一种与瓜类褪绿黄化病毒沉默抑制子蛋白互作的蛋白及其应用

摘要

本发明涉及基因工程领域，特别是指一种与瓜类褪绿黄化病毒沉默抑制子蛋白互作的蛋白及其应用。所述蛋白为SKP1，其蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。所述SKP1的基因序列如SEQ ID NO：1所示。所述的与瓜类褪绿黄化病毒沉默抑制子蛋白互作的蛋白作为沉默抑制子P22蛋白的应用，步骤为：根据Skp1基因的全长，设计引物对如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示；构建Skp1基因的重组表达载体；将重组表达载体通过农杆菌转化法转染瓜类植株。该蛋白与P22的互作与P22对GFP的沉默抑制作用直接相关，P22不能与SKP1互作的突变体对GFP的沉默抑制作用显著减弱。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是指一种与瓜类褪绿黄化病毒沉默抑制子蛋白互作的蛋白及其应用。

背景技术

瓜类褪绿黄化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus, CCYV）是近几年发现的长线形病毒科毛形病毒属的新病毒，其基因组由两条正单链RNA组成。自2010年日本首次报道，到目前为止在我国江苏、浙江、上海、山东、北京、海南、广西、河南、河北等13个省市均有发生，且病害发生严重。植物感染CCYV后，通常中下部叶片先感染，新叶无症状。该病毒能系统侵染甜瓜、黄瓜、丝瓜、西瓜、南瓜、本生烟等多种植物。CCYV侵染甜瓜、黄瓜等瓜类后，导致座瓜晚的转色困难，果实品质下降，造成严重的经济损失。

RNA沉默(RNA silencing)是植物抵抗病毒侵染的有效机制，然而，几乎所有的植物病毒都能编码RNA沉默抑制子(viral suppressors of RNA silencing, VSR)来确保它们能够顺利地在植物体内复制并系统扩散。病毒编码的沉默抑制子蛋白是病毒侵染致病的关键蛋白，研究与其互作的寄主因子将有助于阐明病毒的致病机制，我们在前期研究中鉴定了CCYV P22蛋白是一种沉默抑制子，通过筛选与其互作的寄主因子获得了黄瓜泛素途径相关蛋白SKP1（S-Phase Kinase-Associated Protein 1），泛素（ubiquitin，Ub）由76个氨基酸组成，在真核生物中高度保守，泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin proteasome system，UPS）是真核细胞内蛋白质降解的主要信号通路，主要由泛素活化酶（ubiquitin-activation enzyme，E1）、泛素结合酶（uniquitin-conjugating enzyme，E2）、泛素连接酶（ubiquitin protein ligase，E3）和26S蛋白酶体组成。其中E3是一个庞大的蛋白家族，已经发现的E3有多种，其中SKP1-CμLlin-F-box（SCF）复合体在植物中的功能最为重要，SCF复合体由四个亚基组成，其中SKP1、CμLin和Ring-box 1（RBX1）这3个亚基组成一个一般性骨架，通过与不同的F-box蛋白结合而识别不同的底物，目前已鉴定了超过700种的F-box蛋白。

目前互作研究越来越多，互作研究方法也越来越多。常用的方法包括酵母双杂交，双分子荧光互补，免疫共沉淀GST pμLl-down，荧光共振能量转移(FRET )，表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)等。本发明所涉及的酵母双杂交和双分子荧光互作技术是互作研究中最为常用的两项技术。

发明内容

本发明提出一种与瓜类褪绿黄化病毒沉默抑制子蛋白互作的蛋白及其应用，为解决现有技术中瓜类褪绿黄化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus, CCYV）侵染多种农作物造成果实品质下降，经济损失的技术问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种与瓜类褪绿黄化病毒沉默抑制子蛋白互作的蛋白作为沉默抑制子P22蛋白的应用。

所述蛋白为SKP1，其蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。

所述SKP1的基因序列如SEQ ID NO：1所示。

所述的与瓜类褪绿黄化病毒沉默抑制子蛋白互作的蛋白作为沉默抑制子P22蛋白的应用，步骤为：

（1）根据Skp1基因的全长，设计引物对如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示；

（2）构建Skp1基因的重组表达载体；

（3）将步骤（2）中的重组表达载体通过农杆菌转化法转染瓜类植株。

本技术方案能产生的有益效果在于：

1、本申请通过Skp1与P22双分子荧光互补法，验证了两者互做对其沉默抑制子活性的影响。

2、本申请以寻找影响P22与Skp1的互作的点突变为突破点，发现两者的互作对其沉默抑制子活性是必要条件，本申请中首次鉴定了瓜类Skp1蛋白能够与病毒沉默抑制子蛋白互作，从而影响其沉默抑制功能，有利于后续利用基因编辑技术进行抗病毒调控。

附图说明

图1为黄瓜SKP1基因全长阅读框的扩增。

图2为为酵母共转验证沉默抑制子P22基因与Skp1基因的互作。

图3为BIFC法验证沉默抑制子P22基因与Skp1基因的互作。

图4为P22与SKP1互作对GFP沉默的影响；P19为pGDP19+pGDGFP，P22为pGDP22+pGDGFP，53A为pGDP22_53a+pGDGFP。

图5 为pGBKT7-P22质粒酶切验证图。

图6 为pGADT7-Skp1PCR验证图。

具体实施方式

对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1：黄瓜Skp1（S-phase kinase-associated protein 1）基因的克隆。

一、黄瓜总RNA的提取

（1）取0.2g新鲜的黄瓜叶片，于液氮中研磨至粉末状，移入1.5mL的离心管中，同时加入1mL trizol与离心管中，震荡混匀，室温静置5min。

（2）12000g，4℃离心10 min，将上清液转移至新的1.5mL离心管中。

（3）加入200μL的氯仿，震荡混匀，室温静置5min。

（4）12000g，4℃离心15 min，将上清液转移至新的1.5mL离心管中。加入500μL异丙醇，室温静置10min。

（5）12000g，4℃离心10 min，弃上清，用75％乙醇清洗沉淀。

（5）7500g，4℃离心5 min，弃上清。

（7）重复步骤（5）（6）。

（8）室温干燥5min，加入30μL的DEPC处理水溶解RNA，保存于-80℃冰箱。

二、RT-PCR扩增Skp1基因

Skp1基因的第一条链cDNA的合成

取1个1.5mL离心管，依次加入下列组分：

42℃水浴1h。

Skp1基因全长阅读框的PCR扩增

以上述第一条链cDNA为模板，PCR扩增Skp1基因。PCR反应体系为：cDNA 1μL，正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，DNA聚合酶 25μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃ 30s，56℃30 s，72℃ 40 s，35个循环；72℃ 10 min。所得的PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条与预期大小一致的条带，468bp。经Axygen的PCR清洁试剂盒纯化回收，得到一条单一的条带，如图1所示。

引物序列为：正向引物GACGGATCCATGTCCTCCTCCAACAAAAT，反向引物GATCTCGAGTCATTCACAAGCCCACTGAT。

实施例2：酵母双杂交方法验证黄瓜Skp1蛋白与病毒CCYV的P22蛋白的互作

一、Skp1基因的酵母表达载体的构建

将上述的PCR产物用BamHI和XhoI进行双酶切，与经同样双酶切的猎物质粒PGADT7用T4DNA连接酶连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，菌落PCR验证阳性克隆。验证正确的提质粒并送测序，得到重组质粒PGADT7-Skp1。

二、PGBKT7-P22载体的构建

利用正向引物和反向引物扩增p22的全长阅读框，引物序列为：正向引物 GGAATTCCATATGATGAATAATCGTAAATTTTTC，反向引物CCTGGATCCTTATATTACGAACTTATTAAG ，构建p22基因的酵母表达载体，然后用BamHI和NdeI进行双酶切，与经同样双酶切的猎物质粒PGBKT7用T4DNA连接酶连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，菌落PCR验证阳性克隆。验证正确的提质粒并送测序，得到重组质粒PGBKT7-P22。

三、Skp1蛋白与P22蛋白的互作验证

用LiAc介导重组质粒PGBKT7-P22和 PGADT7-Skp1转化进入Y2H Gold酵母菌株内，具体操作根据Clontech酵母手册进行。将菌液涂布与-Trp和-Leu的缺陷型平板上，长出单菌落后再划线到-Trp、-Leu、-His和-Aba缺陷型平板上，观察菌落生长情况。结果如图2，阳性对照以及Skp1与P22共转的菌落变蓝，可以得出两者之间互作。

实施例3：双分子荧光互补法（BIFC）体内验证黄瓜Skp1蛋白与病毒CCYV的P22蛋白的互作

一、Skp1与P22双分子荧光互补法的载体构建

（1）以实施例1中的cDNA为模板，PCR扩增Skp1基因，PCR产物经BamHI和XhoI双酶切，连接到同样双酶切的pSPYCE-35S载体上，测序验证正确，得到YC-Skp1重组质粒。

引物序列为：正向引物ACAGGATCCATGTCCTCCTCCAACAAAAT，反向引物ATCCTCGAGTTCACAAGCCCACTGATT。

（2）以实验室保存的PGBKT7-P22质粒为模板，PCR扩增病毒P22基因。P22的pcr产物经BamHI和SmaI双酶切，连接到同样双酶切的pSPYNE-35S载体上，测序验证正确，得到YN-P22重组质粒。

引物序列为：正向引物CGCGGATCCATGAATAATCGTAAATTTTTC，反向引物AGTCCCGGGTATTACGAACTTATTAAG。

二、农杆菌共浸润本生烟验证Skp1与P22的互作

将上述重组质粒YC-Skp1和YN-P22分别转化农杆菌GV3101，并将验证正确的农杆菌进行摇菌至OD600为1.6，离心收集菌体，并用MMA缓冲液(10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L MES，100 μmol/L Acetosyringone）重悬，室温静置2-4h。等体积混合YC-Skp1和YN-P22的菌液，并以YC-Skp1与pSPYNE-35S、YN-P22与pSPYCE-35S为对照浸润本生烟叶片。2天后在激光共聚焦显微镜下观察叶片组织。结果如图3所示，可以明显在细胞核质中观察到荧光，可以得出Skp1与P22互作。

实施例4：P22与SKP1互作对GFP沉默的影响

一、 pGDP22及P2253A突变体的构建

以实验室保存的PGBKT7-P22质粒为模板，PCR扩增病毒P22基因，利用限制性内切酶SalI和BamHI构建P22的pGD重组载体，引物序列为：正向引物CGCGTCGACGATGAATAATCGTAAATTTTTC，反向引物 GGTGGATCCTTATATTACGAACTTAT，通过overlapPCR的方式将P22的53位氨基酸突变为丙氨酸，构建策略同转化农杆菌菌株GV3101，引物序列为：正向引物CGACCACAGGAACTATGCGAAGCTTTTGATCATAAT，反向引物 ATTATGATCAAAAGCTTCGCATAGTTCCTGTGGTCG。

二 、农杆菌共浸润确定沉默抑制子活性

将其与pGDGFP共浸润4周大小的本生烟，4d后观察GFP荧光，采集叶片进行Northernblot检测GFPmRNA和siRNA水平，确认P22与SKP1的互作对沉默抑制的影响。结果如图4，P22本身具有沉默抑制子活性，与P19一致，而不能与Skp1互作的突变体GFP的荧光明显减弱，说明与Skp1的互作影响了P22的沉默抑制子活性，mRNA和Northern blot结果也进一步证明了沉默抑制子活性的减弱。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110> 河南农业大学

<120>一种与瓜类褪绿黄化病毒沉默抑制子蛋白互作的蛋白及其应用

<160> 4

<210> 1

<211> 468

<212> DNA

<213> 葫芦科(Cucurbitaceae)

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(468)

<400> 1

atgtcctcct ccaacaaaat cactctcaag agctccgatg gcgactattt ccaagtcgac60

gatgccgttg ccctccaatc tcagaccatc cgccatatga tcgaagacaa ctgcgcccat 120

aacggcatcc ctcttcccaa cgtcaacagt aaaattctcg ccaaagtcat ccagtactgc 180

cgtaaacacg ttgatgcttc ctccgccgat cccctcccct ccgaagacga tctcaagacc 240

tgggatcgtg actttgttaa tgtcgatcag gctactcttt tcgatctcat tctggctgca 300

aattatctgg acgtcaagag cttgttagac ctgacatgtc agactgtagc tgacatgatc 360

aagggaaaga agccggagga gattcgaaaa accttcaaca tcaagaacga cttcacacca 420

gcggaagagg aggaagttcg cagggagaat cagtgggctt gtgaatga468

<210> 2

<211> 155

<212> PRT

<213> 葫芦科(Cucurbitaceae)

<400> 2

Met Ser Ser Ser Asn Lys Ile Thr Leu Lys Ser Ser Asp Gly Asp Tyr

1 5 1015

Phe Gln Val Asp Asp Ala Val Ala Leu Gln Ser Gln Thr Ile Arg His

202530

Met Ile Glu Asp Asn Cys Ala His Asn Gly Ile Pro Leu Pro Asn Val

354045

Asn Ser Lys Ile Leu Ala Lys Val Ile Gln Tyr Cys Arg Lys His Val

505560

Asp Ala Ser Ser Ala Asp Pro Leu Pro Ser Glu Asp Asp Leu Lys Thr

65707580

Trp Asp Arg Asp Phe Val Asn Val Asp Gln Ala Thr Leu Phe Asp Leu

859095

Ile Leu Ala Ala Asn Tyr Leu Asp Val Lys Ser Leu Leu Asp Leu Thr

100 105 110

Cys Gln Thr Val Ala Asp Met Ile Lys Gly Lys Lys Pro Glu Glu Ile

115 120 125

Arg Lys Thr Phe Asn Ile Lys Asn Asp Phe Thr Pro Ala Glu Glu Glu

130 135 140

Glu Val Arg Arg Glu Asn Gln Trp Ala Cys Glu

145 150 155

<210> 3

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<400>3

acaggatcca tgtcctcctc caacaaaat29

<210> 4

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

gatctcgagt cattcacaag cccactgat29