验室废水和电镀废水，混合均匀，在37℃下混合放置45min，待毒性效果产生后，将混合液在5500rpm离心分离8min，并用去离子水清洗两次，每次10min，得到对照组菌体和实验组菌体；

3)将步骤2)最终得到对照组菌体和实验组菌体分别分散到浓度为45mM的15mL电子介体溶液中并均匀混合，再在37℃下放置1h，得到对照组混合液和实验组混合液；

其中，所述的电子介体溶液得制备方法为将铁氰化钾溶于呼吸基质溶液中；其中，所述呼吸基质溶液的各组分及浓度为：10mM葡萄糖、10mM丁二酸钠；其制备方法为：将各组分按照浓度配比溶于磷酸缓冲液中；

4)将步骤3)中放置好的对照组混合液和实验组混合液在6000rpm下离心分离5min，取上清液在连续恒定的搅拌条件下施加为0.5V vs Ag/AgCl的电压，用电化学工作站进行计时电流法检测，得到实验组的稳态电流和对照组的稳态电流；

5)将步骤4)得到的实验组的稳态电流和对照组的稳态电流通过以下公式进行抑制率计算，以评价待测物溶液的毒性：

抑制率(inhibition，％)＝(1-i_e/i_c)×100％

式中i_c为对照组的稳态电流，i_e为实验组的稳态电流。

图6是实施例5中检测不同实际样品对大肠杆菌生物毒性的计时电流曲线，其中1～5分别为对照组、自来水、垃圾填埋场废水、化学实验室废水和电镀废水，对应的抑制率分别为0，1.94％，23.32％，60.14％，87.92％。稳定电流越大，表明大肠杆菌的呼吸作用越强，该实际样品对大肠杆菌的毒害作用较低，所产生的抑制率越小；稳定电流越小，表明大肠杆菌的呼吸作用越弱，该实际样品对大肠杆菌的毒害作用较高，所产生的抑制率越大。

试验例

1、金属离子同电子介体作用对毒性评价影响

计时电流法条件下向电子介体溶液中加入Fe³⁺、Cu²⁺、Zn²⁺溶液。

其中，计时电流法在连续恒定搅拌下进行，所施加的氧化电位为0.9V vs Ag/AgCl；所用的电子介体溶液为亚铁氰化钾溶液，浓度为2mM；Fe³⁺、Cu²⁺、Zn²⁺的加入时刻分别为300s、400s和500s；Fe³⁺、Cu²⁺、Zn²⁺的终浓度均为50mg/L。

图7给出了金属离子同电子介体作用对毒性评价影响结果图。在计时电流条件下向亚铁氰化钾溶液中加入Fe³⁺、Cu²⁺或者Zn²⁺，稳态电流显著降低，这表明金属离子会与电子介体产生作用，从而对金属离子急性毒性评价的实际结果产生影响。

2、金属离子同缓冲液作用对毒性评价影响

向一定体积的缓冲液中加入不同种类的重金属离子，用pH计检测加入金属离子之后缓冲溶液的pH变化。

其中，所用的缓冲液为磷酸缓冲液；所加的金属离子为Fe³⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Pb²⁺、Ag⁺。

图8给出了金属离子同缓冲液作用对毒性评价影响结果图。金属离子的加入，磷酸缓冲液的pH会产生变化，这表明金属离子会与缓冲液产生作用，从而对金属离子的急性毒性评价的实际结果会产生影响。

3、pH对电子介体电化学性能影响

在不同pH下，利用电化学工作站测量电子介体的循环伏安曲线。

其中，所用的电子介体为铁氰化钾；pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。

图9给出了pH对电子介体电化学性能影响结果图。随着pH的从5.0增大至9.0，铁氰化钾的氧化峰电流不断增大，这表明金属离子与缓冲液作用做引起的pH的变化还会影响电子介体的电化学性能，从而对测量的实际结果产生影响。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。