可增强骨结合的骨组织工程支架材料人工牙根的制备方法

摘要

本发明提供了一种骨组织工程支架材料人工牙根的制备方法，包括钢模的制备、人工牙根初胚的制备、加工孔隙、孔隙填充PLLA/nHA复合物、喷涂PGA/nHA复合物涂层、表面降解处理等六个步骤，其采用PEEK与HA晶须复合材料作为骨组织工程支架材料来制作人工牙根的初胚，并在初胚相应的位置加工孔隙并填充可降解的PLLA/nHA活性复合材料，然后再喷涂PGA/nHA生物活性涂层，经表面降解处理后，即可得到一种可增强骨结合能力的骨组织工程支架材料人工牙根。本方法制备的人工牙根是通过骨诱导细胞对骨的自我修复来达到与骨结合，其弹性模量与牙槽骨更匹配，所以不容易造成牙槽骨的骨质吸收，大大优于常规人工牙根。

说明书

技术领域

本发明涉及一种人工牙根的制备方法，具体是一种可增强骨结合的骨组织工程支架材料人工牙根的制备方法，属于牙科医用材料的制备工艺技术领域。

背景技术

骨组织工程是一门利用细胞生物学和工程原理来研究开发修复和改善骨损伤组织形态和功能的生物替代物的科学，牙根也属于一种坚韧的骨组织，拔牙会使骨组织受到极大的骨损伤，牙根的形态和功能如何用生物替代材料来替代它，而且让它与牙槽骨结合更稳定，是骨组织工程支架材料人工牙根重点研究方向。现在全世界都用生物相容性较好的金属钛来替代缺失的牙根以行使牙功能，根据广东省口腔医院、南京市口腔医院、南京医科大口腔医院及南方医科大学口腔医院的研究报告资料表明：①钛颗粒可促进破骨细胞的骨吸收功能；②钛颗粒可促使更多破骨细胞的产生，使种植体周围骨吸收。

然而关于氧化钛（TiO₂）的毒性问题，国内外有不同的研究单位得出相反的结果，主要是纳米级TiO₂颗粒被吞噬进破骨细胞内，又密集在细胞核周围，会因范德华力形成更长的聚合物，影响到生物效应和理化性质变化。南京医科大与山东省高等学校动物试验结果表明：TiO₂颗粒会引起骨细胞活动下降，同时诱导细胞凋亡。重庆大学生物工程学院蔡开勇等研究结果表明：①大尺度TiO₂颗粒严重破坏MSCS细胞膜的完整性；②不同纳米颗粒诱发过量的活性氧以及产生氧化应力，进而破坏细胞的线粒体加速了细胞的凋亡；③纳米颗粒比微粒毒性大，在鼠的气管内滴泣同样剂量的纳米TiO₂（20nm）和微米颗粒TiO₂（250nm）后发现，纳米TiO₂可诱发较严重的中性粒细胞反应。参考国外资料可以发现：①Wang等研究纳米TiO₂给小鼠口服会引发心脏炎症反应，纳米颗粒蓄积在肝脏中，导致肝小叶坏死；②SaKai研究发现纳米TiO₂会造成DNA损伤，细胞凋亡；③Hoyt研究认为一旦纳米TiO₂颗粒被人类或其它生物通过呼吸吸入，当体内布朗运动超过一定量时，有可能摧毁人类的防御系统。另外，钛基人工牙根周围骨质吸收是一个复杂问题，除了钛的毒性影响，钛金属弹性模量太高105Gpa，而骨的弹性模量只有19-21Gpa，两者相差太大，容易产生遮挡现象，造成骨质吸收，还有口腔卫生问题等，也是引起骨质吸收的原因之一。

聚醚醚酮（PEEK）是一种韧性和刚性兼备并取得良好平衡的塑料，特别是它对交变应力的优良耐疲劳性是所有塑料中最出众的，可与合金材料媲美。医用级PEEK材料具有很好的生物相容性、无细胞毒性、无诱变性、无致癌性，不引起过敏，还具有极强的耐腐蚀、耐水解和耐化学性，而且具有良好的机械性能，是目前最有前途的人工骨材料。纯PEEK材料的耐冲击性能良好，其无缺口冲击强度可达200kg·cm/cm以上，且耐沸水性能极佳，在沸水中连续浸泡200天强度基本不变，可以在200℃的高压蒸气中长期使用，PEEK还具有自润性以及特好的耐磨性和韧性，其耐冲击强度高达70-90J/m，弯曲强度为140MPa线，膨胀系数小，尺寸稳定，其杨氏模量为3.85±0.72GPa，医疗领域所用的PEEK是经美国FDA认证的最佳长期骨移植材料，其玻璃化温度为145℃，熔化温度为334℃。通过调整补强材料的加入比例，PEEK复合材料的杨氏模量可调节到18-19GPa，和人体骨骼的杨氏模量最为接近，其作为植入骨可以和健康骨长久并存，骨骼不会发生疏松退化。

晶须是一种以单晶形式生长成的针状微晶体，其强度接近于完整晶体的理论值，具有高强度、高弹性模量、高硬度的特点，对于同一物质，晶须的力学强度要比多晶大1000倍，而且晶须能像纤维一样依靠桥接、裂纹偏转和拨出效应吸收能量。由于晶须的强度远高于其他短纤维，因此其主要用作复合材料的增强体，增强金属、陶瓷树脂及玻璃等复合材料，应用最多的是航空航天领域和汽车工业。钢质类、陶瓷类复合材料所用的羟基磷灰石（HA）晶须的合成方法主要采用高温高压法、烧结熔融法或电解气相沉积法，这些方法用于制备医用HA晶须极少，因为在1200℃高温下，HA的活性羟基开始丧失，到1350℃时，HA就变成了氧化磷酸钙，而且这些方法工艺复杂，成本太高，医用量每次数量太小，加之医用晶须还有特殊要求，如制备有生物活性羟基磷灰石晶须或制备参钡晶须在普通X线下显影，增强晶须阻射X线的能力等，因此在国内一般采用水热合成法来制备医用的HA晶须，水热合成法工艺简单，能保持羟基活性，长度大，长径比高，其中一种方法是将硝酸钙和磷酸氢二铵山梨醇等在压力30MPa、温度200℃下反应，可以得长度为100-700μm的长晶须，经漂浮法筛选甚至可以得到长度为500-1500μm、长径比在300-500以上的特长晶须，使用此晶须与PEEK进行复合，通过调整配比来调整复合材的弹性模量，使之接近人体骨骼的弹性模量17-21GPa，即可作为一种骨组织工程支架材料用于制备人工牙根。另外HA晶须容易团聚，可以把新配制的HA晶须通过球磨机分散混合在异丙醇、乙醇、甘油溶液中。用HA晶须与PEEK制成复合材，当晶须含量为20%时，复合材料的抗弯曲强度为210MPa，当晶须含量为30%时，复合材料的弯曲强度和抗压强度交叉在180MPa。

羟基磷灰石（HA）胶原高分子复合材料已成为当前人工骨替代材料的焦点，此类人工骨在材料组成、比例、孔隙度、外形、生物力学等方面和自然骨相似，可实现人工骨材料仿生化制备。HA对骨组织有天然的亲和力，而纳米羟基磷灰石（nHA）则更能增加组织活性，根据“纳米效应”理论，纳米粒子表面积比微米粒子表面积高出100倍，可以提高粒子活性，有利于与组织结合，所以我们选用nHA作为人工牙根的可吸收表面处理梯度材料，使其更具活性。我们以磷酸和氢氧化钙为原料，用化学沉淀法合成的直径为20-30nm、长度为100-200nm的针状nHA，为防止nHA团聚，我们将其加入到聚乳酸的氯仿溶液中，经过超声混合，真空干燥复合，得到一种生物活性更好的复合材，该复合材中的低分子聚乳酸与nHA表面的钙原子和磷原子接枝介面结合良好，该复合材能与自然骨形成键结合，同时可以降解，可以吸收，可作梯度材料，在临床上已得到广泛的应用。

聚醚醚酮（PEEK）、聚乳酸（PLLA）、聚乙醇酸（PGA）等三种体内可植入性材料在美国均已获得FDA批准并用于临床作为人工骨替代材料，不同的是它们的降解时间不一样，PGA降解较快，只有4周左右，PLLA降解较慢，要3个月左右，而PEEK不会降解，但PEEK的力学性能和韧性特别好，PLLA、PGA和HA在组织工程支架中有良好的生物相容性、骨诱导性和生物活性，没有免疫性和细胞毒性，有良好的促进人类成骨细胞粘附和成骨分化的作用。在骨髓腔和骨松质网质上有造血干细胞（HSCS）和间质干细胞（HMSCs），造血干细胞可分化为破骨细胞，移行到受损部位，间质干细胞可向治愈点移动并分化成骨细胞，形成新骨组织，所以较小的骨损伤骨折等可以轻易自我修复，而大的骨损伤如同股骨颈粉碎性，复杂性骨折，需要手术植骨和植入人造骨组织支架，通过诱导骨细胞粘附和增殖来刺激新骨组织的再生。将人造骨组织支架制成表面多孔支架，可诱导机体固有修复机能来自我修复，表面多孔支架能促进植入生物材料与人体微环境相互作用，有利于骨组织在多孔支架迁移、代谢，对组织的形成极为有利。在人造骨组织支架的表面加工微孔并填充可降解的生物材料，有利于骨组织再生，而支架在降解过程中既可以保持其强度，又可以诱导骨自行修复。

在植入物稳定的条件下，力负荷能够促使修复过程中骨细胞对植入物的适应，在植入物与人体间形成骨集合物，增强生长因子的产生与释放。力负荷的调控，对间质干细胞、成骨细胞和软骨细胞的成骨化有着重要影响。所以，如果采用钛金属人工牙根，即可种植即可修复，在牙根植入稳定的前提下同样有利于骨组织自行修复。

PEEK与HA晶须复合，当HA晶须含量为20%时，复合材的抗弯强度达210MPa，可作皮质骨材料。PEEK与HA晶须复合成人工骨，可以提供强劲的支架。如果在PEEK与HA晶须复合材的人工牙根上打孔，孔隙大小为300-400μm，则有利于骨细胞的长入，孔隙小于5-15μm则只适合纤维细胞长入而不适合骨细胞。PLLA、PGA这两种材料与nHA复合，当nHA含量为25%时，复合材生物相容好，能与自然骨组织形成键结合。当采用PLLA、PGA与nHA的复合物填充人工牙根上的孔隙，孔内复合物的降解吸收与骨组织长入时间相匹配，孔内材料降解时正好骨细胞能进入填充这些孔隙，在微孔内原位生长，更有利于骨结合，有利于成骨层的形成。

因此，我们选择采用PEEK与HA晶须的复合材料作为人工牙根的支架材料，在支架材料相应的位置加工孔隙并填充可降解的活性复合材料，然后再喷涂生物活性涂层，即可制备一种可增强骨结合能力的骨组织工程支架材料人工牙根。

发明内容

本发明的目的是提供一种骨组织工程支架材料人工牙根的制备方法。本发明的特征是在人工牙根植入部分的表面上制备大量的微孔，这些孔除了能扩大表面接触面积外，更重要的是，这些微孔有利于骨细胞在支架上迁移、代谢，对骨组织的形成极为有利。在微孔内涂入可降解的生物材料PLLA、PGA和nHA，这些复合材料有良好的生物相溶性，骨诱导性，有利于骨细胞在微孔中迁移，骨细胞迁移时微孔内材料的降解正好可以让骨细胞能进入充填这些孔隙，可以原位生长，因此对骨组织的形成极为有利。而且人工牙根的多孔支架在微孔内材料的降解时，能保持力学强度，力负荷能促使修复过程中骨组织对植入物的适应，对造血干细胞或骨细胞和软骨细胞的成骨化有重要影响，可以诱导骨组织对小的损伤自行修复。用此方法制备的人工牙根是通过骨诱导细胞对骨的自我修复来达到与骨结合，其力学性能和弹性模量与牙槽骨更匹配，所以不容易造成牙槽骨的骨质吸收，而且其生物相容性和骨结合能力要大大强于常规钛基人工牙根。

本发明的具体技术方案为：

一种可增强骨结合能力的骨组织工程支架材料人工牙根，其由上至下包括基台、颈部和植入部分，其中基台与人工牙冠相连接，植入部分植入牙槽骨内，植入部分设有外螺纹，植入部分的外螺纹间隙表面上设有多个密集排列的孔隙。

所述骨组织工程支架材料人工牙根的制备方法，包括以下步骤：

A、钢模的制备：先根据人工牙根的设计结构制作各种不同型号的相应的钢模；

B、人工牙根初胚的制备：取75-85重量份的医用级聚醚醚酮粉剂，加入15-25重量份的羟基磷灰石长晶须，再加入足量的乙醇和甘油作分散剂，然后放入高速球磨机中混合成悬浮液，再经抽吸滤除分散剂和干燥处理后，制成干燥复合物，然后将复合物放入步骤A制作的钢模钢模中以2-10MPa的压力进行压模成型，并加热至330-340℃，保持5-10分钟，自然冷却脱模后，得到人工牙根的初胚，再用CAD/CAM数控机床修整人工牙根初胚的外形和连接部；

C、加工孔隙：在步骤B得到的人工牙根的植入部分表面加工微孔，孔隙大小为300-400μm，间距为100-200μm，深度为200-600μm，再以喷砂的方式对微孔进行粗化处理；

D、孔隙填充聚乳酸/纳米羟基磷灰石（PLLA/nHA）复合物：取75-85重量份的医用级聚乳酸加入足量的异丙醇配成聚乳酸异丙醇溶液，再加入15-25重量份的纳米针状羟基磷灰石，按常规方法混合成悬浮液后再抽吸滤除异丙醇，使之浓缩成泥状复合物，用涂抹的方法将此泥状复合物涂入步骤C对人工牙根所加工的微孔孔隙中，然后先干燥再加热，在150-175℃这个高于聚醚醚酮玻璃化温度的条件下，促使聚乳酸和聚醚醚酮接触面充分结合；

E、喷涂聚乙醇酸/纳米羟基磷灰石（PGA/nHA）复合物涂层：取8g的聚乙醇酸与和90ml的氯仿溶液混合，再加入2g的纳米羟基磷灰石，用超声混合的方法混合成悬浮液，用喷枪将悬浮液缓慢喷涂在人工牙根的植入部分的表面，然后经热风干燥，喷涂厚度为2-10μm；

F、表面降解处理：将经步骤E处理好的人工牙根用生理盐水浸泡2-3周，用扫描电镜（SEM）观看，直至人工牙根的喷涂表面有纳米羟基磷灰石纤维头裸露，即为成品。

本发明的人工牙根的制备方法采用聚醚醚酮与羟基磷灰石晶须的复合材料作为骨组织工程支架材料来制作人工牙根的初胚，并在人工牙根初胚相应的位置加工孔隙并填充可降解的PLLA/nHA活性复合材料，然后再喷涂PGA/nHA生物活性涂层，经表面降解处理后，即可得到一种可增强骨结合能力的骨组织工程支架材料人工牙根。本人工牙根由于其内部支架采用PEEK和HA晶须的复合材制成，其表面的nHA比HA具有更好的组织活性，而且PGA在微孔中先被降解，诱导微孔中的PLLA/nHA与骨细胞原位结合，PLLA的降解稍慢，3个月的降解时间正好使骨细胞长入充填这些孔隙，这些降解后形成的微孔有利于骨细胞在微孔支架上迁移、代谢，对骨组织的形成有利。用此方法制备的人工牙根是通过骨诱导细胞对骨的自我修复来达到与骨结合，其力学性能和弹性模量与牙槽骨更匹配，所以不容易造成牙槽骨的骨质吸收，而且其生物相容性和骨结合能力要大大优于常规金属钛人工牙根或氧化锆人工牙根。

附图说明

图1为本发明制成的人工牙根的种植示意图。

图中：1-人工牙冠，2-人工牙根，2.1-基台，2.2-颈部，2.3-植入部分，2.4-外螺纹，2.5-孔隙，3-牙槽骨，4-牙龈。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。

如图1所示，本发明所述的可增强骨结合能力的骨组织工程支架材料人工牙根由上至下包括基台2.1、颈部2.2和植入部分2.3，其中基台2.1与人工牙冠1相连接，植入部分2.3植入牙槽骨内，植入部分2.3设有外螺纹2.4，植入部分2.3的外螺纹2.4间隙表面上设有多个密集排列的孔隙2.5。

本发明的骨组织工程支架材料人工牙的制备方法，包括以下步骤：

A、钢模的制备：先根据人工牙根的设计结构制作各种不同型号的相应的钢模。

B、人工牙根初胚的制备：取75-85重量份的医用级聚醚醚酮粉剂，加入15-25重量份的羟基磷灰石长晶须，再加入足量的乙醇和甘油作分散剂，然后放入高速球磨机中混合成悬浮液，再经抽吸滤除分散剂和干燥处理后，制成干燥复合物，然后将复合物放入步骤A制作的钢模钢模中以2-10MPa的压力进行压模成型，并加热至330-340℃，保持5-10分钟，自然冷却脱模后，得到人工牙根的初胚，再用CAD/CAM数控机床修整人工牙根初胚的外形和连接部。

在本步骤中，羟基磷灰石长晶须采用长度为700μm以上且长径比为300-500的羟基磷灰石长晶须；所述羟基磷灰石长晶须采用水热合成法进行制备并经漂浮法进行筛选。所述分散剂可以采用异丙醇和甘油替代。

C、加工孔隙：在步骤B得到的人工牙根的植入部分表面加工微孔，孔隙大小为300-400μm，间距为100-200μm，深度为200-600μm，再以喷砂的方式对微孔进行粗化处理。

在本步骤中，加工微孔的方法可以用数控机床钻孔的方法或用模具直接挤压的方法加工形成300-400μm微孔；微孔粗化处理的方法可以采用粒度为30-50μm的自然界岩石或硬石灰石（CaCO₃）或天然磷灰石（Ca₃(PO₄)₂）砂粒进行喷砂，然后用稀盐酸浸泡，再进行超声清洗。

在本步骤中，在人工牙根的植入部分表面加工微孔并进行粗化处理的作用除了能扩大表面接触面积外，更重要的是，后续步骤中在微孔内涂入可降解的生物材料PLLA、PGA和nHA，这些复合材料有良好的生物相溶性和骨诱导性，有利于骨细胞在微孔中迁移，骨细胞迁移时微孔内材料的降解正好可以让骨细胞能进入充填这些孔隙，可以原位生长，因此对骨组织的形成极为有利。而且人工牙根的多孔支架在微孔内材料的降解时，能保持力学强度，力负荷能促使修复过程中骨组织对植入物的适应，对造血干细胞或骨细胞和软骨细胞的成骨化有重要影响，可以诱导骨组织对小的损伤自行修复。

D、孔隙填充聚乳酸/纳米羟基磷灰石（PLLA/nHA）复合物：取75-85重量份的医用级聚乳酸加入足量的异丙醇配成聚乳酸异丙醇溶液，再加入15-25重量份的纳米针状羟基磷灰石，按常规方法混合成悬浮液后再抽吸滤除异丙醇，使之浓缩成泥状复合物，用涂抹的方法将此泥状复合物涂入步骤C对人工牙根所加工的微孔孔隙中，然后先干燥再加热，在150-175℃这个高于聚醚醚酮玻璃化温度的条件下，促使聚乳酸和聚醚醚酮接触面充分结合。

在本步骤中，所述纳米针状羟基磷灰石采用直径为20-30nm且长为100-200nm的纳米针状羟基磷灰石；所述纳米针状羟基磷灰石以磷酸和氢氧化钙为原料用化学沉淀法进行制备。

E、喷涂聚乙醇酸/纳米羟基磷灰石（PGA/nHA）复合物涂层：取8g的聚乙醇酸与和90ml的氯仿溶液混合，再加入2g的纳米羟基磷灰石，用超声混合的方法混合成悬浮液，用喷枪将悬浮液缓慢喷涂在人工牙根的植入部分的表面，然后经热风干燥，喷涂厚度为2-10μm。

F、表面降解处理：将经步骤E处理好的人工牙根用生理盐水浸泡2-3周，用扫描电镜（SEM）观看，直至人工牙根的喷涂表面有纳米羟基磷灰石纤维头裸露，即为成品。