二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B及其应用

摘要

本发明涉及分子生物学、基因工程以及蛋白工程领域。具体而言，本发明公开了一种二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2所述。本发明还同时公开了编码上述二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所述；或者与SEQ ID NO：1中的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者其核苷酸序列能在40～55℃条件下与SEQ ID NO：1中的核苷酸序列杂交。本发明的蛋白能用于调控寄主二化螟幼虫血细胞的包囊反应。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学、基因工程以及蛋白工程领域。特别是一种二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B及应用。

背景技术

农业害虫是农业增产和农产品质量提高的重要制约因素，据统计，我国每年因病虫害损失的粮食近500亿斤，经济作物损失达350多亿斤。长久以来，化学农药的大量不合理使用导致农药残留、害虫抗性以及再猖獗等问题。自20世纪90年代中期以来，抗虫转基因作物培育与应用取得成功，害虫防治迎来新的契机。据统计，全球转基因种植面积由1996年的约170万公顷猛增到2014年的1.8亿公顷(其中抗虫的占43％)，产生了明显的经济与生态效应。然而，长期单一种植Bt基因抗虫作物，靶标害虫的抗性问题也日益浮现。

因此，科研工作者也致力于从微生物、植物和动物中挖掘新型杀虫蛋白/肽基因，通过多基因或融合基因等手段，培育新型抗虫转基因作物，以其解决上述农药和Bt作物带来的问题。寄生蜂是一类重要的天敌昆虫，有着重要的生防价值。寄生蜂携带多种寄生因子，包括毒液(venom)、卵巢分泌蛋白(ovarian fluids)、多分DNA病毒(polydnavirus)、类病毒颗粒(virus-like particle)、畸形细胞(teratocyte)等。这些寄生因子可以调节寄主免疫反应、生长发育等生理活动。对于寄生蜂寄生因子的研究可以服务生产，开辟害虫生物防治的新途径。例如藏红足侧沟茧蜂(Microplitis croceipes)畸形细胞的分泌蛋白基因转入烟草，可提高植株对烟草天蛾(Manduca sexta)的抗性等。

二化螟Chilo suppressalis，属鳞翅目草螟科(Lepidoptera:Crambidae)，是我国水稻上的重要钻蛀性害虫之一，可造成水稻枯心和白穗等。该虫分布广，适应性强。中国稻螟年发生面积1500万公顷以上，总经济损失约115亿元。二化螟盘绒茧蜂(Cotesiachilonis)属膜翅目茧蜂科(Hymenoptera:Braconidae)，主要分布于中国的贵州、江苏、浙江、江西、湖南、四川、福建、广东、广西、云南和台湾等地，也分布于印度尼西亚、日本和朝鲜等亚洲国家。该蜂是二化螟幼虫期优势多寄生性的内寄生蜂，例如在江苏越冬代寄生率可达90％，水稻生长期其寄生率为10％-30％，该寄生蜂的寄生因子包括毒液、卵巢分泌蛋白和畸形细胞，对其寄生因子具体组分的研究和挖掘具有重要的生产实践意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种对常见农业害虫具有免疫调控作用(调控寄主血细胞包囊)的二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白基因Crp32B及其编码的蛋白质和用途。

为解决技术问题，本发明提供了一种二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述。

作为本发明的二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B的改进：二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B为该蛋白、其保守性变异蛋白、其活性片段或其活性衍生物。

本发明还同时提供了编码上述二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1中的；或者与SEQ ID NO.1中的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者其核苷酸序列能在40～55℃条件下与SEQ ID NO.1中的核苷酸序列杂交。

作为本发明的基因的改进：序列中包含SEQ ID NO.1中8～66个连续核苷酸。

本发明还同时提供了上述二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B的用途：该蛋白可以调控寄主二化螟血细胞对外物的包囊反应。

本发明所提供的二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白及编码它的核酸序列，使其能够应用其氨基酸序列、编码序列及其在开发成有应用价值的抗虫作物和生物农药并应用于农业害虫防治等多个领域。

本发明具体是通过以下技术方案实现的：本发明利用二化螟盘绒茧蜂卵巢转录组测序获得了Crp32B基因全部序列，对提取的二化螟盘绒茧蜂卵巢的RNA进行反转录得到cDNA，进行分子克隆、原核表达和非变性条件下纯化，原核表达的Crp32B都能够调控农业害虫二化螟幼虫血细胞对外物的包囊反应。

本发明所分离出的DNA分子包括：编码具有二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B及其编码基因的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO：1中的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40～55℃条件下与SEQ ID NO.1中的核苷酸序列杂交。较佳的，所述的序列编码具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO：1中的核苷酸序列。

本发明分离出的二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B及其编码基因包括：具有SEQ IDNO：2氨基酸序列的蛋白、或其保守性变异蛋白、或其活性片段，或者其活性衍生物。较佳地，该蛋白是具有SEQ ID NO：2序列的蛋白。

本发明DNA分子包含所述的DNA分子中8-66个连续核苷酸。

本发明DNA分子转化的宿主细胞是大肠杆菌。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA片段已经与天然状态下伴随核苷酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B及其编码基因编码的核酸序列指：编码具有二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B及其编码基因活性的蛋白的核苷酸序列，如SEQID NO：1中的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，SEQ ID NO：1序列中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子取代后产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO：1中的核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO：1所述的序列。

还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO：1中的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还包括与SEQ ID NO：1中的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。还包括能编码具有天然的二化螟盘绒卵巢蛋白Crp32B相同功能的蛋白的SEQ ID NO.1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本发明中二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B蛋白指：具有二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B及其编码基因活性的SEQ ID NO：2序列的蛋白。该术语还包括具有与天然二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B及其编码基因相同功能的SEQ ID NO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入/或取代，以及在C末端和/或N端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地以5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B及其编码基因的活性片段和活性衍生物。

在本发明中二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B及其编码基因保守性变异蛋白指：与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成蛋白。

本发明还包括二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B及其编码基因或蛋白的类似物。这些类似物与天然Crp32B蛋白酶抑制剂的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可以通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L－氨基酸的残基(如D氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ－氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述列举的代表性的蛋白。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B及其编码基因蛋白时，可以将二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B及其编码基因编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B及其编码基因表达载体。

如本发明所述的“可操作地连于”指这样一种情况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与蛋白的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于蛋白DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能够翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中宿主细胞为原核细胞。常用的原核宿主细胞指得是大肠杆菌细胞。

还可用Northern印迹法技术或荧光定量PCR分析二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B及其编码基因基因产物的表达，即分析二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B及其编码基因的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

此外，本发明中可用作探针的核酸分子，该分子通常具有二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B及其编码基因核苷酸编码序列的8-66个连续氨基酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B及其编码基因的核酸分子。

本发明涉及检测样品中是否存在二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B及其编码基因核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B及其编码基因核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。

此外，根据本发明的二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B及其编码基因核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B及其编码基因同源基因或同源蛋白。

本发明的二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B及其编码基因核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得到有关序列。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。利用本发明的二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B及其编码基因，通过各种常规筛选方法，可筛选出二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B及其编码基因发生相互作用的物质，或者受体等。

本发明能够调控水稻重要害虫二化螟的细胞免疫反应(血细胞的包囊反应)。我国农业害虫危害非常严重，使用化学农药的负面影响很大，本发明的二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B及其编码基因正是对农业害虫有免疫调控作用的新蛋白，因此，具有很大的应用价值。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为本发明的卵巢蛋白Crp32B在原核表达中的分离纯化图；

注：M为标准蛋白；

A图为12％聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，B图为免疫印迹试验(WesternBlot)，其中1和6道：未诱导的大肠杆菌Transetta(DE3)；2和7道：IPTG诱导的大肠杆菌Transetta(DE3)；3和8道：IPTG诱导的大肠杆菌Transetta(DE3)裂解液上清；4和9道：IPTG诱导的大肠杆菌Transetta(DE3)裂解液沉淀；5和10道：纯化的Crp32B蛋白。抗体为兔产抗重组表达的Crp32B蛋白的抗体。

图2为原核表达的Crp32B蛋白对二化螟幼虫血细胞包囊树脂镍珠的影响；

注：PBS为磷酸盐缓冲液，“Crp32B_{50/100/200ng/μl}”代表注射之前镍珠与浓度为50/100/200ng/μl的Crp32B蛋白溶液孵育过，Crp32B_{200ng/μl+抗体}”代表注射之前镍珠与浓度为200ng/μl的Crp32B蛋白溶液孵育后，又与其抗体进行了孵育，“抗体”为Crp32B的多克隆抗体。NS表示没有显著差异，差异显著性(***,P<0.001)。

具体实施方式

下面结合实验室具体的试验数据，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：重组的Crp32B的表达和纯化

1.1 RNA的提取

在Leica MZ 16A显微镜(Leica,Germany)下，将雌蜂用75％酒精消毒并擦拭干净，将其生殖道从腹部末端扯出，浸泡在载玻片上无菌的含1unit/μL RNA酶抑制剂(TOYOBO,Osaka,Japan)的磷酸盐缓冲液(PBS)液滴中，收集卵巢于TRIzol试剂中(Invitrogen,California,USA)，RNA提取方法如下：

1)收集的卵巢，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min。

2)向离心管中加入0.2ml氯仿，振荡15s，混合液转入TIANGEN离心管中，静置2min。

3)4℃，12000g离心15min，取上清液，将其转入一新1.5ml的离心管中。

4)向离心管中加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。

5)4℃，12000g离心10min，弃掉上清液。

6)向离心管中加入1ml 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃，7500g离心5min，弃掉上清液；(此时加入无水乙醇，可于-80℃超低温冰箱中长期保存)。

7)晾干离心管，加入适量的无RNA酶水溶解(65℃促溶)，分光光度计测量OD260/OD280的值，比值在1.8～2.0之间时，进行下一步实验。

1.2 cDNA第一链合成

采用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(Transgen,Beijing,China)试剂盒将1μg RNA 反转录成单链cDNA模板，体系如下：

总mRNA：1μg

寡聚胸腺嘧啶核苷引物(Oligo(dT)n)：0.5μl

随机引物：0.5μl

2×TS Reaction Mix：10μl

TransScript RT/RI Enzyme Mix:1μl

gDNA Remover:1μl

Rnase-free Water:to 20μl

配好体系之后，25℃孵育10分钟后，在42℃孵育1h，最后85℃加热5分钟。

所得的cDNA的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所述。

1.3重组蛋白的表达和纯化

通过Premier primer 5设计原核表达引物(前引物5’-3’：ATGGGTCGCGGATCCATGGATCAGAGGATAACATGG；后引物5’-3’：GTGGTGGTGCTCGAGTTAAGATTTCTTTGGCACATTGG)。以上述合成的cDNA作为模板，PCR体系如下：

cDNA：1μl

Forward primer(10μM)：2μl

Reverse primer(10μM)：2μl

2×TransStar FastPfu PCR SuperMix：25μl

ddH₂O：20μl

Total volume：50μl

PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸10min。

配制1％琼脂糖凝胶，PCR产物经电泳验证片段大小后，用Axygen Gel ExtractionKit凝胶回收试剂盒进行切胶回收。

通过ClonExpress One Step Cloning Kit(Vazyme,China)将PCR扩增获得的目的片段与线性化(酶切位点：BamHI和XhoI)的pET-28a(+)载体同源重组。

同源重组体系为：

5×CE II Buffer：4μl

线性化克隆载体(线性化的pET-28a(+)载体)：1μl

插入片段扩增产物：2μl

Exnase^TM>

反应条件为：37℃反应30分钟，待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却15分钟，直接进行转化或者存储于-20℃待用。

将重组的pET-28a(+)质粒转化进Trans5αChemically Competent Cell(TransGen,Beijing,China)并通过菌落PCR和DNA测序确定阳性菌落，测序由上海博尚生物技术有限公司完成。将阳性克隆转化进大肠杆菌Transetta(DE3)Chemically CompetentCell(TransGen,Beijing,China)中，并测序验证。使用Isopropyl-D-thiogalactoside(IPTG)(0.5mM)在37℃条件下诱导表达5小时，未经IPTG诱导的大肠杆菌Transetta(DE3)同样在37℃条件下培养5小时，作为对照。4℃,5000g离心15分钟收集大肠杆菌并通过Master Mix(Novagen,MA,USA)进行裂解。收集裂解液于1.5ml离心管中，4℃下,12,000g离心20分钟。将该IPTG诱导的大肠杆菌Transetta(DE3)的裂解液上清和沉淀分别收集并且制样，用于SDS-PAGE和Western Blot的分析。其中，上清通过cOmplete His-TagPurification Resin(Roche,Indianapolis,IN,USA)和Ni-NTA Buffer Kit(Novagen,MA,USA)进行目的蛋白的纯化。纯化后的目的蛋白Crp32B同样用于后续的SDS-PAGE和WesternBlot的分析。最后，4℃条件下，使用G2Dialysis Device(SpectrumLaboratories,USA)在PBS缓冲液(pH＝7.4)中对纯化后的可溶蛋白进行3次透析。蛋白浓度采用Bradford法通过Bradford Protein Assay Kit Bradford(Sangon Biotech,Shanghai,China)测定。透析后的Crp32B蛋白交由金斯瑞生物科技有限公司作为抗原，制作多克隆抗体。首先用生理盐水稀释免疫原，然后与福氏佐剂等量混合，进行兔子皮下多点注射。之后的第8和15天分别注射1ml和2ml，末次注射7天后颈动脉取血，室温过夜析出血清，制成多克隆抗体。其他纯化的经过透析的Crp32B蛋白可以用于本实验相关功能的研究。

所得的二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2所述。

还原型SDS-PAGE采用Mini-ProteinⅢ电泳槽和Model3000Xi变压器(Bio-rad,Hercules,CA,USA)进行，分离胶和浓缩胶浓度分别为5％和12％。Coomassie BrilliantBlue R-250(Bio-rad,Hercules,CA,USA)染色15分钟后用考马斯亮蓝脱色液进行脱色。采用GS-800^TMCalibrated>

Western Blot中，蛋白样品经12％SDS-PAGE后，通过Mini-Protean TetraElectrophoresis System(Bio-rad,Hercules,CA,USA)湿转至硝酸纤维膜(Sigma,St.Louis,MO,USA)。一抗稀释5000倍，二抗采用5000倍稀释的羊抗兔IgG(H+L)(HuaAnBiotechnology,Hangzhou,China)。最后通过TMB Stabilized Substrate for HRP(Promega,Madison,WI,USA)进行显色，GS-800^TMCalibrated>

所得结果如图1所述，由图1可知，纯化的目的蛋白Crp32B条带单一，并且能被其抗体特异性识别，可以用于后续的功能研究。

实施例2：重组的Crp32B保护树脂镍珠免受寄主血细胞包囊的测定

重组蛋白的Crp32B用PBS稀释至待测浓度(即，50ng/μl、100ng/μl、200ng/μl)，在10μl的上述不同稀释液中加入约100个镍离子螯合纯化树脂珠子(Roche,Indianapolis,IN,USA)，并在4℃下孵育过夜。对于有抗体加入的处理组，在重组Crp32B与珠子孵育之后，用PBS清洗珠子3遍，再用20μl的Crp32B抗体(1:500稀释)在4℃条件下与100个镍珠孵育过夜。未用任何蛋白(PBS)以及用Crp32B抗体(1:500)和绿色荧光蛋白(浓度为200ng/μl)孵育的镍珠作为对照。最后将孵育好的珠子用PBS清洗3遍，悬浮于2μl的PBS中，进行注射实验，每头二化螟幼虫注射20-30颗珠子，注射后2小时进行解剖观察。

为了比较包囊情况，我们按照珠子的包囊厚度分成6级(0-5级)：0、未包囊；1、珠子外包囊的血细胞少于50个；2，珠子外包囊血细胞个数在50个到一层厚度之间；3、珠子外包囊的血细胞厚度多于一层但是少于珠子半径的一半；4、珠子外包囊的血细胞厚度大于珠子半径的一半但是少于珠子半径；5、珠子外包囊的血细胞厚度大于珠子本身半径。包囊程度通过包囊指数进行衡量，计算方法是：包囊指数＝【∑(级数×该级珠子个数)/(所有珠子个数×6)】×100。

两样本间比较采用Student’s t-test，使用Data Processing System(DPS)package(Version 9.5)进行运算分析。所得结果如图2所述；根据图2可得知：重组表达的Crp32B能够减少Ni离子树脂珠子被寄主血细胞包囊，并且有剂量效应。Crp32B的抗体掩盖掉重组表达的Crp32B之后，珠子被寄主血细胞重新包囊。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 二化螟盘绒茧蜂卵巢蛋白Crp32B及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 756

<212> DNA

<213> 二化螟盘绒茧蜂(Cotesia chilonis)

<400> 1

atggatcaga ggataacatg gagtctaata attgcgggcg tgatcgttat tgcaggcgct 60

gcgatttggg gtttatggta cctgttaaaa gaaaatcaag gcccagaaat gaaaaagaag 120

ctgaagaagg aacttaatga gatcgttgag aatgcttcag ttaatgcact ggatgcattc 180

atttctcaaa aatcaaaagc gtttatagaa gacacagcag cactcggtca agtgaaaacc 240

gacgcagtaa taacgcttac agataccgaa ttagctgcaa gaaaagccgc attactgacg 300

acttatacat cgactgataa cgctaaaatt aatagtgttg ttgttacagc tgccagtgat 360

tgcctaacaa ctgctcaaaa aaaaattgat gccgcgatag aaaaagaagc gaaggaaatc 420

attaaaaatt taatatcgaa aaaaattaag gataaggcaa gtagtctatg tgaaaaagag 480

gcaaaatctg ctacagacaa agacgtttat aatcttgttg aacatggatc aaatgatgaa 540

aacactgcca aggataaaat caaagaaaaa gctcaacaag aagctatgaa aaaagtggaa 600

gcgattatca ataatgacca gtggcttatt attaaaaccg ccgtccaaac tgaaggtaag 660

gaagctctaa aaaaaaattt aaccgaaatt ataaaaaaaa acgatttgat cgacgaaact 720

atccttacaa tagccaatgt gccaaagaaa tcttaa 756

<210> 3

<211> 251

<212> PRT

<213> 二化螟盘绒茧蜂(Cotesia chilonis)

<400> 3

Met Asp Gln Arg Ile Thr Trp Ser Leu Ile Ile Ala Gly Val Ile Val

1 5 1015

Ile Ala Gly Ala Ala Ile Trp Gly Leu Trp Tyr Leu Leu Lys Glu Asn

202530

Gln Gly Pro Glu Met Lys Lys Lys Leu Lys Lys Glu Leu Asn Glu Ile

354045

Val Glu Asn Ala Ser Val Asn Ala Leu Asp Ala Phe Ile Ser Gln Lys

505560

Ser Lys Ala Phe Ile Glu Asp Thr Ala Ala Leu Gly Gln Val Lys Thr

65707580

Asp Ala Val Ile Thr Leu Thr Asp Thr Glu Leu Ala Ala Arg Lys Ala

859095

Ala Leu Leu Thr Thr Tyr Thr Ser Thr Asp Asn Ala Lys Ile Asn Ser

100 105 110

Val Val Val Thr Ala Ala Ser Asp Cys Leu Thr Thr Ala Gln Lys Lys

115 120 125

Ile Asp Ala Ala Ile Glu Lys Glu Ala Lys Glu Ile Ile Lys Asn Leu

130 135 140

Ile Ser Lys Lys Ile Lys Asp Lys Ala Ser Ser Leu Cys Glu Lys Glu

145 150 155 160

Ala Lys Ser Ala Thr Asp Lys Asp Val Tyr Asn Leu Val Glu His Gly

165 170 175

Ser Asn Asp Glu Asn Thr Ala Lys Asp Lys Ile Lys Glu Lys Ala Gln

180 185 190

Gln Glu Ala Met Lys Lys Val Glu Ala Ile Ile Asn Asn Asp Gln Trp

195 200 205

Leu Ile Ile Lys Thr Ala Val Gln Thr Glu Gly Lys Glu Ala Leu Lys

210 215 220

Lys Asn Leu Thr Glu Ile Ile Lys Lys Asn Asp Leu Ile Asp Glu Thr

225 230 235 240

Ile Leu Thr Ile Ala Asn Val Pro Lys Lys Ser

245 250