一种能同时检测动物可食性产品和饲料中五类药物的液相色谱-串联质谱法

摘要

本发明公开了一种能同时检测动物可食性产品和饲料中五类药物的液相色谱‑串联质谱法，所述五类药物为肾上腺素类药物、类固醇激素、精神类药物、着色剂、抗氧化剂，属于药物残留检测分析技术领域，该方法包括样品前处理和液相色谱‑串联质谱检测两个步骤。本发明丰富和完善了现有检测技术，能同时测定88种药物，操作简便快捷，适用于饲料和多种动物性食品中多种药物的同时检测。

说明书

技术领域

本发明属于药物残留检测分析技术领域，涉及动物组织和饲料中多种药物残留的检测方法。

背景技术

随着社会的发展，养殖业也发生了巨大的改变，逐渐呈现规模化和集约化的发展趋势。如何确保饲料安全和动物性食品的安全问题成了养殖业的一大难题。早期，众多能有效促进动物生长的药物被大量用于饲料添加，如肾上腺素类药物，性激素等。随之引发了一系列的食品安全问题如出现中毒事件。随着科技的不断发展，养殖过程中药物使用规范也在日益完善。2010年，我国农业部颁布了禁止在畜禽饲料和饮水中使用的药物品种目录，其中明确规定肾上腺素受体激动剂、性激素、蛋白同化激素和精神药品严禁使用。然而被禁止使用的一系列药物由于具有促生长的作用，养殖户为了谋取经济利益，乱用滥用甚至是非法使用现象屡禁不止。这些药物在发生药理作用的之后，药物原型或者代谢产物排出体外会造成一定的环境污染。残留在动物体内的药物则会导致药物蓄积在动物性食品中，危害人体健康，导致一系列的健康问题，如肾上腺素类药物中毒导致运动障碍、低血钾、心律失常和肌肉疼痛震颤。严重时会导致呼吸衰竭甚至是休克。类固醇类药物摄入过多会影响垂体和性腺的正常功能，影响肝脏的正常功能，甚至是引发癌变。精神类药物会导致不同程度的头昏、嗜睡、震颤和乏力。也可能会出现共济失调、恶心、兴奋、言语不清、血压降低、呕吐甚至出现昏迷、休克和呼吸抑制等症状。着色剂如苏丹类和抗氧化剂的过量摄入有引发癌症的可能。为此上述五类药物的违法或不规范使用对动物食品所带来的危害引起了人们的广泛关注。

各个国家对饲料以及动物性食品中的这五类药物做出了一系列的规定，这些规定在不断的完善。目前只有少数药物有明确的最高残留限量规定，大多药物为禁用药物。我国就在2010年，颁布了禁止在畜禽饲料和饮水中使用的药物品种目录，其中明确规定肾上腺素受体激动剂、性激素、蛋白同化激素和精神药品严禁在饲料和动物饮水中使用。欧洲共同体委员会指令96/22/EC中禁止将糖皮质激素类药物，部分肾上腺药物用于促生长。各国相继颁布了《动物性食品中兽药最高残留限量》《兽药管理条例》等一系列相关条例。

对于饲料添加剂在饲料和动物可食性组织中的检测，目前已经成为饲料安全和可食性动物食品安全保障中非常关键重要的一个环节。随着检测技术的发展，国内外对于饲料以及可食性动物产品中的饲料添加剂的检测研究已经有很多相关的报道。然而仍存在着一定的不足，如同时检测的药物过少，多针对某一类，或某一个药物。同时检测的药物种类多时却只涉及这五类药物中的部分药物。目前专门针对多类违禁类药物的检测还不够全面细致，有待完善。在基质的选择上不够全面。常见的基质有肌肉、牛奶、肝脏和肾脏等，基质种类少。

目前报道的违禁类饲料添加剂的检测研究在药物检测和基质监控等方面还有待提高。同时检测多种基质中的肾上腺素能药物、类固醇激素、精神类药物、抗氧化剂和色素类的筛选法还没有出现。固相萃取法作为常见的前处理方法，目前发展已经较为成熟，高效精确的液相色谱-串联质谱技术为多种饲料添加剂的检测奠定了基础。本发明同时检测动物可食性产品和饲料中的肾上腺素类药物、类固醇激素、镇静药、着色剂、和抗氧化剂类药物共5类88种药物的方法，操作简单，便捷，灵敏度高，重复性好，同时检测的药物种类多，能有效适用于大批量的样品检测。

发明内容

本发明意义在于提供了同时检测动物可食性产品和饲料中共五大类88种药物的液相色谱-串联质谱法。丰富和完善了现有检测技术，能同时测定88种药物，操作简便快捷，同时适用于饲料和多种动物性食品中药物的检测。

本发明提供的方法包括以下步骤：

(1)样品前处理：包括提取和纯化两个步骤，

提取：准确称取2.0g样品置于50mL离心管中，加入5mL乙腈-乙酸乙酯混合溶液，旋涡振荡提取，离心，剩余残渣再加入5mL含1％体积氨水的乙腈-乙酸乙酯混合溶液旋涡振荡提取，离心，合并两次提取液，混匀，氮气吹干后用5mL甲醇复溶；

纯化：将固相萃取小柱活化，然后将提取液上样，弃去流出液，先用3mL水淋洗，然后用10mL乙腈-乙酸乙酯混合溶液洗脱，洗脱液于30℃水浴下氮气吹干，用初始流动相1mL复溶，即得待测样品溶液；

(2)液相色谱-串联质谱检测

取待测样品溶液10μL进行液相色谱-串联质谱检测，液相色谱条件是：色谱柱为Hypersil Golden C18色谱柱，柱温40℃，流速0.2mL/min，采用流动相进行梯度洗脱，所述流动相由A相和B相组成，A相是5mM乙酸铵溶液，B相是含0.1％甲酸的乙腈，梯度洗脱程序及各时间点A相和B相占流动相的体积比为下表1：

表1流动相梯度洗脱条件

质谱条件是：API5000三重四级杆串联质谱仪：正负离子模式；电喷雾离子源；扫描方式：多反应监测；离子源温度500℃；碰撞气压力0.021MPa；气帘气压力0.24MPa。

优选地，所述乙腈-乙酸乙酯混合溶液的体积比是1:1。

所述动物可食性产品包括但不限于肉类如猪、鸡、牛、羊的肌肉、肝脏、肾脏等；蛋类如鸡蛋、鸭蛋等；奶如牛奶、羊奶等；以及蜂蜜。

本发明所述的五大类药物指的是肾上腺素类药物、类固醇激素、精神类药物、着色剂、抗氧化剂，具体为以下88个品种：

类固醇激素：诺龙、双酚A、双烯雌酚、己烷雌酚、炔雌醇、雌酮、辛基酚、雌二醇、睾酮、氟甲睾酮、4-壬基酚、雌三醇、己烯雌酚、甲基睾酮、美仑孕酮、勃地酮、醋酸甲羟孕酮、苯丙酸诺龙、表睾酮、丙酸睾酮、苯甲酸雌二醇、醋酸甲地孕酮、康力龙、丙酸诺龙、黄体酮、群勃龙、醋酸氯地孕酮、丙酸倍氯他索、可的松、倍氯米松、甲基泼尼松、曲安西龙、醋酸氟轻松、曲安奈德、布地奈德、泼尼松、倍他米松、地塞米松、泼尼松龙、双氟米松、氢化可的松、氟氢可的松、氟米龙。

肾上腺素类药物：齐帕特罗、盐酸拉贝洛尔、特布他林、苯乙醇胺A、福莫特罗、卡拉洛尔、马喷特罗、倍他洛尔、溴氯布罗、克伦潘特、莱克多巴胺、克伦葡罗、西马特罗、美托洛尔、克仑塞罗、喷布特罗、非诺特罗、沙美特罗、氯丙那林、普萘洛尔、沙丁胺醇、拉贝特罗、丙卡特罗。

精神类药物：利血平、奋乃静、阿扎哌隆、利多卡因、氟哌啶醇、卡马西平、氯丙嗪、苯佐卡因、阿扎哌隆、地西泮、盐酸异丙嗪、咪达唑仑。

着色剂和抗氧化剂：4-氨基偶氮苯、苏丹Ⅳ、苏丹Ⅲ、丁羟基茴香醚、苏丹Ⅱ、乙氧基喹啉、苏丹Ⅰ、BHT、邻氨基偶氮甲苯、没食子酸丙酯。

本发明有益效果在于：

(1)本发明建立了一种饲料和动物源性食品中肾上腺素类药物、类固醇激素、精神类药物、着色剂、和抗氧化剂类药物5类88种药物液相色谱-串联质谱检测方法。

(2)本发明采用溶剂提取和固相萃取小柱净化的方法，缩短了组织样品处理时间，有机试剂的使用量减少，避免了不必要的污染。具备操作过程比较简单，省时，回收率较高，试剂成本低等优势。

(3)本发明意义在于提供了一种同时检测5类88种药物在饲料和动物性食品中的筛选法。丰富和完善了现有检测技术，能同时测定88种药物，操作简便快捷，同时适用于饲料和多种动物性食品中药物的检测。

(4)本发明包括了18种基质，猪、鸡、牛、羊的肌肉、肝脏、肾脏，鸡蛋、牛奶、蜂蜜。饲料包括猪饲料、鸡饲料和鱼饲料。适用的基质范围更加广泛。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行详细地说明。

(1)样品前处理：

提取准确称取2.0g样品置于50mL离心管中，加入5mL乙腈-乙酸乙酯(1:1)，旋涡振荡2min，8000r/min离心5min，剩余残渣加入5mL 1％氨水-乙腈-乙酸乙酯溶液旋涡振荡2min，8000r/min离心5min。和并两次提取液，混匀。氮吹后用5mL甲醇复溶，待净化。

净化固相萃取小柱分别用甲醇和水5mL活化，保持柱子的湿润，上样，弃去流出液，3mL水淋洗，用10mL的乙腈-乙酸乙酯(1:1)洗脱，洗脱液于30℃水浴下氮气吹干，初始流动相1mL复溶，LC-MS/MS测定。

(2)液相色谱-串联质谱检测

液相条件：

色谱柱为Hypersil Golden C18色谱柱(150mm×2.1mm×5μm)；柱温：40℃；进样体积：10μL；流速：0.2mL/min；流动相：5mM乙酸铵溶液，0.1％甲酸-乙腈。洗脱梯度：流动相的洗脱梯度见表1所示。

表2流动相梯度洗脱条件

时间(min)5mM乙酸铵溶液(％)0.1％甲酸-乙腈(％)09555955107525255050405955259552.195560955

质谱条件：

API5000三重四级杆串联质谱仪：正负离子模式；电喷雾离子源；扫描方式：多反应监测；离子源温度500℃；碰撞气压力0.021MPa；气帘气压力0.24MPa；仪器校准后确认气体和电压等工作正常。取单个药物的100μg/L标准工作液，设置注射泵的流速5-10μL/min。根据药物的不同模式，分情况选取正离子模式或负离子模式，分别优化母离子、子离子、CE值、DP值。

本发明涉及药物种类较多，因此根据各药物的调谐方法中优化出的各项参数数值，取其中间值，以保证各药物离子的强度，优化后的母离子、子离子、CE值、DP值及保留时间见表3。

表3各药物的质谱参数及保留时间结果

注：标记(-)的为负离子模式药物，没有标记的为正离子模式药物。

(3)方法的考核参数及结果

本发明是采用液相色谱串联质谱的方法，通过液相对目标化合物的分离用质谱进行检测，保留时间和离子对参数对每一个物质进行定性和质谱确证，采用标准对照品和实测样品的峰面积对每一个物质进行定量。具体参数如下：

特异性分析：特异性是指方法区分待测分析物之间、待测分析物和其它物质的能力。对于分析方法来说，区分分析物与相近有关物质(异构体、代谢物、降解产物、基质成分等)的能力至关重要。本实验使用三种方法进行特异性分析。首先针对标准溶液的色谱图结果进行分析，考察各目标化合物的色谱峰之间的分离度，来确定各目标分析物之间是否存在干扰；其次，分析一定数量的代表性空白样品(n≥20)，检查在目标分析物出现的区域是否有干扰(信号、峰、离子扫迹等)；此外，在空白样品中添加一定浓度的标准溶液，与标准溶液色谱图进行对照，检查是否存在干扰目标分析物定性和(或)定量的物质。本方法通过色谱条件优化之后，标准混合溶液检测结果显示各个药物分离良好，各目标化合物之间不存在干扰。试验中将20个空白样与标准混合溶液的结果进行比较，在目标化合物出现的区域无干扰信号。

检测限、定量限和CCβ的测定：空白样品中添加已知浓度的药物标准品工作液，使添加浓度依次降低，按照优化出的制样方法处理，重复操作5次，经测定，以能达到信噪比S/N≥3时样品的最低浓度为组织中的最低检测限(LOD)，以能达到S/N≥10时样品的最低浓度为最低定量限(LOQ)。按照欧盟2002/657/EC中对筛选方法考核项目的规定，必须对CCβ进行测定，筛选方法的主要指标就是防止假阴性的出现，因此CCβ是筛选方法的主要参数。2002/657/EC在1.12中给出了检测限的定义：是指以误差率为β确定样品中物质能被检测、鉴别和/或定量的最小含量。对于尚未建立容许限的物质，检测能力是指方法能以1-β置信度检出确被污染的样品中该物质的最低浓度。对于已经建立了容许限的物质，检测能力就是方法能以1-β置信度检出的该物质的容许限浓度。β误差是指被测样品确为阳性的概率(即便得到的测量结果为阴性，即假阴性判断)。对于筛选方法的β误差应该≤5％。CCβ的计算公式如下：

CCβ＝CCα+1.64*SD_VL

CCα＝VL+1.64*SD_VL

VL即Validation Level，对于有MRL或者MRPL规定的药物，VL等于其MRL或MRPL，对于没有MRL或者MRPL规定的药物，VL则根据药物的性质、种类、在仪器中的响应、其同类药物的MRL或者MRPL来确定，在本研究中，对于没有MRL或者MRPL规定的药物，以其LOQ为VL来计算CCβ。SD_VL是指在VL浓度下的标准差。

统计不同基质中不同药物的定量限、检测限和CCβ值，所有药物的最低检测限为0.01-0.5μg/kg，最低定量限为0.03-1μg/kg。纵观所有药物的检测限和定量限均低于残留限量。

基质效应结果：本实验在样品处理后加入标准溶液法对基质效应进行评价，分别利用纯提取溶剂和空白样品提取液配制标准溶液的方法。比较两者的仪器响应值，主要为峰面积和保留时间。基质效应在一定程度上无法彻底消除。比较结果发现，药物保留时间变化在可接受范围内，表示杂质对保留时间干扰小甚至没有干扰，药物的峰面积没有显著差异。研究的药物中有个别的药物存在基质效应增强，如增强作用最大的沙丁胺醇和莱克多巴胺，增强作用在40％左右。定量分析时，由于存在基质效应，需要做基质匹配标准曲线从而定量。精密度和准确度测定时，选用空白基质提取液配制标准溶液进行单点校正来计算回收率和变异系数，以消除基质效应对方法准确度和精密度测定的干扰。本试验时筛选法的研究，主要是避免假阴性的存在，基质增强效应下，药物灵敏度提高，基质效应减弱虽然会影响灵敏度，但作用较小，低于10％。本实验中药物的定量限和检测限均小于MRLs，符合筛选法的要求。因此认为基质效应对方法的考核指标没有影响。

准确度和精密度测定：在空白样品中添加药物，对于有最高残留限量规定的，添加浓度分别为LOQ，MRLs，2MRLs，对于没有最高残留限量规定的，添加浓度分别为LOQ，2LOQ，4LOQ,每个样品平行测定5次，重复5天，进行准确度和精密度试验。所有药物在动物组织中的回收率为：33.55-79.94％，变异系数≤19％；所有药物在饲料中的回收率为：45.63-89.62％，变异系数≤16.67％。根据欧盟非强制执行法案2002-657-EC，筛查法考核指标中对回收率并没有相关规定，因此上述结果符合方法考核标准。