一株2，4-二硝基甲苯磺酸盐高效降解菌株Sphingomonas sp.X4及其应用

摘要

本发明公开了一株2，4‑二硝基甲苯磺酸盐高效降解菌株Sphingomonas sp.X4及其应用。该菌株已于2017年9月15日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.14585。本发明还公开了筛选2,4‑二硝基甲苯磺酸盐高效降解菌株的方法以及应用此菌株降解TNT红水及红水污染土壤的使用方法。将上述菌株培养至对数生长期，接种到2，4‑DNT‑3‑SA和2，4‑DNT‑5‑SA浓度分别为500mg/kg的污染土壤中，经过4‑6天处理后，两种2,4‑二硝基甲苯磺酸盐的去除率均达到100％。该菌株硝基化合物类有机污染土壤修复中具有很好的应用。

说明书

技术领域

本发明属于环境生物领域，具体涉及一株TNT红水污染土壤中主要污染物2,4-二硝基甲 苯磺酸盐降解菌株Sphingomonas sp.X4的分离及应用

背景技术

TNT红水是TNT废水的一种，产生于TNT精制过程。三段硝化法制得的TNT粗品大 概含有4.5％的同分异构体，主要是2,4,5－和2,3,4－三硝基甲苯。为达到军用纯度，通常采用亚硫酸钠精制法对TNT粗品进行精制，去除这些同分异构体。亚硫酸钠可与TNT的同分 异构体进行反应，分别生成2，4-DNT-3-SA和2，4-DNT-5-SA，是TNT红水中的主要成分。 TNT红水的渗漏造成了严重的土壤污染问题。

土壤生物修复技术发源于20世纪80年代，与物理和化学法相比，生物修复技术具有成 本相对较低、处理效果较好、操作简单、不易造成二次污染、能实施原位处理等优点，成为 一种高效、经济和生态友好型的修复技术，是当前土壤修复技术研究领域的前沿，且具有实 际应用价值。

许多学者分离出了能应用于火炸药污染物降解的菌株。Duque等首次从TNT污染土壤中 分离出能降解TNT的细菌—假单胞杆菌C1S1，该细菌能够将TNT、2,4-DNT，2-MNT作为唯一氮源。Oh等人从TNT污染土壤中分离出绿脓杆菌属，该均属能产生硝基还原酶促进TNT的降解。Nyanhongo等人从TNT污染水体和土壤中分离出假单胞菌属GG04和芽孢杆菌SF， 能够杨浦晓得降解TNT。Gumuscu等人分离出了无色菌STE 11，能将TNT作为唯一的氮源， 主要转化为DNT、AMNT。Khan等人从TNT污染场地中分离出新型嗜甲基菌属，该菌群在 加入淀粉强化情况下能将TNT苯环开环且不产生其它有毒副产物。

但是，尚未有研究指出在土壤中分离出可以降解二硝基甲苯磺酸盐的微生物。本发明从 土壤中分离出一株可以降解二硝基甲苯磺酸盐的工程菌株并将其制成菌液，投加到TNT红水 污染土壤中进行土壤修复。

发明内容

本发明的目的在于克服现有TNT红水及TNT红水污染土壤修复技术的缺陷和不足，提供 一株2,4-二硝基甲苯磺酸盐高效降解菌及其应用。

为实现上述发明的目的，本发明的技术方案为：

一株2，4-二硝基甲苯磺酸盐高效降解菌株鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas sp.X4，于2017 年9月15日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.14585，保藏 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明所提供的高效降解菌株Sphingomonas sp.X4从甘肃省白银TNT红水污染土壤中 富集、驯化、分离纯化得到。菌落呈黄色，圆形隆起，表面光滑湿润，易挑取，革兰氏染色 阴性。在显微镜下细胞呈杆状。上述菌株的16S rRNA基因序列特征，采用分析法将序列与 数据库进行比对分析，发现该菌株属于鞘氨醇菌属(Sphingomonas sp.)，其DNA序列表如下 文所示。

上述2,4-二硝基甲苯磺酸盐降解菌株Sphingomonas sp.X4或其菌悬液在降解硝基芳香族 炸药(TNT、DNT、MNT等)方面的应用也在本发明的保护范围之内。

上述应用的具体方法为：使用前将降解菌株Sphingomonas sp.X4在LB液体培养基中， 30℃条件下活化至对数生长期，将菌液以5-10％的接种量接种于TNT红水或污染土壤中。

优选的，所述的降解的最佳条件为：10％的接种量，液土比为2:5，温度为30℃，pH为 7。

附图说明

图1为菌株Sphingomonas sp.X4的群落形态

图2为菌株Sphingomonas sp.X4的扫描电镜图

图3为菌株Sphingomonas sp.X4在30℃下的生长曲线

图4为Sphingomonas sp.X4对两种2，4-二硝基甲苯磺酸盐的降解曲线。

图5为Sphingomonas sp.X4在不同pH下对两种2，4-二硝基甲苯磺酸盐的降解率。

图6为Sphingomonas sp.X4在不同温度下对两种2，4-二硝基甲苯磺酸盐的降解率。

具体实施方式

以下实施例所用试剂如下：

(1)含2，4-DNT-3-SA和2，4-DNT-5-SA无机盐固体培养基：2，4-DNT-3-SA0.5g， 2，4-DNT-5-SA 0.5g，NaCl 30g，NH₄NO₃>2PO₄>2>4>

微量元素溶液：CuSO₄>4>4.7H₂O>

(2)LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL。高 压灭菌后备用。

(3)LB固体培养基LB液体培养基中加入18g/L琼脂，高压灭菌后取出倒置平板，凝结后备用。

实施例1：菌株Sphingomonas sp.X4的分离纯化

土壤样品采自甘肃省白银市(东经104°13′43.907″、北纬36°30′44.676″)，装于自封袋中，于4℃保存运回实验室。

富集培养：取污染土壤10g放入装有100mlLB液体培养基的锥形瓶中，在30℃、120rpm 的恒温要床上进行震荡，富集培养24h，

驯化：取1ml上述培养液用涂布棒涂布到含有2，4-DNT-3-SA和2，4-DNT-5-SA的固体 无机盐培养基中，放入恒温培养箱培养7d；

分离纯化：待菌落长出后，观察菌落形态，用无菌接种环从上述固体无机盐培养基中挑 选形态差距大的菌落，采用平板划线分离法接种于LB固体培养基上，置于恒温培养箱中30℃ 倒置培养24h，待菌落长出后挑取单菌落，并以同样的方法接种至LB固体培养基。重复上述 划线分离过程，直至形成形态单一的纯化菌落。

菌悬液制备：将纯化后的菌株接种到LB液体培养基中，于30℃，120rpm中培养24h，并将细胞浓度调整为10⁹CFU/mL备用。

菌株鉴定：提取菌株DNA，并采用通用引物8F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')及1513R(5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行扩增，扩增体系为2.5μL正引物、2.5μ L反引物、45μL双蒸水，50μLsupermix，用纯化的单菌落作DNA模板。扩增条件为96℃ 预变性10min，96℃变性1sec，58℃退火30sec，72℃延伸2min，共35个循环，72℃延 伸5min。16SrRNA扩增后的细菌DNA 样品5μL与6×载样缓冲液1μL混合后，采用1.0％ 的琼脂糖凝胶(5％核酸染料)进行电泳检测，所用的DNA maker为100bp DNALadder(索 莱宝)。电泳条件如下：1×TAE缓冲液，电压100V，电泳时间20min。电泳结束后利用凝 胶成像系统(IsogenProxima 10Phi)成像观察。将扩增产物送往美吉生物进行16SrRNA测序， 将测得的16SrDNA基因序列通过Blast进行相似序列搜索，将菌株的基因序列与Genbank 中的16SrDNA进行比对，利用最相似序列确定其系统发育地位。

实施例2：2,4-二硝基甲苯磺酸盐降解菌株Sphingomonas sp.X4的降解能力测定

取未污染土壤，风干研磨、过1mm筛，备用。称取一定量的2，4-DNT-3-SA和2， 4-DNT-5-SA溶于丙酮中。在通风橱中，向上述土壤中均匀喷洒两种磺酸盐的丙酮溶液，并搅拌均匀。使土壤浓度约为2，4-DNT-3-SA和2，4-DNT-5-SA的浓度各为500mg/kg；在通风 橱中使其自然风干2天。

将一定浓度的菌悬液按照2％的接种量接种至上述土壤中。并添加一定量的无机盐液体培 养基，使水土比维持在0.4。并至于30℃恒温培养箱中培养，每个24h取样，采用高效液相 色谱测定2，4-DNT-3-SA和2，4-DNT-5-SA浓度。降解曲线如附图4所示。由图可知该菌株 对于浓度分别为500mg/kg的两种磺酸盐具有较好的降解效果。对2，4-DNT-3-SA的降解在 第12天达到100％，对2，4-DNT-5-SA的降解率较快在第5天即达到100％。

实施例3：Sphingomonas sp.X4在不同pH值下对磺酸盐的降解效果

取未污染土壤，风干研磨、过1mm筛，备用。称取一定量的2，4-DNT-3-SA和2， 4-DNT-5-SA溶于丙酮中。在通风橱中，向上述土壤中均匀喷洒两种磺酸盐的丙酮溶液，并搅拌均匀。使土壤浓度约为2，4-DNT-3-SA和2，4-DNT-5-SA的浓度各为500mg/kg；在通风 橱中使其自然风干2天。称取上述土壤20g于锥形瓶中，用稀H₂SO₄和NaOH调节土壤的pH>

在不同pH条件下菌株Sphingomonas sp.X4对两种磺酸盐的降解效果如图5所示。由图 5可知，本发明所述菌株pH7-9条件下条件下范围内对500mg/kg的2,4-DNT-3-SA和500mg/kg 的2,4-DNT-5-SA均具有较好的去除效果，中性条件下更有利于Sphingomonassp.X4降解两 种磺酸盐，其中pH7条件下降解效果最佳，5天内对两种磺酸盐的降解率分别为36.39％和 99.68％。

实施例4：Sphingomonas sp.X4在不同温度下对磺酸盐的降解效果

取未污染土壤，风干研磨、过1mm筛，备用。称取一定量的2，4-DNT-3-SA和2， 4-DNT-5-SA溶于丙酮中。在通风橱中，向上述土壤中均匀喷洒两种磺酸盐的丙酮溶液，并搅拌均匀。使土壤浓度约为2，4-DNT-3-SA和2，4-DNT-5-SA的浓度各为500mg/kg；在通风 橱中使其自然风干2天。称取上述土壤20g于锥形瓶中，按照10％的接种量加入OD600＝1的Sphingomonas sp.X4活化的菌液，并用无机盐液体培养基调节水土比为2:5，用透气封口膜封 口。将锥形瓶分别放置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃的恒温培养箱中静置培养一段时间并于5天后取样，测定两种磺酸盐的浓度。

在不同温度下菌株Sphingomonas sp.X4对两种磺酸盐的降解效果如图6所示。由图6可 知，本发明所述菌株在25-35℃范围内对500mg/kg的2,4-DNT-3-SA具有较好的降解效果，在 20-35℃500mg/kg的2,4-DNT-5-SA具有较好的降解效果，30℃条件下降解效果最佳，在5天 内对2,4-DNT-3-SA和2,4-DNT-5-SA的降解率分别达到36.39％和99.68％。当温度较低时应适 当延长修复时间。

实施例5：Sphingomonas sp.X4修复实际污染土壤

在以上实施例的基础上，进一步改进使Sphingomonas sp.X4能够用于修复实际TNT红水污 染土壤，实验具体步骤如下：

(1)菌株Sphingomonas sp.X4的菌悬液制备：挑取菌株X4的单菌落于LB液体培养基中， 放置于摇床中，于30℃，120rpm条件下培养1d。采用发酵罐进行发酵培养，将上述培养的 种子液按5％的接种量接种于LB培养基中，采用空气压缩机进行曝气，搅拌转速为200r/min， 定时取样检测OD600值，生长至对数生长期后备用。

(2)供试土壤：采自白银某地受TNT红水污染土壤，经自然风干，过8目筛(3mm筛)。将土样装入有机玻璃容器中，以10％的接种量开始喷洒上述X4均悬液，并用添加无机盐液体培养基至液土比为2:5。为达到最佳降解效果，将容器用加热保温套包裹，维持温度在30℃。

经过10天的处理后对土壤进行检测，发现对2，4-DNT-3-SA、2，4-DNT-5-SA的降解率 为100％，在修复后的土壤中检测不到相应的污染物。