一种甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖互穿网络水凝胶、制备方法及应用

摘要

本发明公开了一种甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖互穿网络水凝胶，并公开了上述甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖互穿网络水凝胶的制备方法，制备方法为：将甲基丙烯酸酯明胶水溶液和加入光引发剂的醋酸溶液混合搅拌，将光引发剂加入壳聚糖水溶液中混合搅拌；在37℃下将以上两种溶液混合搅拌5‑10min后，置于紫外线下照射交联；然后再浸泡在氢氧化钠溶液中，后处理即得甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖高强度互穿网络水凝胶。本发明制备方法简单、成本低廉，原料明胶和壳聚糖均是天然生物材料，所制备的互穿网络水凝胶无毒、无味、可生物降解，具有良好的生物相容性和机械性能，杨氏模量值可达27.1kPa，压缩模量可达到116kPa。

说明书

技术领域

本发明涉及高分子水凝胶制备技术领域，尤其涉及一种甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖互穿网络水凝胶、制备方法及应用。

背景技术

水凝胶作为组织工程支架具有良好的性能，但其应用常受限于机械性能不足；明胶是细胞外基质的主要成分，由于其良好的生物相容性和无抗原性而被广泛用于组织工程，然而，较低的机械强度和过快的降解速度限制了其应用；壳聚糖由甲壳素脱乙酰化制得，多是N-乙酰化葡糖胺和N-葡糖胺的共聚物，在组成和结构上与细胞外基质具有一定相似性，且生物相容性好，具有良好的抗菌和止血特性，是组织工程的理想支架材料，且可以通过与其它自然界聚合物或陶瓷混合改性增强其机械性能。

壳聚糖/明胶复合支架已用于组织工程的许多领域，如皮肤，软骨，神经等。为提高壳聚糖/明胶支架的机械强度，多采用化学交联剂交联法，目前常用的化学交联剂包括碳二亚胺、戊二醛等，但支架内未反应的交联剂和交联反应生成的有毒副产物使其不适合在体外或体内使用，因此，不使用交联剂而达到增强支架机械强度的方法越来越受到关注，如溶剂交换、紫外线照射、pH变化和温度调节等。

互穿网络(IPN)水凝胶是由两种或两种以上聚合物通过网络互穿而形成的聚合物，其中两个组分网络之间没有化学键相结合，均保持各自的特性；同时，两种互穿网络相互影响，能够协同增强其力学性能，因此，互穿网络水凝胶能有效增强水凝胶机械性能。

发明内容

本发明提供了一种甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖互穿网络水凝胶，该水凝胶生物相容性好、无毒、易降解、机械性能优，可用于细胞、组织培养，作为组织修复材料或组织工程支架应用于组织工程领域。

本发明还提供了甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖互穿网络水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

(1)45～50℃水浴环境下，明胶溶液和碳酸钠-碳酸氢钠溶液混合均匀，搅拌加入甲基丙烯酸酐，常温下避光反应3～5h后，30～40℃去离子水中恒温透析7～9天、滤膜过滤、冷冻干燥后得甲基丙烯酸酯明胶粉末；

(2)将光引发剂加入到酸溶液中，混合搅拌，得到基液；

(3)将甲基丙烯酸酯明胶、壳聚糖分别加到步骤(2)得到的基液中，搅拌均匀，分别得到甲基丙烯酸酯明胶混合溶液和壳聚糖混合溶液；

(4)将壳聚糖混合溶液置于模具中，加入甲基丙烯酸酯明胶混合溶液，混合均匀后在37～50℃水浴条件下搅拌5～10min，紫外线照射交联，可得甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖半互穿网络水凝胶；

(5)将上述甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖半互穿网络水凝胶从模具中取出，浸泡在碱溶液中，得到膜状或块状互穿网络水凝胶，室温下在磷酸盐缓冲液(PH＝7.0～7.5)中反复冲洗、去除残留的氢氧根或碳酸根离子后，将其保存在去离子水中，即可得甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖互穿网络水凝胶。

以上步骤中涉及的溶液，其溶剂均为水。

本发明提供的互穿网络水凝胶的主要制备原理为甲基丙烯酸酯明胶和壳聚糖混合溶液中加有光引发剂，紫外线照射使得甲基丙烯酸酯明胶通过共价键交联形成第一层网络，碱溶液浸泡使得壳聚糖通过氢键交联形成第二层网络，两层网络彼此交错，形成互穿网络。

所述的明胶溶液的质量浓度为10～20％；

所述的碳酸钠-碳酸氢钠溶液的浓度为0.25～0.5mol/L，其中碳酸钠-碳酸氢钠的摩尔比为1:1；

所述的截留透析管的截留分子量为8～14kDa；

所述的滤膜孔径0.22μm；

所述的冷冻干燥操作为-80℃冷冻6h后置真空冷冻干燥机内冻干；

所述的光引发剂为2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮或2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(LAP)，引发剂在体系中的最终质量浓度为0.1～1％；

所述的酸溶液为醋酸溶液或盐酸溶液；其质量浓度为1～5％；

所述的甲基丙烯酸酯明胶在体系中的最终质量浓度为5～20％，壳聚糖在体系中的最终质量浓度为0.5～2％，甲基丙烯酸酯明胶和壳聚糖的最终质量浓度比为10～20：1；

所述的紫外线波长为300～400nm，紫外线照射时间25～30s；

所述的碱溶液为氢氧化钠溶液，氢氧化钾溶液或碳酸钠溶液中的一种；

所述的碱溶液浓度为0.1～1mol/L；浸泡时间为30～120min。

本发明提供的甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖互穿网络水凝胶具有较强的力学性能，杨氏模量值可达27.1kPa，压缩模量可达到116kPa。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明中所选用的壳聚糖和明胶均是天然生物材料，无毒、无味、有很好的生物相容性，价格低廉、安全可靠，实际操作中，通过光照和碱化形成互穿网络结构，操作简单；

(2)本发明制备的互穿网络水凝胶易降解，机械性能好，有望应用于组织工程中的水凝胶三维支架。

附图说明

图1为本发明实施例2，对比例1-2所制备的半互穿网络和互穿网络水凝胶的傅里叶变换红外光谱图。

图2为本发明应用例1中骨髓间充质干细胞分别在(A)壳聚糖水凝胶(CS)；(B)甲基丙烯酸酯明胶(G)；(C)甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖半互穿网络水凝胶(G-0.5CS)；(D)甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖互穿网络水凝胶(G-0.5CS-IPN)；(E)甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖半互穿网络水凝胶(G-CS)；(F)甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖互穿网络水凝胶(G-CS-IPN)表面生长情况的荧光显微镜照片。

图3为本发明应用例2中半互穿网络和互穿网络水凝胶的溶胀率柱状对比图。

图4为本发明应用例3中半互穿网络和互穿网络水凝胶的降解率曲线对比图。

图5为本发明应用例4中半互穿网络和互穿网络水凝胶的压缩应力-应变曲线图。

图6为本发明应用例4中半互穿网络和互穿网络水凝胶的压缩模量图。

图7为本发明应用例5中半互穿网络和互穿网络水凝胶的拉伸应力-应变曲线图。

图8为本发明应用例5中半互穿网络和互穿网络水凝胶的杨氏模量图。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖互穿网络水凝胶的制备方法进行具体描述，但本发明并不限于这些实施例，该领域技术人员在本发明核心指导思想下做出的非本质改进和调整，仍然属于本发明的保护范围。

实施例1

在45℃的水浴环境下，将质量浓度为15％明胶溶液加入到0.25mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中混合均匀后，边搅拌边以0.5mL/min的速率加入甲基丙烯酸酐，并于常温下避光反应3h；将产物装入透析袋(截留分子量为8～14kDa)中在37℃下透析7天，每1天换次水；产物通过0.22μm滤膜过滤后倒入平皿中于-80℃冰箱中预冻6h，随后放入冻干机，冷冻干燥得到甲基丙烯酸酯明胶。

称取0.1g光引发剂加入到10mL质量浓度为1％的醋酸溶液中，混合搅拌，得到基液；称取0.05g壳聚糖加入5mL基液中，得到壳聚糖溶液；称取1g甲基丙烯酸酯明胶加入5mL基液中，得到甲基丙烯酸酯明胶溶液。

37℃水浴下，用2mL的针管取1mL上述壳聚糖溶液，置于平板或柱状模具中，加入1mL上述甲基丙烯酸酯明胶溶液，快速均匀混合；10min后，在365nm波长，1.5mW/cm²功率的紫外灯下照射30s，即可得甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖半互穿网络水凝胶(G-0.5CS)。

将所得的半互穿网络水凝胶从模具中取出，浸泡在摩尔浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液中0.5h，得到膜状或块状互穿网络生物大分子水凝胶；室温下在磷酸盐缓冲液(PH＝7.4)中反复冲洗、去除残留氢氧根离子后，将其保存在去离子水溶液中，即可得甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖互穿网络水凝胶(G-0.5CS-IPN)。

实施例2

在50℃的水浴环境下，将质量浓度为15％明胶溶液加入到0.3mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，边搅拌边以0.5mL/min的速率加入甲基丙烯酸酐，并于常温下避光反应5h；将产物装入透析袋(截留分子量为8～14kDa)中在40℃下透析7天，每1天换次水；产物通过0.22μm滤膜过滤后倒入平皿中于-80℃冰箱中预冻6h，随后放入冻干机，冷冻干燥得到甲基丙烯酸酯明胶。

称取0.1g光引发剂加入到10mL质量浓度为2％的醋酸溶液中，混合搅拌，得到基液；称取0.1g壳聚糖加入5mL基液中，得到壳聚糖溶液；称取1g甲基丙烯酸酯明胶加入5mL基液中，得到甲基丙烯酸酯明胶溶液。

37℃水浴加热下，用2mL的针管取1mL上述壳聚糖溶液，置于平板或柱状模具中，加入1mL上述甲基丙烯酸酯明胶溶液，快速均匀混合。10min后，在365nm波长，1.5mW/cm²功率的紫外灯下照射30s，即可得甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖半互穿网络水凝胶(G-CS)其傅里叶变换红外光谱如图1所示。

将所得的半互穿网络水凝胶从模具中取出，浸泡在摩尔浓度为0.1mol/L的氢氧化钾溶液中0.5h，得到膜状或块状互穿网络生物大分子水凝胶。室温下在磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中反复冲洗、去除残留氢氧根离子后，将其保存在去离子水溶液中，即可得甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖互穿网络水凝胶(G-CS-IPN)，其傅里叶变换红外光谱如图1所示。

对比例1

称取0.1g光引发剂加入到10mL质量浓度为1％的盐酸溶液中，混合搅拌，得到基液；称取0.1g壳聚糖加入5mL基液中，得到壳聚糖溶液；加入10mL摩尔浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液，静置0.5h，得到块状生物大分子水凝胶；室温下在磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中反复冲洗、去除残留氢氧根离子后，将其保存在去离子水溶液中，即可得壳聚糖水凝胶(CS)，其傅里叶变换红外光谱如图1所示。

对比例2

称取0.1g光引发剂加入到10mL质量浓度为1％的醋酸溶液中，混合搅拌，得到基液；称取0.5g甲基丙烯酸酯明胶加入5mL基液中，得到甲基丙烯酸酯明胶溶液，均匀混合；取2mL甲基丙烯酸酯明胶溶液，置于平板或柱状模具中，在365nm波长，1.5mW/cm²功率的紫外灯下照射30s，即可得甲基丙烯酸酯明胶水凝胶(G)，其傅里叶变换红外光谱如图1所示。

实施例3

在50℃的水浴环境下，将质量浓度为20％明胶溶液加入到0.5mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，边搅拌边以0.5mL/min的速率加入甲基丙烯酸酐，并于常温下避光反应3h；将产物装入透析袋(截留分子量为8～14kDa)中在40℃下透析9天，每1天换次水；产物通过0.22μm滤膜过滤后倒入平皿中于-80℃冰箱中预冻6h，随后放入冻干机，冷冻干燥得到甲基丙烯酸酯明胶。

称取0.1g光引发剂加入到10mL质量浓度为3％的盐酸溶液中，混合搅拌，得到基液；称取0.2g壳聚糖加入5mL基液中，得到壳聚糖溶液；称取1g甲基丙烯酸酯明胶加入5mL基液中，得到甲基丙烯酸酯明胶溶液。

37℃水浴加热下，用2mL的针管取1mL上述壳聚糖溶液，置于平板或柱状模具中，加入1mL上述甲基丙烯酸酯明胶溶液，快速均匀混合；10min后，在365nm波长，1.5mW/cm²功率的紫外灯下照射30s，即可得甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖半互穿网络水凝胶(G-2CS)。

将所得的半互穿网络水凝胶从模具中取出，浸泡在摩尔浓度为0.5mol/L的碳酸钠溶液中1h，得到膜状或块状互穿网络生物大分子水凝胶；室温下在磷酸盐缓冲液(PH＝7.4)中反复冲洗、去除残留碳酸根离子后，将其保存在去离子水溶液中，即可得甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖互穿网络水凝胶(G-2CS-IPN)。

应用例1

甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖互穿网络水凝胶生物相容性测试实验：

将圆柱形甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖互穿网络水凝胶块用环氧乙烷蒸气灭菌1h后，在无菌环境下，磷酸盐缓冲液中和、去离子水冲洗直至样品pH值达7.4；将骨髓间充质干细胞种植在水凝胶表面，细胞密度设定为1×105个/cm²，并在24孔板中培养；在第5天，用PBS冲洗细胞培养皿，并浸泡在1μg/mL的钙黄绿素乙酰甲酯(Calcein-AM)和5μg/mL碘化丙啶(PI)溶液30min，然后使用荧光显微镜对水凝胶表面进行观察。

结果如图2所示，纯壳聚糖水凝胶(CS)的表面不适合细胞粘附，表面只有少量细胞。相比之下，骨髓间充质干细胞在甲基丙烯酸酯明胶水凝胶(G)表面则表现出了很好的粘附和铺展能力。在同一浓度的甲基丙烯酸酯明胶和壳聚糖中，骨髓间充质干细胞在互穿网络水凝胶上表现出了比半互穿网络水凝胶更加铺展的形态学特征，这主要是由于互穿网络水凝胶具有更紧凑和平坦的表面。证明了甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖互穿网络水凝胶具有很好的生物相容性。

应用例2

甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖互穿网络水凝胶溶胀性能测试：

根据实施例1-3及对比例1-2所示方法，制备相应圆柱形水凝胶块冻干，准确称量其质量W_d；然后将样品在25℃温度下于磷酸盐缓冲液(pH＝7)中浸泡，24h后取出并且擦干样品表面的水分，称其质重W_s；水凝胶的溶胀率(Q_s)可由公式计算：

Q_s＝(W_s-W_d)/W_d

公式中：W_s为吸水水凝胶样品的质量；W_d为干燥水凝胶样品的质量。

结果如图3所示，壳聚糖水凝胶(CS)的溶胀率为37.4％，甲基丙烯酸酯明胶水凝胶(G)的溶胀率为约15.2％，将G和CS混合在一起后，与纯的G或CS水凝胶相比，所有组的溶胀率均显着降低，且G-2CS-IPN的溶胀率最小，仅为8.4％。

结果表明不同配比的甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖互穿网络水凝胶溶胀性能比甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖半互穿网络水凝胶的要低，且随着CS浓度的增加，溶胀率呈现下降趋势。

应用例3

甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖互穿网络水凝胶降解测试：

根据实施例1-3及对比例1-2所示方法，制备相应圆柱形水凝胶块，取5mL含有2.5U/mL I型胶原酶的磷酸盐缓冲液加入到放置水凝胶的量杯中，然后将它们放在130rpm的37℃恒温摇床中；每隔一段时间(4、12、24和48h)取出四个样品并擦干样品表面，将样品冻干，准确称量其干重W_r；同应用例2中的方法得到干燥水凝胶样品质量W_d；酶降解后的剩余质量百分数计算为：

Q_d＝(W_r-W_d)/W_d×100％

公式中：W_s为吸水水凝胶样品的质量；W_d为干燥水凝胶样品的质量。

在37℃下，用2.5U/mL胶原酶在磷酸盐缓冲液中测试降解性能，以模拟体内环境。结果如图4所示，壳聚糖水凝胶(CS)的降解主要是溶菌酶水解，48h降解后其重量损失小于14％；相反，甲基丙烯酸酯明胶水凝胶(G)的重量在24h降解后仅剩余13.8％，并且在48h完全降解。

实验结果表明，互穿网络水凝胶组比半互穿网络水凝胶组更稳定，且降解速率随着壳聚糖(CS)浓度的升高而降低，说明随着壳聚糖(CS)浓度的增加，所形成的网络结构更强。

应用例4

甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖互穿网络水凝胶压缩性能测试：

根据实施例1-3及对比例1-2所示方法，制备相应圆柱形水凝胶块，将不同配比的样品切成标准样条(直径×厚＝12mm×3mm)，将样品放置于动态力学拉伸仪(TAInstruments,America)两个平行板(直径25mm)的中心，并以恒定压缩速率(1mm/min)缓慢施加载荷，直到样条破裂，每组测试三个样品，绘制应力-应变曲线，取应力-应变曲线在0～10％的斜率作为压缩模量。

结果如图5和图6所示，壳聚糖水凝胶(CS)非常脆弱，压缩模量仅为3.43kPa；光交联的甲基丙烯酸酯明胶水凝胶(G)的压缩性能比CS强很多，压缩模量为31.08kPa；甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖互穿网络水凝胶(G-2CS-IPN)最硬，压缩模量可达到116kPa。

结果表明，与甲基丙烯酸酯明胶水凝胶(G)或壳聚糖水凝胶(CS)相比，通过形成甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖半互穿网络水凝胶或互穿网络水凝胶结构，水凝胶压缩性能大大增强，达到了软骨组织工程支架的要求。

应用例5

甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖互穿网络水凝胶拉伸性能测试：

根据实施例1-3及对比例1-2所示方法，制备相应圆柱形水凝胶块，将不同配比的样品切成标准样条(长×宽×厚＝15mm×8mm×2.5mm)，将样品置于动态力学拉伸仪(TAInstruments,America)的夹头中心，使其保持自然垂直，然后用夹具夹紧，夹具之间的间距为5mm。以恒定速率(1mm/min)缓慢施加载荷，直到样条断裂，绘制应力-应变曲线，并测量最大拉伸应力强度和断裂伸长率。

结果如图7和图8所示，甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖互穿网络水凝胶(G-2CS-IPN)的最高拉伸强度达到27.1kPa，约为甲基丙烯酸酯明胶水凝胶(G)的8倍；对于所有三组不同的甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖水凝胶，互穿网络结构比半互穿网络结构强得多。

结果表明半互穿网络水凝胶和互穿网络水凝胶杨氏模量随着壳聚糖(CS)浓度的增加而增加，且互穿网络水凝胶组的值远高于半互穿网络水凝胶组，表明壳聚糖的添加及其形成的氢键交联网络有利于提高甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖水凝胶的拉伸性能。