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一种胶原基电纺纤维抗菌剂载体的制备方法

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一种胶原基电纺纤维抗菌剂载体的制备方法。本发明涉及一种可降解且释放可控的高分子载体的制备方法。本发明通过载体粒子的制备、静电纺丝液的配置、纺丝纤维膜的制备和纤维膜后处理四个步骤，得到了一种具有良好的生物活性，可降解性，抗菌性和优良的载药性能的黄白色电放纤维膜。本发明所制备的纤维膜具有良好的生物活性，既能体外敷用，也可植入体内使用；所采用的原料有胶原、木质素、PVP和低分子量的PVA，在体液碱性环境下长期服役都能够实现生物降解，这既能保证抗菌剂平稳释放，也能使得抗菌剂释放充分、彻底；同时本发明制得的纺丝纤维中包裹的木质素纳米粒子可在纤维膜在降解过程中表现出一定的抗菌性。

著录项

公开/公告号CN108049028A

专利类型发明专利
公开/公告日2018-05-18

原文格式PDF
申请/专利权人河北工业大学;
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申请/专利号CN201711360548.7
发明设计人夏晓梅;李宝娥;夏丹;李海鹏;梁春永;王洪水;刘帅;
展开▼

申请日2017-12-18
分类号D04H1/4382(20120101);D04H1/728(20120101);D01D5/00(20060101);A61K9/70(20060101);A61K47/42(20170101);A61K47/30(20060101);A61K47/32(20060101);A61K31/4375(20060101);A61K31/4709(20060101);A61K33/34(20060101);A61K33/30(20060101);A61K33/38(20060101);A61P31/04(20060101);D06M15/15(20060101);D06M101/04(20060101);D06M101/24(20060101);D06M101/18(20060101);
代理机构天津耀达律师事务所;
代理人张颖颢
地址 301002 天津市北辰区双口镇西平道2340号
入库时间 2023-06-19 05:21:36

法律信息

法律状态公告日

法律状态信息

法律状态
2020-05-22

授权

授权
2018-06-12

实质审查的生效 IPC(主分类):D04H1/4382 申请日:20171218

实质审查的生效
2018-05-18

公开

公开

说明书

技术领域

本发明属于生物材料领域，涉及发明一种能用于抗菌剂装载的高分子载体的制备方法，具体地涉及一种可降解且释放可控的高分子载体的制备方法。

背景技术

大量的介入治疗失败的案例都与细菌感染有着重要的联系，因此，治疗过程中的无菌环境对于治疗成败起着重要作用。纳米技术的发展为许多生物医学应用提供了新的方法，特别是控制抗菌剂的运输。抗菌剂运输载体的应用可以提高治疗效率，减小感染几率。目前已经有了纳米粒子和水凝胶等作为抗菌剂运输载体的相关报道。其中单独的纳米粒子作为运输载体存在一定的突释现象，并且抗菌剂释放时间短，一些载体材料的降解性成为问题；水凝胶作为抗菌剂载体需要一定的交联，而交联的过程降低了材料的生物相容性。

常见的载体材料包括介孔二氧化硅纳米粒子、明胶纳米粒子、聚乳酸纤维等。虽然这些载体材料的应用相对于直接给药的方式来说已经具有一定的功效，但是仍存在一些问题，例如，二氧化硅纳米粒子不可降解，易造成体内沉积，而明胶纳米粒子和聚乳酸纤维等由于其结构尺度单一，抗菌剂在释放过程中往往存在突释现象。

近年，有大量关于木质素的报道，这是继纤维素之后的第二多生物质的聚合物，目前商业木质素主要应于作为填充物、添加剂、粘合剂等。由于它的来源，木质素很多生物友好性质，如生物可降解性，生物相容性，抑菌性等，并且木质素本身具有一定的抗癌效果，这些性质引起了生物材料领域学者的关注。目前已有学者将其制备成纳米颗粒应用于抗菌剂运输领域，但是由于其降解速度过快，有一定突释现象，并且抗菌剂释放时间较短限制了其在抗菌剂运输领域的应用，如何简单高效地制备出粒径均一，可控大小的木质素纳米粒子也是一个问题。

发明内容

基于背景技术存在的问题,本发明提供了一种可降解且释放可控的胶原基高分子载体的制备方法，该方法包括载体粒子的制备、静电纺丝液的配置、纺丝纤维膜的制备和纤维膜后处理，所得到的纤维膜具有良好的生物活性，可降解性，抗菌性和优良的载药性能。

本发明提供的胶原基高分子载体能够通过以下三个方案获得：

方案1

（1）载体粒子的制备：将硫酸盐木质素和脂溶性的抗菌剂按照质量比为20-5:1溶解在四氢呋喃中，制成的硫酸盐木质素浓度为1mg/ml-20mg/ml的有机溶液，将所得有机溶液通过0.22μm的滤膜，除去不溶物；将滤液缓慢加入到搅拌状态下的超纯水中，搅拌速度为300r/min，水与木质素溶液的体积比是1:10-8:1，搅拌10min，将液体以5000r/min离心10min，取上清液将其放入12-14KDa的透析袋中透析2天，经冷冻干燥后得到载有抗菌剂的载体粒子。

（2）静电纺丝液体的配置：将步骤（1）制备的载体粒子使用超声细胞粉碎机于去离子水中分散均匀，其浓度为1-20mg/ml，功率为400-600W，超声时间为0.5-2h,将聚合度为1700的聚乙烯醇（PVA）加入其中，使其浓度为8%-12%，在室温下搅拌4小时，使其充分溶胀，而后升温至90℃继续搅拌4h，后将温度降至80℃，待温度稳定后将质量比为PVA0.7%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）粉末加入，在80℃下搅拌4h，之后将温度降至室温；而后将配置好的溶液使用超声细胞粉碎机超声0.5h，功率为400-600W。

（3）纺丝纤维膜的制备：

采用静电纺丝机，将步骤（2）制备好的液体吸入注射器中，安装型号为20的针头，排空气泡，设定电压为10-20V；流速为0.03-0.08mm/min；纺丝距离为13-20cm；湿度为30%；温度为30℃，开始纺丝，12h时间后，得到黄白色纤维膜。

（4）纤维膜的后处理：将I型胶原蛋白溶解在3%的乙酸中，浓度配置成1mg/ml-5mg/ml，在4℃下静置12小时后，搅拌均匀，将步骤（3）中制备的纺丝纤维膜浸泡在静置后的I型胶原溶液中，浸泡时间为5s-40s，而后于60℃下干燥12h。

方案2

（1）载体粒子的制备：将硫酸盐木质素溶解在四氢呋喃中，制成的硫酸盐木质素浓度为1mg/ml-20mg/ml的有机溶液，将所得有机溶液通过0.22μm的滤膜，除去不溶物；将滤液缓慢加入到搅拌状态下的超纯水中，搅拌速度为300r/min，水与木质素溶液的体积比是1:10-8:1，搅拌10min，将液体以5000r/min离心10min，取上清液将其放入12-14KDa的透析袋中透析2天，而后加入水溶性抗菌剂，保证硫酸盐木质素和水溶性的抗菌剂质量比为20-5:1，再经冷冻干燥即得到载有抗菌剂的载体粒子。

（2）静电纺丝液体的配置：将步骤（1）制备的载体粒子使用超声细胞粉碎机分散均匀，其浓度为1-20mg/ml，功率为400-600W，超声时间为0.5-2h,将聚合度为1700的聚乙烯醇（PVA）加入其中，使其浓度为8%-12%，在室温下搅拌4小时，使其充分溶胀，而后升温至90℃继续搅拌4h，后将温度降至80℃，待温度稳定后将质量比为PVA0.7%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）粉末加入，在80℃下搅拌4h，之后将温度降至室温；而后将配置好的溶液使用超声细胞粉碎机超声0.5h，功率为400-600W。

（3）纺丝纤维膜的制备：

方案三

（2）静电纺丝液体的配置：将步骤（1）制备的载体粒子使用超声细胞粉碎机于去离子水中分散均匀，其浓度为1-20mg/ml，功率为400-600W，超声时间为0.5-2h,将聚合度为1700的聚乙烯醇（PVA）加入其中，使其浓度为8%-12%，在室温下搅拌4小时，使其充分溶胀，而后升温至90℃继续搅拌4h，后将温度降至80℃，待温度稳定后将质量比为PVA0.7%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）粉末加入，在80℃下搅拌4h，之后将温度降至室温；将配置好的溶液使用超声细胞粉碎机超声0.5h，功率为400-600W，同时加入水溶性的抗菌剂，保证硫酸盐木质素和水溶性的抗菌剂质量比为20-5:1。

（3）纺丝纤维膜的制备：

采用静电纺丝机，将步骤（2）制备好的液体吸入注射器中，安装型号为20的针头，排除气泡，设定电压为10-20V；流速为0.03-0.08mm/min；纺丝距离为13-20cm；湿度为30%；温度为30℃，开始纺丝，12h时间后，得到黄白色纤维膜。

上述脂溶性抗菌剂是吉米沙星，加雷沙星中的一种。

上述水溶性抗菌剂是硝酸银、可溶性铜盐和可溶性锌盐中的一种。

上述I型胶原蛋白是从牛跟腱中提取的I型胶原蛋白、从猪皮中提取的I型胶原蛋白、鱼皮中提取的I型胶原蛋白中的一种。

上述方案二和方案三的步骤（1）中，可在将硫酸盐木质素溶解于四氢呋喃时，加入其他脂溶性功能性分子，比如抗癌药类。

与现有的技术相比，本发明的有益效果为：

（1）本发明纤维膜经后处理后，表面包裹了一层胶原膜，使得本发明所制备的纤维膜具有良好的生物活性，因此本发明所制得的纤维膜既能体外敷用，也可植入体内使用。

（2）本发明所采用的原料有胶原、木质素、PVP和低分子量的PVA，在体液碱性环境下长期服役都能够实现生物降解，这既能保证抗菌剂平稳释放，也能使得抗菌剂释放充分、彻底。

（3）本发明制得的纺丝纤维中包裹的木质素纳米粒子可在纤维膜在降解过程中表现出一定的抗菌性。

附图说明

图1 实施例1载体粒子的电镜扫描图。

图2 实施例1负载载体粒子的静电纺丝电镜扫描图。

图3 实施例1后处理之后纺丝纤维膜的电镜扫描图。

图4 实施例1-5的吉米沙星释放曲线。

图5 实施例1-5纺丝纤维膜抑菌效果图。

图6 实施例1的后处理之后纺丝纤维膜的降解电镜扫描图。

具体实施方式

方案一实施例

实施例1

（1）将硫酸盐木质素和抗菌剂吉米沙星按照质量比为10:1溶解在四氢呋喃中，制成的硫酸盐木质素浓度为10mg/ml的有机溶液，将所得有机溶液通过0.22μm的滤膜，除去不溶物；将滤液缓慢加入到搅拌状态下的超纯水中，搅拌速度为300r/min，水与木质素溶液的体积比是4:1，搅拌10min，将液体以5000r/min离心10min，取上清液将其放入12-14KDa的透析袋中透析2天，经冷冻干燥后得到均匀的抗菌剂载体粒子，其微观形貌见图1。

（2）将步骤（1）制备的载体粒子使用超声细胞粉碎机于去离子水中分散均匀，其浓度为10mg/ml，在600W功率下，超声1h,将聚合度为1700的聚乙烯醇（PVA）加入其中，使其质量体积比10%，在室温下搅拌4小时，使其充分溶胀，而后升温至90℃继续搅拌4h，再将温度降至80℃，待温度稳定后将质量比为PVA0.7%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）粉末加入，在80℃下搅拌4h，之后将温度降至室温；将配置好的溶液使用超声细胞粉碎机超声0.5h，功率为600W。

（3）将上述配置好的液体吸入注射器内，安装型号为20的针头，排空气泡，设定电压为12KV，流速为0.04mm/min，距离为17cm，纺丝12h后，将纤维膜放在真空干燥箱中60℃干燥12h，即可得到黄白色纺丝纤维膜，其纺丝的微观形貌见图2，图中方框圈出的即为嵌套进电纺纤维内的载体粒子。

（4）将牛跟腱中提取的I型胶原蛋白溶解在3%的乙酸中，浓度配置成2mg/ml，在4℃下静置12小时后，搅拌均匀，将步骤（3）中制备的纺丝纤维膜浸泡在静置后的I型胶原溶液中，浸泡时间为40s，而后于60℃下干燥12h得到图3所示的纤维膜。

将步骤（4）得到的纺丝纤维膜按照如下步骤进行抗菌剂释放检测：在进行体外释放前首先对抗菌剂吉米沙星进行标准曲线的绘制，用四氢呋喃配制出浓度分别为100mg/L,50mg/L,25mg/L,10mg/L,5mg/L,2mg/L,1mg/L的吉米沙星溶液，用高效液相色谱仪对其进行检测，其中参数设置为：流动相：V乙腈：V水=50:50；波长：紫外检测器波长227nm；色谱柱：C18；流速：1ml/min；进样量：5μl。根据测得的峰面积绘制不同浓度下的峰面积和浓度的标准曲线图。接着进行载药木质素纳米粒子的载药量测定：用四氢呋喃将载药木质素进行破乳，制成溶液浓度为0.2mg/ml，将溶液按上述参数用高效液相色谱仪进行检测，再根据提前建好的吉米沙星的标准曲线，算出该载药胶束浓度下吉米沙星的浓度，按照下面公式计算出载药量；载药量%= 。然后进行静电纺丝纤维膜的抗菌剂释放实验。取步骤（4）所述的纤维膜10mg，放入15ml的PBS缓冲液中，其中缓冲液中加入0.5%的吐温-80，密封好放入摇床中，37℃，100rpm，在预设的时间点取1ml的释放液体，再加入1ml新鲜的缓释液，用高效液相色谱仪进行检测。计算出累计释放量。得到载药量所得结果见图4中木质素含量为10%的结果，可以看出抗菌剂释放比较缓慢，没有突释现象。

将步骤（4）得到的纺丝纤维膜按照如下步骤进行抗菌实验：首先进行实验所需溶液的配制（YDP培养基、营养琼脂）。YDP培养基：称取酵母粉2g、蛋白胨4g、葡萄糖4g依次加入到200ml的去离子水中，充分摇匀，放入到250ml的锥形瓶中，包好备用。营养琼脂：在配制YDP培养基的基础上加入2.5g琼脂和0.5%的吐温-80，充分摇匀。然后进行大肠杆菌的接种及悬菌液的配制，接种前先对操作台（75%的酒精擦拭+紫外灯灭菌30min）以及实验所用玻璃器皿和溶液（高温高压灭菌锅）进行灭菌。大肠杆菌的接种：将接种环放置在酒精灯的火焰上方，从大肠杆菌原菌种内，挑出一个典型的菌落，然后在已凝固好了的营养琼脂上面画线，接种完毕后将营养琼脂培养皿放在 37℃的恒温培养箱中培养 24h-48h。

悬菌液制备：将约 20m L 的YDP培养液倒入试管中，用接种环从上述接种细菌中选取一个菌落置于YDP培养液中，然后将其放在37 ℃的震荡水浴锅中进行震荡培养18~20h，观察到溶液变浑浊，这便得到了下面实验即将用到的大肠杆菌悬菌液。

最后抑菌圈实验，将静电纺丝纤维膜裁成直径为9mm的圆片，紫外灯下灭菌一晚。将上述配制的营养琼脂于高温高压灭菌锅中煮沸灭菌向已灭菌的培养皿中倒入营养琼脂大约 15ml～20ml，室温条件下凝固备用。取1ml的上述悬菌液均匀涂在营养琼脂上，将制备的样品贴在已涂有菌液的培养基表面上，置于37℃恒温箱，培养8-12h。所得结果见图5中木质素含量为10%的结果，可以看出载有抗菌剂吉米沙星的纤维膜具有抑菌效果。

将步骤（4）得到的纺丝纤维膜按照如下步骤进行降解实验：在250ml的锥形瓶中加入PBS溶液100ml,将方形试样完全浸入其中，置于37℃，100rpm的摇床中，PBS溶液每周更换新的，取15天的纤维膜于烘箱中60℃干燥12h，观察形貌，所得结果见图6，可以看出纤维膜在降解15天时出现了溶胀现象，纤维逐渐消失断裂。

实施例2-5

除步骤（1）中木质素浓度外，其他工艺参数和实施例1相同，实施例2-5木质素加入比例见表1

表1 实施例2-5木质素浓度

实施例2-5抗菌剂释放和抑菌实验分别见图4和5。

对比说明随着载药木质素纳米颗粒的增加，抗菌剂释放速度逐渐增加，但这几种均无突释现象；抑菌圈的直径随着载吉米沙星含量的增加而增加，即抑菌效果增加。

实施例6-8

除步骤（2）中PVA浓度外，其他工艺参数和实施例1相同，实施例6-8PVA质量体积比含量见表2

表2 实施例6-8PVA质量体积比

实施例6实施例7实施例8步骤（2）中PVA质量体积比8%11%12%

实施例6-8制备的纤维膜形貌和实施例1一致，且抑菌性、降解性能、抗菌剂释放性能均良好。

实施例9-12

除步骤（3）纺丝电压外，其他工艺参数和实施例1相同，实施例9-12纺丝电压见表3

表3 实施例9-12纺丝电压

实施例9实施例10实施例11实施例12步骤（3）中纺丝电压10kV15kV17kV20kV

实施例9-12制备的纤维膜形貌和实施例1一致，且抑菌性、降解性能、抗菌剂释放性能均良好。

实施例13-15

除步骤（3）纺丝流速外，其他工艺参数和实施例1相同，实施例13-15纺丝流速见表4

表4 实施例13-15纺丝流速

实施例13实施例14实施例15步骤（3）中纺丝流速0.03mm/min0.05mm/min0.08mm/min

实施例13-15制备的纤维膜形貌和实施例1一致，且抑菌性、降解性能、抗菌剂释放性能均良好。

实施例16-18

除步骤（3）纺丝距离外，其他工艺参数和实施例1相同，实施例16-18纺丝距离见表5

表5 实施例16-18纺丝距离

实施例16实施例17实施例18步骤（3）中纺丝距离13cm15cm20cm

实施例16-18制备的纤维膜形貌和实施例1一致，且抑菌性、降解性能、抗菌剂释放性能均良好。

实施例19-20

除步骤（4）胶原浓度外，其他参数和实施例1相同，实施例19-20胶原浓度见表6

表6 实施例19-20胶原浓度

实施例19实施例20步骤（4）中胶原浓度1mg/ml5mg/ml

实施例19-20制备的纤维膜形貌和实施例1一致，且抑菌性、降解性能、抗菌剂释放性能均良好。

实施例21

除将抗菌剂换成加雷沙星外，其他参数和实施例1相同，所得纤维膜形貌和实施例1一致，且抑菌性、降解性能、抗菌剂释放性能均良好。

实施例22

（1）将硫酸盐木质素和吉米沙星按照质量比为20:1溶解在四氢呋喃中，制成的硫酸盐木质素浓度为20mg/ml的有机溶液，将所得有机溶液通过0.22μm的滤膜，除去不溶物；将滤液缓慢加入到搅拌状态下的超纯水中，搅拌速度为300r/min，水与木质素溶液的体积比是8:1，搅拌10min，将液体以5000r/min离心10min，取上清液将其放入12-14KDa的透析袋中透析2天，经冷冻干燥后得到载有抗菌剂的载体粒子。

（2）将步骤（1）制备的载体粒子使用超声细胞粉碎机于去离子水中分散均匀，其浓度为20mg/ml，在400W功率下，超声0.5h,将聚合度为1700的聚乙烯醇（PVA）加入其中，使其质量体积比10%，在室温下搅拌4小时，使其充分溶胀，而后升温至90℃继续搅拌4h，再将温度降至80℃，待温度稳定后将质量比为PVA0.7%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）粉末加入，在80℃下搅拌4h，之后将温度降至室温；将配置好的溶液使用超声细胞粉碎机超声0.5h，功率为400W。

（3）将上述配置好的液体吸入注射器内，安装型号为20的针头，排空气泡，设定电压为12KV，流速为0.04mm/min，距离为17cm，纺丝12h后，将纤维膜放在真空干燥箱中60℃干燥12h。

（4）将从猪皮中提取的I型胶原溶解在3%的乙酸中，浓度配置成2mg/ml，在4℃下静置12小时后，搅拌均匀，将步骤（3）中制备的纺丝纤维膜浸泡在静置后的I型胶原溶液中，浸泡时间为5s，而后于60℃下干燥12h。