一种降低雷公藤甲素诱导肝脏毒性的方法

摘要

本发明了公开了一种降低雷公藤甲素诱导肝脏毒性的方法，该方法是采用雷公藤甲素联合非诺贝特用药，用于降低雷公藤甲素诱导的肝毒性。本发明通过给予生物体长期与短期的雷公藤甲素(Triptolide)发现，联合非诺贝特用药能够改善雷公藤甲素引起的肝脏组织损伤。更为重要的是，非诺贝特的联合使用不会显著性地影响雷公藤甲素在小鼠体内的药物代谢动力学参数，表明联合非诺贝特用药时不影响雷公藤甲素的药效。本发明将临床上安全可靠的降脂药非诺贝特应用于减少雷公藤甲素用药过程中产生的肝毒性具有十分重要的临床应用价值和科学研究意义。

说明书

技术领域：

本发明属于雷公藤甲素毒性药物技术领域，具体地说，涉及联合非诺贝特用药降低雷公藤甲素临床用药导致肝毒性的应用。

背景技术：

雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.F.)又叫黄藤和断肠草，其中雷公藤甲素(Triptolide)是雷公藤提取物的主要活性成分，临床上主要将其应用于自身免疫性疾病的治疗，如风湿性关节炎、类风湿性关节炎、跌打损伤、肾小球肾炎、系统性红斑狼疮等，并且对白塞氏病，虹膜炎等一些眼部的疾病也有较好的疗效，是现在国内首选的免疫抑制剂之一。但是，在雷公藤甲素治疗过程中产生较为严重的毒副作用，肝毒性出现的最多。大多数服用雷公藤甲素的患者除了患有自身免疫性疾病的同时，还常伴有肝脏毒性，严重扰乱了机体的代谢水平，产生肝毒性的患者常常伴有恶心、乏力、食欲不振、皮疹等症状，AST、ALT指标升高。严重的情况下有肝淤血甚至产生中毒性肝炎，脂肪细胞变性导致死亡。这些严重的副作用让患者望而却步放弃治疗，同时限制了单体制剂的开发应用。因此，寻找一种能显著降低雷公藤甲素所导致的肝毒性的安全药物迫在眉睫。

目前针对雷公藤甲素所导致的肝脏毒性采取了许多减毒的对策主要包括：1.改变剂型，雷公藤甲素固体脂质纳米粒；2.中药联合配伍；3.利用生物技术的方法靶向治疗。临床上使用雷公藤甲素时多联合其它中药来减弱它产生的毒性。由于目前雷公藤甲素毒性机制复杂不清，毒性作用难以控制，仍旧没有很好的方法来减弱其毒性且能提高药效。因此寻找一种有效，安全，成本较低的减毒方法具有非常大的应用价值。

非诺贝特(Fenofibrate)，又称苯酰降脂丙酯、普鲁脂芬、立平脂，其作为一种经美国FDA批准临床上广泛使用的西药，具有很好的药理活性，非诺贝特属于贝特类药物，在全球范围内非常容易获得，作为过氧化物酶增殖受体PPARα的经典激动剂，在体内经酯酶的作用迅速代谢成非诺贝特酸，从而达到降低血清胆固醇、甘油三酯和升高高密度脂蛋白的作用，适用于治疗高甘油三酯血症和高胆固醇症等跟脂代谢相关的疾病。在肝病的治疗方面已经有一定的应用，对熊去氧胆酸治疗缺乏应答的原发性胆汁性肝硬化患者，非诺贝特是一种有效的辅助疗法，接受非诺贝特治疗后血清碱性磷酸酶和血清胆红素水平都有改善。将非诺贝特用于减少雷公藤甲素导致的肝毒性上至今尚未被报导，具有很好联合用药价值和应用前景。

发明内容：

本发明的目的在于突破目前雷公藤甲素所造成的严重肝毒性局限。

本发明的第二个目的在于非诺贝特来改善雷公藤甲素造成的肝毒性，明确非诺贝特对雷公藤甲素所诱导肝脏毒性的减弱作用，旨在能够拓展雷公藤甲素的临床治疗窗，减弱毒性。

为了实现以上目的，本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种降低雷公藤甲素诱导的肝脏毒性的方法，该方法采用雷公藤甲素联合非诺贝特用药，降低雷公藤甲素诱导的肝毒性。

如所述的一种降低雷公藤甲素诱导的肝脏毒性的方法，其中所述的肝毒性为药物性肝毒性，是由雷公藤甲素导致血浆中天门冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶显著升高并且使肝脏细胞损伤坏死。

非诺贝特在减弱雷公藤甲素诱导的肝毒性中的应用，所述应用是采用雷公藤甲素联合非诺贝特用药，降低雷公藤甲素诱导的肝毒性。

如所述的非诺贝特在减弱雷公藤甲素诱导的肝毒性中的应用，其中所述的肝毒性为药物性肝毒性，是由雷公藤甲素导致血浆中天门冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶显著升高并且使肝脏细胞损伤坏死。

雷公藤甲素和非诺贝特在减弱雷公藤甲素诱导的肝毒性中的应用，所述应用是采用雷公藤甲素联合非诺贝特用药，降低雷公藤甲素诱导的肝毒性，所述的肝毒性为药物性肝毒性，是由雷公藤甲素导致血浆中天门冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶显著升高并且使肝脏细胞损伤坏死。

雷公藤甲素和非诺贝特在制备治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎、跌打损伤、肾小球肾炎、系统性红斑狼疮疾病的药物中的应用，所述应用是采用雷公藤甲素联合非诺贝特用药，降低雷公藤甲素诱导的肝毒性。

雷公藤甲素和非诺贝特在制备眼部疾病白塞氏病、虹膜炎的药物中的应用，所述应用是采用雷公藤甲素联合非诺贝特用药，降低雷公藤甲素诱导的肝毒性。

雷公藤甲素和非诺贝特在制备治疗免疫系统疾病的药物中的应用，所述应用是采用雷公藤甲素联合非诺贝特用药，降低雷公藤甲素诱导的肝毒性。

本发明的优点在于：本发明联合非诺贝特用药降低雷公藤甲素诱导的肝毒性。非诺贝特属于贝特类药物，在全球范围内非常容易获得，成本较低，具有很好的药理活性和安全性。其中所述的肝脏毒性是由雷公藤甲素所诱导的毒性。研究证实了非诺贝特能减弱雷公藤甲素所引起的肝脏损伤。本发明运用非诺贝特来改善雷公藤甲素所造成的肝损伤意义深刻，有很好联合用药价值和应用前景。

附图说明：

图1所示为雷公藤甲素的化学结构。

图2，A显示为给予雷公藤甲素诱导小鼠肝脏毒性后，空白组(Control)、雷公藤甲素组(TP)和联合用药组(Fenofibrate+TP)肝脏组织病理学切片，结果提示雷公藤甲素造成小鼠肝组织大量损伤，细胞核变性坏死以及炎症细胞浸润。结果提示加入非诺贝特后坏死肝脏细胞得到明显改善；B显示为给予雷公藤甲素诱导小鼠肝脏毒性后，空白组、甲素组和联合用药组血浆中天门冬氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和碱性磷酸酶(ALP)活力，结果提示加入非诺贝特后，三种酶活力水平下降；C显示加入非诺贝特用药后，空白组、甲素组、联合用药组提取三组肝脏总RNA,反转后Real-time QPCR检测炎症因子IL-1β、IL-6、TGF-β、TNF-α表达。

图3，A利用代谢组学技术分析联合非诺贝特用药雷公藤甲素后小鼠血浆中代谢物水平变化，通过非监督分析方法(PCA)显示出空白组、甲素组和联合用药组所分布的情况，结果提示联合用药组与空白组几乎聚集在同一部分与甲素组显著分开；B利用代谢组学技术负载图分析空白组、甲素组和联合用药组血浆中差异性代谢物，结果提示内源性代谢物长链肉毒碱变化显著；C显示空白组、甲素组和联合用药组血浆中内源性代谢物肉毒碱变化情况；D显示提取空白组、甲素组和联合用药组肝脏总RNA，反转后Real-time QPCR检测Acox-2、Cpt-1β、Cpt-2、Acot-2表达，结果提示雷公藤甲素能抑制PPARα下游靶基因和肉毒碱转运基因的表达。

图4显示为给予两周低剂量的雷公藤甲素后，空白组、甲素组和联合用药组血浆中天门冬氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)的活力，结果提示非诺贝特可以显著性降低由低剂量雷公藤甲素诱导上升的ALT活力水平。

图5显示雷公藤甲素与联合非诺贝特用药后的血药浓度—时间曲线图，结果提示各个采血点的雷公藤甲素血药浓度在雷公藤甲素组与联合用药组中无明显的差异。

具体实施方式：

下面结合具体实施例来进一步说明本发明的实质性内容，应理解，以下实施例仅用于说明本发明，但并不以此来限定本发明的保护范围。

动物：C57BL/6小鼠，SPF级，37～40日龄，体重20～23g，雄性；合格证号均为：SCXK(湘)2013-0004，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。

药品与试剂：雷公藤甲素，白色无定型结晶粉末，成都曼斯特生物科技有限公司，批号MUST-16021425。天冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒(货号C010-3，批号20161028)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒(货号C009-3，批号20161031)，均为南京建成生物工程研究所购买。DMSO(货号V900090-500ml，批号101669350)、甲酸(货号94318-250ml-F，批号101721592)、氯磺丙脲(货号C1290-25G，批号1002213299)购自Sigma公司。色谱级乙腈(货号1.00030.4008)购自默克。

主要仪器：精密电子天平，Sartorius公司；全自动酶标仪，BioTek Instruments公司；水浴恒温振荡器SHA-C，常州中诚仪器制造有限公司；冷冻离心机，Eppendorf公司；超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱，包含1290进样器、1290泵、柱温箱、XDB-C18色谱柱(2.1×100mm,1.8μM)、及6530四极杆飞行时间质谱，Agilent公司。

实施例1：

联合非诺贝特用药降低雷公藤甲素造成的急性肝损伤。

建立一个短期非诺贝特减弱毒性的实验。实验共需18只雄性C57BL/6小鼠，分为三组：空白组(n＝6)；甲素组(n＝6)；联合用药组(非诺贝特+雷公藤甲素，n＝6)。雷公藤甲素采用1％DMSO水溶液(v：v)溶解，腹腔注射给药，给药剂量1mg/kg·d。非诺贝特采用0.5％CMC-Na溶解，灌胃给药，给药剂量200mg/kg·d，给药容积为0.1ml/20g。治疗组非诺贝特采用灌胃给药，给药剂量为200mg/kg·d，连续给药三天；空白组及雷公藤甲素组喂以等剂量0.5％CMC-Na，连续给药三天。在实验第三天，待联合用药组给予非诺贝特3h后，分别对甲素组和联合用药组同时给予1mg/kg的雷公藤甲素而空白组则给予0.1ml/20g的1％DMSO水溶液。雷公藤甲素处理18h后，用干冰麻醉小鼠并摘眼球取血。血浆样品于冰上放置1-2h后，在4℃下2000g制备液质血样处理液：取10μl血浆样品，与190μl 67％的乙腈(含内标氯磺丙脲5μM)混合，在4℃下18000g离心20min，取上清进样。液相条件如下：进样体积5μl；柱温45℃；流动相流速0.3ml/min；洗脱梯度：在16min的运行时间内，乙腈浓度由5％变至95％，流动相(水及乙腈)均含0.01％的甲酸。质谱条件如下：干燥气温度350℃，喷雾器压力35psi，毛细管电压3.5kV。离心5min，取上清血浆样品，测定血浆生化指标AST、ALT水平。图2中，A结果显示雷公藤甲素组与空白组相比肝脏细胞损伤坏死，无规则形态，说明模型组组织细胞损伤严重，联合用药组组织形态接近于空白组，表明非诺贝特对雷公藤甲素造成的肝脏损伤有明显的减弱作用，可显著减弱联合用药组肝脏细胞的损伤情况。本发明进一步检测了血浆中肝损伤指标AST、ALT、ALP,发现非诺贝特能恢复血浆中的酶活力(图2，B)，同时雷公藤甲素导致炎症因子的聚集增加肝脏氧化压力，而非诺贝特能降低炎症因子表达增强肝脏抗氧化能力(图2，C)。

进一步地，利用代谢组学技术分析空白组，甲素组，联合用药组中体内代谢物变化情况，通过主成分分析显示三组呈现顺时针变化趋势，联合用药组与空白组聚集在一起，提示加入非诺贝特后体内内源性代谢物恢复水平趋近于空白组(图3，A),同时找到差异性代谢物为长链肉毒碱(图3，B)。为了进一步验证肉毒碱的整体变化情况，靶向分析了血浆中所有类型的肉毒碱变化，结果发现整体血浆中肉毒碱水平在甲素组升高，给予非诺贝特后得到显著恢复(图3，C)。

本发明提取肝脏RNA,PCR检测Acox-2、Cpt-1β、Cpt-2、Acot-2表达，雷公藤甲素抑制了PPARα下游靶基因包括肉毒碱转运基因Cpt-1β、Cpt-2表达，而加入非诺贝特后激活了被抑制基因的表达(图3，D)，这些结果显示了联合非诺贝特用药维持体内了脂肪酸β氧化代谢的正常水平，从而降低雷公藤甲素所造成的肝脏毒性。

实施例2：

非诺贝特降低长期性低剂量雷公藤甲素造成的慢性肝损伤：

为了研究非诺贝特对长期低剂量雷公藤甲素造成的慢性肝损伤的恢复作用。本发明用18只雄性C57BL/6小鼠，分为三组：空白组(n＝6)；甲素组(n＝6)；联合用药组(非诺贝特+雷公藤甲素，n＝6)。其中雷公藤甲素采用1％DMSO水溶液(v：v)溶解，给药剂量为0.4mg/kg/d，给药体积为0.1ml/20g；非诺贝特采用0.5％CMC-Na溶解，给药剂量为200mg/kg·d，给药体积为0.1ml/20g。治疗组小鼠在灌胃200mg/kg的非诺贝特3小时后腹腔注射0.4mg/kg的雷公藤甲素，连续给药14天；空白组在相同的时间分别灌胃和注射同剂量的0.5％CMC-Na和1％DMSO水溶液；雷公藤甲素组则在相同的时间灌胃同剂量的0.5％CMC-Na。在实验第15天，即最后一次甲素处理后18h，用CO₂麻醉小鼠，摘眼球取血。血样品于冰上放置1-2h后，在4℃2000g条件下离心5min，测定血浆AST和ALT水平。图4结果显示，长期给予低剂量的雷公藤甲素后，小鼠血浆中的AST、ALT水平均显著高于空白组(P<0.01)，表明模型组肝部损伤明显；治疗组ALT水平与模型组相比显著降低(P<0.01)，与空白组相比则无显著性差异，表明非诺贝特对长期低剂量的雷公藤甲素所造成的肝毒性具有明显的减弱作用。

实施例3：

非诺贝特对雷公藤甲素在小鼠体内AUC的影响：

为了研究非诺贝特对雷公藤甲素药效的影响，联合用药组的非诺贝特采用灌胃给药，给药剂量为200mg/kg·d，连续给药三天；雷公藤甲素组喂以等剂量的0.5％CMC-Na，连续给药三天。在实验第三天，待联合用药组组给予非诺贝特3h后，分别对甲素组和联合用药组同时给予1mg/kg的雷公藤甲素，并开始计时。通过眼球后静脉丛取血的方式分别采集甲素组和联合用药组给药后第5min、10min、15min、30min、60min和120min的血样。血样品于冰上放置1-2h后，在4℃2000g条件下离心5min。随后，取40μL的血浆样品于0.6ml的EP管中并加入360μL的乙酸乙酯(含内标氯磺丙脲)，涡旋，在4℃8000g下离心5min。离心后，取300μL的上清液于0.6ml的EP管中，氮气吹干后加入100μL的纯甲醇进行复溶，并在18000g 4℃的条件下离心10min,取上清进样。液相条件如下：进样体积10μL；柱温45℃；流动相流速0.3ml/min；洗脱梯度：在16min的运行时间内，乙腈浓度由5％变至95％，流动相(水及乙腈)均含0.01％的甲酸。质谱条件如下：干燥气温度350℃，喷雾器压力35psi，毛细管电压为3.5kV。根据样品峰面积，配制一系列浓度梯度的雷公藤甲素标准液(设置7个点)，绘制峰面积—浓度曲线。运用峰面积—浓度曲线计算每个采血点的血药浓度，最后用DAS 2.0软件(中国药理协会)计算药时曲线下面积(AUC)、药物消除半衰期(t_1/2)和平均滞留时间(MRT)等药物代谢动力学参数。如表1所示，联合非诺贝特后，雷公藤甲素在小鼠体内的AUC_0→t、AUC_0→∞、MRT_0→t、MRT_0→∞、CL/F、t_1/2和C_max与单独给雷公藤甲素组相比无显著性差异。实验结果表明联合非诺贝特用药并未对雷公藤甲素在小鼠体内的药物代谢动力学参数产生明显的影响。

表1雷公藤甲素在小鼠体内的药物代谢动力学参数(平均值±SD)

表注：TP为雷公藤甲素组；Fenofibrate+TP为联合非诺贝特用药组。

以上所述为本发明的优选实验方案，应当指出，对于本发明内的普通技术人员，在遵从本发明原理的前提下，还可以对实施方案作出适当的改进，并且这些相应的改进也视为本发明的保护范围。