大豆螺旋藻复合提取物的制备方法及其在水松纸上的应用

摘要

本发明公开了一种大豆螺旋藻复合提取物的制备方法，包含步骤：1、大豆和螺旋藻：称量→干燥→研磨→浸泡→超声波法提取→冷藏浸提→离心→冷冻干燥→蛋白质提取物；2、离心后的大豆和螺旋藻渣：干燥→索氏提取→抽滤→萃取→静置分层→浓缩→干燥→油脂提取物；3、抽滤后的大豆和螺旋藻渣：碱提→离心→浓缩→醇沉→离心→多糖提取物；4、按重量比例1‑5:0.5‑1.5:0.5‑1分别取所述多糖提取物、蛋白质提取物和油脂提取物，即组成大豆螺旋藻复合提取物。本发明通过对大豆和螺旋藻进行连续式的综合利用，将低成本资源转为高附加值产物，并应用于水松纸上，改善卷烟的香气品质和感观舒适度，使其具备抗氧化、抗病毒、抑菌和抗湿性能，适合高品质香烟。

说明书

技术领域

本发明涉及天然植物活性成分的提取及其应用技术领域，具体是一种大豆螺旋藻复合提取物的制备方法及其在水松纸上的应用。

背景技术

目前我国卷烟产品在功能多样化和感官舒适度等方面还存在一定不足。为提升卷烟产品的整体品质，涉及烟叶原料、加工工艺和香精香料等领域的研究与探索均相继展开，而新型烟用添加剂的开发也是其中一项重要解决途径。

我国地大物博，植物种类繁多，所含有效成分的组成也各有特点，为烟用添加剂的开发提供了丰富的资源。可通过不同方式方法对植物有效成分进行提取分离，并针对卷烟产品的特点将提取物以不同形式应用于其中，以期提高卷烟的整体品质。

大豆，是中国、亚洲乃至世界各国人民自古以来就广泛种植、食用的豆类作物。我国大豆资源十分丰富，大豆中的蛋白质含量高、质量优，主要表现为大豆蛋白中必需氨基酸含量高、比例较平衡合理。大豆中除蛋白质外，大豆油也是优质油脂之一，其中不饱和脂肪酸含量较高，还含有对人体有益的多种维生素和矿物质，是人体微量元素的良好的来源，同时大豆中不含胆固醇，是优质蛋白质的重要来源，还含有人体不能合成而必须从食物中摄取的七种必须氨基酸。近几年，人们还发现大豆中含有许多鲜为人知的具有特殊生物学作用的活性物质，如大豆低聚糖、大豆皂贰、大豆异黄酮、大豆多肽、大豆磷脂等，具有抗氧化、抗疲劳、降血脂、增强免疫力和促进脂肪代谢等生理功能(张蓓.大豆的生物活性物质及生理功能[J].职业与健康，2003，(11)：77-78.)。

目前，大豆主要用于保健品行业(李健容.理想的保健食物——大豆[J].中国食物与营养，2006，(09)：51-54.)、饲料行业(王秀，唐永生，康志美.大豆浓缩蛋白在动物饲料中的研究应用[J].江西饲料，2011，(05)：13-15.)等方面，未见将大豆提取物应用于卷烟的相关报道。

螺旋藻广泛分布于淡水及盐碱性湖泊中，又称蓝细菌，迄今为止，我国国内工厂化大规模养殖的种类包括钝顶螺旋藻和极大螺旋藻。在自然界中，螺旋藻是迄今为止发现的营养最丰富、最全面的绿色天然食品，其化学组中蛋白质含量占60-70％，其中必需氨基酸全面，同时含较多对人体有益的多糖和油脂等活性成分(徐建红，辛晓芸，王爱业.螺旋藻的研究现状及进展[J].山西师范大学学报(自然科学版)，2003，3：57-63.)。研究证实，螺旋藻生物活性提取物具有抗氧化抗肿瘤(田宏，王南平，吴文惠，周喻，何兰，唐诣理，杜纯爽，包斌.螺旋藻提取物的抗氧化抗肿瘤活性作用特性[J].水产科技情报，2017，44(02)：73-77.)(王菲，佘星星，孙冰洁，杜嘉琛，张家玮，任迪峰，鲁军.螺旋藻γ-亚麻酸的提取优化及体外抗氧化活性的研究[J].食品工业技，2014，35(19)：68-72.)(张彤.螺旋藻多糖的提取、纯化与抗氧化活性的研究[D].沈阳农业大学，2016.)、抗辐射(刘文辉，刘昌英.螺旋藻及其提取物的抗辐射试验[J].江西中医学院学报，1996(S1)：21-22.)、抗癌和增强免疫力(王佾先，孟正木，亢寿海，王庭富，程晓芳，张琴芬.钝顶螺旋藻的抗癌作用及对免疫功能的影响[J].癌症，1996，(06)：25-27.)等生理功能。

目前，国内的螺旋藻还处于粗加工阶段，主要用于食疗与医药行业(程双奇，尹春南.螺旋藻的营养评价[J].营养学报，1990，12(4)：415-417.)、饵料与饲料行业(刘惠芳.螺旋藻在饲料工业中的应用[J].动物科学与动物医学，2001，18(2)：62-65.)和美容与化妆品行业(孟桦，王丽群.螺旋藻护肤系列产品疗效初探[J].东南亚地区医学美容学术交流会论文汇编，1998.)等方面，未见将螺旋藻提取物应用于卷烟的相关报道。

发明内容

本发明是基于上述研究现状对大豆螺旋藻的复合提取物进行研究，建立综合有效、并且低成本的多糖、蛋白质和油脂提取工艺，再以一定方式将得到的多糖提取物、蛋白质提取物和油脂提取物分别施加于水松纸上，实现在不改变卷烟的现有加工工艺的条件下，达到改善卷烟吸食品质和感官舒适度的目的。

本发明公开了一种大豆螺旋藻复合提取物的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、将大豆和螺旋藻分别干燥处理后，研磨成粉混合，室温下加入适量体积的磷酸缓冲液浸泡，采用超声波法初步提取，再于3-5℃条件下冷藏浸提3-5h后，离心，上层清液为蛋白提取液，将所述蛋白提取液冷冻干燥7h以上，得到蛋白质提取物；

步骤二、收集所述步骤一中离心后的大豆和螺旋藻渣干燥，加入适量体积的乙醚索氏提取后，固液分离，收集乙醚相，加入适量体积的水反复萃取，待静置分层，收集上部乙醚层浓缩干燥至膏状，得到油脂提取物；

步骤三、收集所述步骤二中固液分离后的固相，加入适量体积的碱性溶液，水浴提取若干小时，离心后，取上层清液，浓缩至30ml，再加入3-5倍体积的乙醇沉淀，离心，得到多糖提取物；

步骤四、分别收集所述多糖提取物、蛋白质提取物和油脂提取物，组成大豆螺旋藻复合提取物。

进一步，所述步骤一中干燥处理前的大豆和螺旋藻的重量比为3:2，所述步骤一中研磨成粉混合后的大豆和螺旋藻混合物与磷酸缓冲液的固液比为1:25。

进一步，所述步骤一中加入磷酸缓冲液浸泡的时间为1h。

进一步，所述步骤一中采用超声波法初步提取的时间为30min。

进一步，将所述步骤一中离心后的大豆和螺旋藻渣重复三次或三次以上如下操作：室温下加入适量体积的水浸泡30min，采用超声波法提取15min，再于5℃条件下冷藏浸提3h，以5000r/min离心45min，收集各次操作后所得上层清液。

进一步，所述步骤二中索氏提取的时间为5h。

进一步，所述步骤三中的碱性溶液为pH＝11-12的氢氧化钠水溶液。

进一步，所述步骤三中的水浴提取温度为95℃，水浴提取时间为3h。

本发明还公开了经上述方法制备的大豆螺旋藻复合提取物在水松纸上的应用，所述大豆螺旋藻复合提取物的添加方式如下，将多糖提取物和蛋白质提取物用丙二醇和水的混合液溶解，喷洒在水松纸上，再将油脂提取物涂布在水松纸上，涂布量为0.1-0.5g/m²。

进一步，所述混合液中丙二醇与水的体积比为1:1-1:5。

与现有技术相比，本发明的优点和产生积极效果是：

(1)本发明采用以大豆和螺旋藻纯天然植物为原料，不添加化学添加剂，健康安全，营养丰富。通过对大豆和螺旋藻进行连续式的综合利用，将低成本资源转变为具高经济附加值的产物，并应用于烟草行业，不仅有利于经济效益还可贴合现代的低碳环保主题。

(2)本发明制备方法得到的大豆和螺旋藻的复合提取物由多糖提取物、蛋白质提取物和油脂提取物组成，应用于水松纸上，可起到增甜增润的作用，吸烟者在抽吸卷烟过程中，嘴唇、舌头等味觉系统直接接触水松纸，有利于发挥其抗氧化的生物活性功效，减轻烟气刺激性，降焦减害，并且可直接感受水松纸上的味道，能明显减少吸烟者口腔的干燥感，增加生津感，同时可以增加烟气的甜润感；可以降低吸烟者通过嘴唇与水松纸接触沾染细菌或病毒的可能性；能够提高水松纸抗水抗湿性能，降低吸水性，使卷烟在抽吸时不粘唇，还能够滋润唇部，防止干燥，香味怡人，能够改善口腔异味，适合高品质香烟。

(3)本发明不改变卷烟的原有性能，不改变卷烟原有的加工工艺，通过将大豆和螺旋藻的复合提取物应用于水松纸上，进而改善卷烟的香气品质和感观舒适度，因此更具有实际生产的意义和价值。

(4)本发明与添加剂直接添加到烟丝中的方式相比，将其应用于水松纸上，因此，不会由于烟丝燃烧而导致出现其他可能产生的有害化学物质。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细的说明：

实施例1

一种大豆螺旋藻复合提取物的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、将60g大豆和40g螺旋藻分别干燥处理后，研磨成粉混合，室温下加入1.5L磷酸缓冲液浸泡1h，采用超声波法初步提取30min，再于3℃条件下冷藏浸提3h，以5000r/min离心45min，将离心后的大豆和螺旋藻渣重复三次如下操作：室温下加入1L水浸泡30min，采用超声波法提取15min，再于5℃条件下冷藏浸提3h，以5000r/min离心1h，上层清液为蛋白提取液，将所述蛋白提取液于0℃条件下冷冻干燥7h，得到蛋白质提取物；

步骤二、将步骤一离心后的大豆和螺旋藻渣干燥，加入500mL乙醚40℃索氏提取5h，抽滤处理后，收集滤液，加入500mL水反复萃取，静置分层，取上部乙醚层浓缩干燥至膏状，即得到油脂提取物，备用；

步骤三、收集步骤二抽滤后的大豆和螺旋藻渣，加入500mL pH 11的氢氧化钠水溶液，95℃水浴提取3h，离心45min，取上层清液，浓缩至30ml，再加入3倍体积的乙醇沉淀，离心，即得到多糖提取物；

步骤四、分别收集所述多糖提取物、蛋白质提取物和油脂提取物，组成大豆螺旋藻复合提取物。

实施例2

一种大豆螺旋藻复合提取物的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、将60g大豆和40g螺旋藻分别干燥处理后，研磨成粉混合，室温下加入1.5L磷酸缓冲液浸泡1h，采用超声波法初步提取30min，再于4℃条件下冷藏浸提5h，以5000r/min离心45min，将离心后的大豆和螺旋藻渣重复三次如下操作：室温下加入1L水浸泡30min，采用超声波法提取15min，再于5℃条件下冷藏浸提3h，以5000r/min离心1h，上层清液为蛋白提取液，将所述蛋白提取液于0℃条件下冷冻干燥9h，得到蛋白质提取物；

步骤二、与实施例1步骤二相同；

步骤三、与实施例1步骤三相同；

步骤四、与实施例1步骤四相同。

实施例3

一种大豆螺旋藻复合提取物的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、将60g大豆和40g螺旋藻分别干燥处理后，研磨成粉混合，室温下加入1.5L磷酸缓冲液浸泡1h，采用超声波法初步提取30min，再于5℃条件下冷藏浸提3h，以5000r/min离心45min，将离心后的大豆和螺旋藻渣重复三次如下操作：室温下加入1L水浸泡30min，采用超声波法提取15min，再于5℃条件下冷藏浸提3h，以5000r/min离心1h，上层清液为蛋白提取液，将所述蛋白提取液于0℃条件下冷冻干燥12h，得到蛋白质提取物；

步骤二、与实施例1步骤二相同；

步骤三、与实施例1步骤三相同；

步骤四、与实施例1步骤四相同。

实施例4

一种大豆螺旋藻复合提取物的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、将60g大豆和40g螺旋藻分别干燥处理后，研磨成粉混合，室温下加入1.5L磷酸缓冲液浸泡1h，采用超声波法初步提取30min，再于5℃条件下冷藏浸提4h，以5000r/min离心45min，将离心后的大豆和螺旋藻渣重复五次如下操作：室温下加入1L水浸泡30min，采用超声波法提取15min，再于5℃条件下冷藏浸提3h，以5000r/min离心1h，上层清液为蛋白提取液，将所述蛋白提取液于0℃条件下冷冻干燥12h，得到蛋白质提取物；

步骤二、与实施例1步骤二相同；

步骤三、与实施例1步骤三相同；

步骤四、与实施例1步骤四相同。

实施例5

一种大豆螺旋藻复合提取物的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、将60g大豆和40g螺旋藻分别干燥处理后，研磨成粉混合，室温下加入1.5L磷酸缓冲液浸泡1h，采用超声波法初步提取30min，再于5℃条件下冷藏浸提5h，以5000r/min离心45min，将离心后的大豆和螺旋藻渣重复七次如下操作：室温下加入1L水浸泡30min，采用超声波法提取15min，再于5℃条件下冷藏浸提3h，以5000r/min离心1h，上层清液为蛋白提取液，将所述蛋白提取液于0℃条件下冷冻干燥16h，得到蛋白质提取物；

步骤二、与实施例1步骤二相同；

步骤三、与实施例1步骤三相同；

步骤四、与实施例1步骤四相同。

实施例6

一种大豆螺旋藻复合提取物的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、与实施例1步骤一相同；

步骤二、与实施例1步骤二相同；

步骤三、收集步骤二抽滤后的大豆和螺旋藻渣，加入500mL pH 12的氢氧化钠水溶液，95℃水浴提取3h，离心45min，取上层清液，浓缩至30ml，再加入5倍体积的乙醇沉淀，离心，即得到多糖提取物；

步骤四、与实施例1步骤四相同。

对比例1

一种大豆复合提取物的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、将100g大豆干燥处理后，研磨成粉混合，室温下加入1.5L磷酸缓冲液浸泡1h，采用超声波法初步提取30min，再于3℃条件下冷藏浸提3h，以5000r/min离心45min，将离心后的大豆和螺旋藻渣重复三次如下操作：室温下加入1L水浸泡30min，采用超声波法提取15min，再于5℃条件下冷藏浸提3h，以5000r/min离心1h，上层清液为蛋白提取液，将所述蛋白提取液于0℃条件下冷冻干燥7h，得到蛋白质提取物；

步骤二、与实施例1步骤二相同；

步骤三、与实施例1步骤三相同；

步骤四、与实施例1步骤四相同。

对比例2

一种螺旋藻复合提取物的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、将100g螺旋藻干燥处理后，研磨成粉混合，室温下加入1.5L磷酸缓冲液浸泡1h，采用超声波法初步提取30min，再于3℃条件下冷藏浸提3h，以5000r/min离心45min，将离心后的大豆和螺旋藻渣重复三次如下操作：室温下加入1L水浸泡30min，采用超声波法提取15min，再于5℃条件下冷藏浸提3h，以5000r/min离心1h，上层清液为蛋白提取液，将所述蛋白提取液于0℃条件下冷冻干燥7h，得到蛋白质提取物；

步骤二、与实施例1步骤二相同；

步骤三、与实施例1步骤三相同；

步骤四、与实施例1步骤四相同。

依次移取实施例1-6、对比例1-2的蛋白提取液，采用紫外分光光度法测定蛋白提取液在280nm的吸光度，求得蛋白质含量，计算得到蛋白提取率，结果如下表1所示：

表1实施例1-6、对比例1-2的蛋白提取液对应的蛋白提取率

样品名称蛋白提取率/％实施例12.21实施例22.19实施例32.17实施例42.23实施例52.19实施例62.20对比例11.92对比例21.87

实验结果表明，相同条件下，大豆螺旋藻复合提取的蛋白提取率明显高于纯大豆提取或纯螺旋藻提取的蛋白提取率。

依次移取实施例1-6、对比例1-2的多糖提取液，采用紫外分光光度法测定多糖提取液在490nm的吸光度，求得多糖质含量，计算得到多糖提取率，结果如下表2所示：

表2实施例1-6、对比例1-2的多糖取液对应的多糖提取率

样品名称多糖提取率/％实施例13.13实施例23.07实施例33.11实施例43.09实施例53.14实施例63.12对比例12.63对比例22.72

实验结果表明，相同条件下，大豆螺旋藻复合提取的多糖提取率明显高于纯大豆提取或纯螺旋藻提取的多糖提取率；

分别将实施例1-6、对比例1-2制备的复合提取物进行体外抗氧化活性实验。

(1)DPPH自由基清除能力的测定

[参考文献]【Shcherba,V.V.,Babitskaia,V.G.,Kurchenko,V.P.,Ikonnikova,N.V.and Kukukianskaia,T.A.Antioxidant features of fungal melanin pigments[J].Prikl Biokhim Mikrobiol,2000,36:569～574.】

①样品溶液配制

分别称取少量样品配制成1mg/ml的溶液。

②试剂配制

*0.1mM DPPH-甲醇溶液200ml：

DPPH的质量＝0.2*0.1*0.001*394.42*1000＝7.8884mg；

*0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)：

Tris的质量＝0.1*50*0.001*121.14＝605.7mg，加入0.1mol/L盐酸42ml，再加水至100ml，并用广范PH试纸测得PH＝7.4。

③操作步骤

(2)对羟自由基清除能力的测定

[参考文献]【Smironff N,Cumbes Q J.Hyroxyl radical scavenging activityof compatible solutes[J].Phytochemistry,1989,28(3):1057-1060.】

①样品溶液配制

分别称取少量样品配制成1mg/ml的溶液。

②试剂配制

*7.5mmol/L硫酸亚铁溶液40ml：

硫酸亚铁的质量＝7.5*0.001*40*0.001*278＝83.4mg；

*7.5mmol/L邻二氮菲溶液40ml。

邻二氮菲的质量＝7.5*0.001*40*0.001*180＝54mg；

*磷酸盐缓冲溶液200ml：

将183ml 0.2mol/l磷酸氢二钠和17ml 0.3mol/l磷酸二氢钠相互混合得到pH等于7.8的磷酸盐缓冲溶液200ml；

*0.1％的H₂O₂溶液60ml：

吸取市售过氧化氢(市售过氧化氢含量为质量体积百分比30％)0.2ml滴入到60ml的纯净水中。

③操作步骤

结果如下表3所示：

表3大豆螺旋藻复合提取物体外抗氧化活性实验结果

实验结果表明，大豆螺旋藻复合提取物具有一定的抗氧化活性功效，并且其抗氧化活性高于纯大豆复合提取以及纯螺旋藻复合提取物的抗氧化活性。

分别将实施例1-6制备的大豆螺旋藻复合提取物进行体外抑菌抗病毒试验。

(1)体外抑菌实验

①细菌悬液的制备

将保存菌种接种于MH肉汤中，置于37℃恒温箱中复活16-24h。平板划线后倒置于37℃恒温箱中培养24h。挑取3-5个菌落于装有生理盐水的试管，调整浑浊度至0.5麦氏比浊度(1-2×10⁸CFU/mL)备用。

②微量肉汤二倍稀释法测定大豆螺旋藻复合提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌的MIC值。

取无菌96孔板，分别于每一排的第一孔加大豆螺旋藻复合提取物200μL，其余各孔均加入MH肉汤100μL，于第一孔取100μL药液加入第二孔，充分混匀后再从第二孔取100μL于第三孔，以此类推，最后一孔不加药液，作为阴性对照。同时以青霉素作为阳性对照。将稀释至0.5麦氏比浊度的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌标准菌悬液再稀释100倍，并分别加入加了提取液液的96孔板，每孔100μL。每排药液的最终浓度：500mg/mL、250mg/mL、125mg/mL、62.5mg/mL、31.3mg/mL、15.6mg/mL、7.8mg/mL、3.9mg/mL、2.0mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0mg/mL菌液加好后置无菌盒中，37℃恒温箱培养24h。

③结果判定

在黑色背景的光源下与对照组孔(包括青霉素对照、肉汤对照)作比较，检测菌株的生长情况。若96孔板内肉汤呈混浊生长，孔底出现沉淀等判断为有菌生长；反之，澄清为无菌生长。无细菌生长孔所含的最低抗菌药物浓度即为MIC值(最低抑菌浓度)。

④实验结果

结果如下表4所示：

表4大豆螺旋藻复合提取物体外抑菌实验结果

实验结果表明，大豆螺旋藻复合提取物对三种致病菌均有显著地抑菌作用。

(2)体外抑菌实验

①细胞和病毒：MDCK细胞(狗肾细胞)；流感病毒A/H1N1，流感病毒A/H3N2和流感病毒/B。

②细胞毒性实验：将处于指数生长期的MDCK细胞(狗肾细胞)铺在96孔板上，细胞数为2×10⁴/孔。然后给予大豆螺旋藻复合提取物溶液，浓度范围为0-2000μg·mL^-137℃培养48h。MDCK细胞的毒性试验采用CPE法。受试药物对细胞半数有毒浓度(TC₅₀)采用Reed&Muench方法计算。

③抗流感病毒活性实验：将MDCK细胞接种于96孔板(细胞数为

2×10⁵/mL)，待细胞长成单层后感染一定量的病毒(约100TCID₅₀)。37℃吸附2h后，用无血清MEM冲洗，换上含有不同浓度受试物的维持液37℃、5％CO₂中孵育，同时设不含受试药物的病毒对照组和正常细胞对照组。当病毒对照组的细胞病变(CPE)达到4+时，观察并记录各组的CPE结果。抗病毒的活性采用Reed&Muench方法进行计算。

抗病毒效果评价：以选择指数I_S表示(I_S＝TC₅₀/IC₅₀)，I_S＞2表示低毒高效，1＜I_S＜2表示高毒低效，I_S＜1表示无效。

④实验结果

结果如下表5所示：

表5大豆螺旋藻复合提取物体外抗病毒实验结果

实验结果表明，大豆螺旋藻复合提取物对三种流感病毒株均具有一定的抑制作用，具有良好体外抗病毒作用。

将实施例1-6制备的大豆螺旋藻复合提取物进行抗湿性实验。

取适量大豆螺旋藻复合提取物放置于烧杯中，分别以6h时间内大豆螺旋藻复合提取物的吸水量来表征吸湿性，结果如下表6所示：

表6大豆螺旋藻复合提取物体抗湿性实验结果

实验结果表明，大豆螺旋藻复合提取物具有较好的抗水抗湿性能。

实施例7

分别将上述实施例1-6、对比例1-2制备的复合提取物应用于水松纸上，其添加方式如下，用体积比为1:3的丙二醇和水的混合液溶解多糖提取物和蛋白质提取物，喷洒在水松纸上，再将油脂提取物涂布在水松纸上，涂布量为0.3g/m²。

参照YC/T 497-2014《卷烟中式卷烟风格感官评价方法》对应用了本发明应用的卷烟进行感官评价，结果如下表7所示：

表7卷烟感官评价

感官评价结果表明，大豆螺旋藻复合提取物应用于水松纸上，烟气的甜润感明显，香味怡人，能够改善口腔异味，适合高品质香烟。

上述实施例仅是本发明的较优实施方式，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修饰、修改及替代变化，均属于本发明技术方案的范围内。