一种利用松萝检测放射性气体氡对植物DNA损伤的评价方法

摘要

一种利用松萝检测放射性气体氡对植物DNA损伤的评价方法，将松萝置于氡室中，置氡完成后提取细胞核，再进行单细胞凝胶电泳实验，采用CASP系统，测量DNA迁移的参数，评价DNA的损伤程度。本发明首次采用松萝做为植物材料，用来反映氡对植物DNA的损伤；采用机械分离和酶处理相结合的方法分离植物茎叶中的细胞核，获得了数量适中的完整细胞核，解决了彗星实验在植物领域应用困难的问题；确定了拖尾长度(Tail length)，尾部DNA相对含量(Tail DNA)，尾动量(TM)和Olive尾动量(OTM)能够反映这植物DNA损伤的程度，为研究氡对生物的作用提供更多依据。

说明书

技术领域

本发明属于大气污染物毒性评价技术领域，具体涉及放射性气体氡对植物DNA损伤的评价方法。

背景技术

氡(²²²Rn)是铀(²³⁸U)衰变链中镭(²²⁶Ra)的衰变产物，半衰期为3.82d。由于²²⁶Ra广泛存在于岩石、土壤等各种地质环境中，所以氡广泛存在于大气中，是自然界最主要的天然放射性气体。氡在人体肺部的累积，易引致肺癌及其他癌病，已引起世界各国政府和人们的高度重视。国际癌症研究机构(IARC)已将氡及其子体归为I类致癌因素，世界卫生组织(WHO)也把氡作为19种人类致癌因子之一。

氡及其他辐射性物质对动物体的损伤是显而易见的，特别是对DNA的影响。在外源性物质引起细胞的癌变过程中，DNA损伤常常在启动阶段发生，损伤的DNA如不能完全修复则可能引起相关的基因突变。苗超等(2005)发现氡及其子体可引起小鼠贫血症状，并在较高剂量下抑制骨髓细胞的DNA合成。

但是，氡对植物体的影响却一直少有研究。虽然Batlle等推测植物可通过表面的沉积作用吸附氡子体，植被的存在也能促进氡析出率，谷民天等研究认为松萝在氡胁迫下没有表现出明显的生理损伤特征，但氡对植物DNA是否能像对动物体一样造成损伤却一直未有报道。

.单细胞凝胶电泳(Single Cell Gel Electropho risis,SCGE),又称为彗星实验(Comet assay), 是一种快速、简单、可靠的的基因毒性研究方法,被广泛应用于基因毒性的研究。但是在以往的研究中，彗星实验的研究对象主要集中在动物细胞和人类细胞DNA损伤的检测上，这是由于植物和动物在细胞结构上存在着明显的差别：植物细胞具有牢固的细胞壁，造成细胞核的分离困难，因而限制了彗星实验技术在植物领域中的应用。

植物毒性评价系统是进行环境污染原位监测的最好方法之一，建立环境污染引起植物 DNA损伤的监测系统,及时有效地进行环境污染风险评价。直到1996年Koppen第一次报道了利用植物为实验材料进行彗星实验。近年来植物彗星实验有了较大发展，但并非所有植物都可以应用于彗星实验。而且，由于不同植物材料具有不同的结构和组分，适合一种植物的细胞核制备方法并不一定适合于其它植物。

松萝(Tillandsia usneoides)隶属于凤梨科、铁兰属，不需要生长于土壤中，直接悬挂于岩石、铁丝等处即可生长，因此又被称为“空气植物”。松萝利用叶片吸收空气中的水分和养分，因此叶片吸收能力强大，对大气中的很多污染物具有很强的吸收效能，是一种著名的指示植物。早在1952年，MacIntire等首次通过松萝测定了雨水中氟及其氟化物的含量。后来Calasans 和Malm(1997)又发现松萝能迅速和有效地积累漂浮在空中的汞离子。作为常用的大气污染指示植物，松萝与其他植物相比，与大气中的污染物(包括氡)的关系更为紧密，受大气污染物的影响也更为显著。

发明内容

针对目前没有检测放射性气体氡对植物DNA损伤的方法，彗星实验技术在植物领域中的应用受限的上述问题，本发明提供一种利用松萝检测天然放射性气体氡对生物损伤的评价方法，该方法以松萝为检测样本，利用提取松萝茎、叶细胞核的新方法，建立了适合松萝的彗星实验方法，从而首次确定了一种植物可反映氡对植物DNA的损伤。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种利用松萝检测放射性气体氡对植物DNA损伤的评价方法，将松萝置于氡室中，置氡完成后提取细胞核，再进行单细胞凝胶电泳实验，采用CASP系统，测量DNA迁移的参数，评价DNA的损伤程度，所述提取细胞核的具体步骤为：

①预处理：去掉松萝的根及茎叶表面鳞片；

②研磨：松萝茎、叶用双蒸水冲洗、放入预冷的研钵中，快速研磨至碎，并匀浆；

③去杂质：用预冷的解剖针挑取匀浆中的杂质出来，再用提取液提取；

④提取分离：加入2％纤维素酶和果胶酶混合液，混匀后于4℃静置2h，梯度离心收获；

⑤洗涤备用：用磷酸(PBS)缓冲液重复洗涤细胞2次，将细胞悬于PBS缓冲液中，置4℃冰箱，备用。

进一步地，所述单细胞凝胶电泳实验包括以下步骤：

①铺胶：0.75％琼脂糖凝胶煮沸后取100μl迅速均匀铺于微电泳槽内，置于4℃冰箱1min 使凝胶固化，取制好的细胞悬液25μl与75μl 0.75％低熔点琼脂糖凝胶混匀后均匀铺于第一层凝胶上面，置于4℃冰箱固化1min；

②裂解：将微电泳槽置于新鲜配制的碱性裂解液中，4℃冰箱中裂解2h，所述碱性裂解液含有2.5mol·L^-1NaCl、0.1mol·L^-1EDTA、10mol·L^-1Tris-HCl、1％Na-lauroylsarcosine，其>

③电泳：裂解后取出微电泳槽，用双蒸水漂洗去掉多余的盐分，置于提前加入4℃碱性电泳液的水平电泳仪中静置20min，然后在20V，200mA电泳条件下电泳20min；

④染色和观察：2μg/ml溴化乙锭(EB)染色，双蒸水漂洗，去掉多余染液，先在荧光显微镜低倍镜下观察彗星细胞，然后在高倍镜下，用图像采集系统随机抓取彗星细胞图像。

进一步地，所述抓取的彗星细胞图像采用CASP系统自动分析，测量DNA迁移的参数，评价DNA的损伤程度。

进一步地，表征DNA的损伤程度的参数包括：拖尾长度(Tail length)，尾部DNA相对含量(Tail DNA)，尾动量(TM)和Olive尾动量(OTM)。

进一步地，所述去除茎叶表面鳞片的具体方法为：用透明胶带粘附松萝叶片的上表面和下表面。

本发明首次采用松萝做为植物材料，用来反映氡对植物DNA的损伤；采用机械分离和酶处理相结合的方法分离植物茎叶中的细胞核，获得了数量适中的完整细胞核，解决了彗星实验在植物领域应用困难的问题；确定了拖尾长度(Tail length)，尾部DNA相对含量(Tail DNA)，尾动量(TM)和Olive尾动量(OTM)能够反映这植物DNA损伤的程度，为研究氡对生物的作用提供更多依据。

附图说明

图1为扫描电镜下松萝叶表面鳞片；

图2为单细胞凝胶电泳检测氡处理引起松萝DNA损伤图像；图中，A，对照；B，2530Bq.m^-3氡处理；C，3910Bq.m^-3氡处理；

图3为氡浓度与松萝细胞DNA损伤指标间的关系。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。

实施例

1、植物样品置氡

选择松萝做为实验材料。因松萝为附生植物，不需生长在土壤中，呈丛状。所以用天平称取3丛生长健康的松萝，每丛200g，将其分为对照组(对照组的作用体现在表1中，有对照才能比较出损伤的程度)和两个实验组。对照组置于正常环境中(氡浓度约为20Bq/m³)，实验组置于1m³氡室中进行处理，初始暴露浓度分别为3910和2530Bq/m³。以细线将松萝均匀悬挂于氡室中固定位置。通过氡源(²²⁶Ra)充入氡气体，让氡室内浓度上升到初始浓度，停止供氡，使植物持续暴露于氡室中72个小时。

2、单细胞凝胶电泳(SCGE)检测植物DNA损伤：

(1)植物茎叶细胞核的提取：

细胞核分离即获得一定数量的、完整的植物细胞核是植物彗星实验的前提，也是影响实验结果的主要因素之一，因此选择合适的细胞核分离方法十分重要。植物细胞外面有一层相对坚硬的细胞壁，阻止了DNA在电场中的迁移，所以必须采用特殊的手段除去植物的细胞壁，获得游离植物细胞核，用于彗星实验。目前来看，机械分离和酶处理都是分离植物细胞核的有效方法，但是酶处理过程所需时间较长，在此期间植物可能会部分修复已经产生的 DNA损伤，影响实验结果的准确性。因此，目前植物彗星实验多采用生长代谢旺盛的根尖细胞、利用叶片细胞进行彗星实验的较少，而没有利用植物茎上细胞进行彗星实验的报道。

松萝呈丛状生长，根只起附着作用，没有吸收功能，茎叶连接在一起，很难将其分离开来，而且其茎、叶表面覆盖有厚厚的鳞片，如图1所示，鳞片多由死细胞构成，不能用于分离细胞核，这给本实验造成了更多困难。基于松萝的特点，在本实验中不将茎、叶分享开来，采用机械分离和酶处理相结合的方法分离植物茎叶中的细胞核,获得了数量适中的完整细胞核进行彗星实验，而且耗时较短。

具体步骤：

①人工去根：植物样品置氡完成后先用剪刀把松萝根去掉，防止其对提取细胞核的不利影响。

②人工去除茎叶表面鳞片：用透明胶带粘附松萝叶片的上表面和下表面5-6次，去除其叶表鳞片。利用显微镜观察鳞片是否去除完全，以决定是否进行二次去除，直至符合标准，减少鳞片对分离细胞核的不利影响。

③植物茎、叶研磨：将根、鳞片处理完成后的松萝的茎、叶用双蒸水冲洗、放入预冷的研钵中，快速研磨至碎，以利于分离细胞核。

④解剖针挑取杂质：因是对松萝茎、叶一起进行研磨，不利提取细胞核的杂质会更多，它们来源于细胞壁、纤维束等结构。故研磨后先用预冷的解剖针挑取匀浆中的杂质出来，再用提取液提取。

⑤提取分离：加入2％纤维素酶和果胶酶混合液，混匀后于4℃静置2h，梯度离心收获，显微镜下观察细胞核形态完整。

⑥洗涤备用：磷酸(PBS)缓冲液重复洗涤细胞2次，将细胞悬于PBS缓冲液中，置4℃冰箱，备用。

(2)碱性单细胞凝胶电泳实验：

①铺胶：0.75％正常熔点琼脂糖凝胶煮沸后取100μl迅速均匀铺于微电泳槽内，置于4℃冰箱1min使凝胶固化，取制好的细胞悬液25μl与75μl 0.75％低熔点琼脂糖凝胶混匀后均匀铺于第一层凝胶上面，置于4℃冰箱固化1min。

②裂解：将微电泳槽置于新鲜配制的碱性裂解液中，4℃冰箱中裂解2h；碱性裂解液含有2.5mol·L^-1NaCl、0.1mol·L^-1EDTA、10mol·L^-1Tris-HCl、1％Na-lauroylsarcosine，其pH>

③裂解后取出微电泳槽，用双蒸水漂洗去掉多余的盐分，置于提前加入4℃碱性电泳液的水平电泳仪中静置20min，然后在20V，200mA电泳条件下电泳20min。

④染色和观察：2μg/ml溴化乙锭(EB)染色，双蒸水漂洗，去掉多余染液，先在荧光显微镜低倍镜下观察彗星细胞，然后在高倍镜下，用图像采集系统随机抓取彗星细胞图像。

(3)彗星图像的分析：

每个彗星图像均采用CASP系统自动分析，测量DNA迁移的各种参数，包括彗星拖尾长度，彗星尾部DNA的相对含量(Tail DNA)、尾动量(TM)、Olive尾动量(OTM)，评价DNA 的损伤程度。对结果采用SPSS统计软件进行统计学分析，分析方法采用单因素方差分析， p<0.05视为差异有显著性。

结果表明，随着氡浓度增加，彗星尾部逐渐增长，表明DNA迁移量增加，且尾部中DNA 的含量随之增加(图2)。随着氡浓度增加，表征DNA损伤程度的4个参数拖尾长度(Taillength)，尾部DNA相对含量(Tail DNA)，尾动量(TM)和Olive尾动量(OTM)的值都随之增加(表1)，而且松萝DNA损伤各指标与氡浓度间存在着显著的剂量-效应关系(图3)。因此，可通过SCGE相应指标来检测氡对植物DNA的损伤。

表1氡处理后松萝细胞的DNA损伤

注:不同的小写字母表示同一列间存在差异显著性(p<0.05)