控制玉米氮响应的基因及其获得方法和应用

摘要

本发明提供了一种控制玉米氮响应的基因，控制玉米氮响应的基因的编码序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。较佳地，控制玉米氮响应的基因的编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。还提供了控制玉米氮响应的基因的获得方法，以及控制玉米氮响应的基因或根据控制玉米氮响应的基因的获得方法获得的控制玉米氮响应的基因在控制玉米氮响应中的应用。本发明的控制玉米氮响应的基因能够对受氮肥调控的转录本的表达起调节作用，为研究玉米氮响应调控机制奠定良好的基础，促进玉米氮素利用率(NUE)研究的进展，适于大规模推广应用。

说明书

技术领域

本发明涉及分子遗传学技术领域，更具体地，涉及控制氮响应的基因技术领域，特别是指一种控制玉米氮响应的基因及其获得方法和应用。

背景技术

玉米作为我国第一大作物氮响应极为敏感，产量的高低极大程度依赖于外界氮肥的施用量。然而氮肥的过度施加不仅增加经济成本带来资源的大量消耗；并且不被利用的氮素将对环境产生极大的负面影响。因此研究玉米氮响应分子调控机制对可持续化提高玉米产量具有重要意义。

氮素(Nitrogen,N)作为植物所必需的大量营养元素对植物的生长发育具有至关重要的作用，NLP(NIN-like proteins)基因家族为植物特有的一类转录因子，对植物氮素信号转导有重要调控作用。豆科植物根瘤的形成依赖于该基因的存在，例如百脉根中NIN(Suzuki W,Konishi M,Yanagisawa S.2013.The evolutionary events necessary for the emergence of symbiotic nitrogen fixation in legumes may involve a loss of nitrate responsiveness ofthe NIN transcription factor.Plant signaling&behavior 8(10),e25975)；在非豆科植物中拟南芥NLP基因的研究更为详尽，2009年Castaings等发现Atnlp7拟南芥突变体，该突变体N信号转导和同化代谢途径受损并表现出一系列氮素缺乏的表型性状，通过试验最终推测定位在核中的AtNLP7可能为转录因子对氮同化代谢有重要调控作用(Castaings L,Camargo A,Pocholle D,Gaudon V,Texier Y,Boutet-Mercey S,Taconnat L,Renou JP,Daniel-Vedele F,Fernandez E,Meyer C,Krapp A.2009.The nodule inception-like protein 7modulates nitrate sensing and metabolism in Arabidopsis.Plant Journal 57,426-435)。2013年Marchive等发现，在外界氮信号刺激数分钟后拟南芥转录因子AtNLP7利用核保留机制迅速响应并对氮代谢关键基因进行调控，该机制直接受控于外界N信号并独立于转录水平的调控(Marchive C,Roudier F,Castaings L,Brehaut V,Blondet E,Colot V,Meyer C,Krapp A.2013.Nuclear retention of the transcription factor NLP7 orchestrates the early response to nitrate in plants.Nature Communications 4,1713)。以上证据说明AtNLP7为拟南芥初期氮响应的主要调控者。

然而，NLP基因在玉米中的研究报道甚少。因此，需要研究玉米氮响应的初始调控元件，解明该基因的功能，以便于在源头控制玉米氮响应状态从而促使玉米对氮素的高效吸收利用并最终提高玉米产量。

发明内容

为了克服上述现有技术中的缺点，本发明的一个目的在于提供一种控制玉米氮响应的基因，其能够对受氮肥调控的转录本的表达起调节作用，为研究玉米氮响应调控机制奠定良好的基础，促进玉米氮素利用率(NUE)研究的进展，适于大规模推广应用。

本发明的另一目的在于提供一种控制玉米氮响应的基因的获得方法，通过该方法能够获得控制玉米氮响应的基因，而且操作简单方便，适于大规模推广应用。

本发明的另一目的在于提供一种控制玉米氮响应的基因的应用，从而对受氮肥调控的转录本的表达起调节作用，为研究玉米氮响应调控机制奠定良好的基础，促进玉米氮素利用率(NUE)研究的进展，适于大规模推广应用。

为达到以上目的，在本发明的第一方面，提供了一种控制玉米氮响应的基因，其特点是，所述的控制玉米氮响应的基因的编码序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

编码如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列可以有多种，较佳地，所述的控制玉米氮响应的基因的编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在本发明的第二方面，提供了一种控制玉米氮响应的基因的获得方法，其特点是，所述获得方法包括以下步骤：

(1)在玉米基因组中筛选含有NLP家族功能结构域的基因，所述NLP家族功能结构域包括RWP-RK结构域和PB1结构域；

(2)对所述的含有NLP家族功能结构域的基因进行氮响应分析，获得氮响应最敏感的基因。

在所述步骤(1)中，在玉米基因组中筛选含有NLP家族功能结构域的基因可以采用任何合适的方法，较佳地，在所述步骤(1)中，采用Pfam-HMM模型在所述玉米基因组中筛选所述的含有NLP家族功能结构域的基因。

在所述步骤(1)中，采用Pfam-HMM模型在所述玉米基因组中筛选可以采用任何合适的具体步骤，更佳地，所述步骤(1)具体包括：

(11)采用Pfam数据库构建NLP家族的隐马尔科夫模型文件：RWP-RK.hmm以及PB1.hmm；

(12)根据所述RWP-RK.hmm和所述PB1.hmm对所述玉米基因组进行搜索比对，从而获取所述的含有NLP家族功能结构域的基因。

在所述步骤(12)中，进行所述搜索比对可以采用任何合适的方法，更进一步地，在所述步骤(12)中，采用HMMER3.0软件包中的hmmersearch程序进行所述搜索比对。

在所述步骤(12)中，所述玉米基因组可以是任何合适的玉米基因组，更进一步地，在所述步骤(12)中，所述玉米基因组是玉米B73V3版参考基因组。

为了保证结果的准确性，较佳地，在所述步骤(1)和所述步骤(2)之间还包括步骤：利用公共数据库对所述的含有NLP家族功能结构域的基因进行验证。

所述公共数据库可以是任何合适的公共数据库，更佳地，所述公共数据库是NCBI Conserved Domains Database数据库。

所述步骤(2)可以采用任何合适的具体步骤，较佳地，所述步骤(2)具体包括：

(21)将在相同环境下生长的玉米植株分成处理组和对照组，对所述处理组进行瞬时氮处理；

(22)监测所述瞬时氮处理后所述的含有NLP家族功能结构域的基因在不同时间点的表达变化情况，筛选出所述瞬时氮处理后表达量上调最大的基因，从而获得所述的氮响应最敏感的基因。

在所述步骤(22)中，监测所述瞬时氮处理后所述的含有NLP家族功能结构域的基因在不同时间点的表达变化情况可以采用任何合适的方法，更佳地，在所述步骤(1)和所述步骤(2)之间还包括步骤：获取所述的含有NLP家族功能结构域的基因的基因组位置信息，利用所述基因组位置信息设计特异性引物；在所述步骤(22)中，利用所述特异性引物采用实时荧光定量PCR方法进行所述监测。

在所述步骤(21)中，所述瞬时氮处理可以采用任何合适的条件，更佳地，在所述步骤(21)中，所述玉米植株为玉米B73自交系，所述瞬时氮处理的浓度为15mM>3，所述对照组可以采用15mM>

在所述步骤(22)中，所述不同时间点可以是任何合适的时间点，更佳地，所述不同时间点包括0h、0.5h、1h、1.5h和2h。

为了明确所述的氮响应最敏感的基因的功能效用，较佳地，在所述步骤(2)后，所述的控制玉米氮响应的基因的获得方法还包括：监测不同氮处理下突变体玉米植株和野生型玉米植株表达谱的变化情况，确定所述突变体玉米植株的表型变化及氮响应状态，明确所述的氮响应最敏感的基因的功能效用。

监测不同氮处理下突变体玉米植株和野生型玉米植株表达谱的变化情况用可以采用任何合适的方法，更佳地，采用RNA-seq测序技术监测不同氮处理下突变体玉米植株和野生型玉米植株表达谱的变化情况。

确定所述突变体玉米植株的表型变化可以采用任何合适的方法，更佳地，对突变体玉米植株和野生型玉米植株在足氮和低氮环境下V3期植株的表型变化进行生理生化分析来确定突变体植株的表型变化。足氮和低氮环境的氮浓度可以分别为例如15mM>3和0.15mM>3，表型包括例如植株总氮含量、氨基酸含量、第三片完全展开叶长度、植株干重、初始根长度等。

在本发明的第三方面，提供了上述的控制玉米氮响应的基因或根据上述的控制玉米氮响应的基因的获得方法获得的控制玉米氮响应的基因在控制玉米氮响应中的应用。

本发明的有益效果在于：

a.本发明的控制玉米氮响应的基因的编码序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，能够对受氮肥调控的转录本的表达起调节作用，为研究玉米氮响应调控机制奠定良好的基础，促进玉米氮素利用率(NUE)研究的进展，适于大规模推广应用。

b.本发明的控制玉米氮响应的基因的获得方法包括以下步骤：(1)在玉米基因组中筛选含有NLP家族功能结构域的基因，所述NLP家族功能结构域包括RWP-RK结构域和PB1结构域；(2)对所述的含有NLP家族功能结构域的基因进行氮响应分析，获得氮响应最敏感的基因，因此，通过该方法能够获得控制玉米氮响应的基因，而且操作简单方便，适于大规模推广应用。

c.本发明的控制玉米氮响应的基因或控制玉米氮响应的基因的获得方法获得的控制玉米氮响应的基因在控制玉米氮响应中的应用，从而对受氮肥调控的转录本的表达起调节作用，为研究玉米氮响应调控机制奠定良好的基础，促进玉米氮素利用率(NUE)研究的进展，适于大规模推广应用。

本发明的这些和其它目的、特点和优势，通过下述的详细说明，附图和权利要求得以充分体现，并可通过所附权利要求中特地指出的手段、装置和它们的组合得以实现。

附图说明

图1是采用实时荧光定量PCR方法监测瞬时氮处理后含有NLP家族功能结构域的基因在不同时间点的表达变化情况，对照基因为玉米持家基因UPF1。

图2是两种氮处理下zmnlp5突变体和野生型V3期的生长状态图。

图3是两种氮处理下zmnlp5突变体和野生型V3期叶长、干重及初始根长度的比较图。

图4A是zmnlp5突变体中氮响应功能部分丧失基因的富集分析图。

图4B是zmnlp5突变体和野生型中N标记基因的表达分析图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。

本发明的控制玉米氮响应的基因(ZmNLP5)可以控制玉米氮响应状态，所述基因的编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码的氨基酸如SEQ ID NO:2所示。

该控制玉米氮响应的基因可以通过以下方法获得：

1.1利用Pfam数据库(http://pfam.xfam.org/)构建NLP家族的隐马尔科夫模型文件(RWP-RK.hmm，PF02042；PB1.hmm，PF00564)(其中PF02042和PF00564分别为Pfam数据库中NLP家族两个功能结构域RWP-RK和PB1的编号)，然后利用HMMER3.0软件包(http://hmmer.janelia.org/static/binaries/hmmer3.0_windows.zip)中的hmmersearch程序对玉米B73参考基因组进行搜索比对(E值＜1E-5)，从而获取包含以上2个保守结构域的所有NLP基因，共9个，命名为ZmNLP1～ZmNLP9，也就是前面提到的含有NLP家族功能结构域的基因，然后利用公共数据库(NCBI Conserved Domains Database(CDD)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)数据库)对上述基因进行验证(将每个基因的ID编号输入到数据库中检测该基因是否含这两个结构域)，验证后的NLP基因家族通过自行编写的Perl程序，解析并释放出每个成员的基因组位置信息(见表1)(葛敏,吕远大,李坦,张体付,张晓林,赵涵.2014.玉米Dof转录因子家族的全基因组鉴定与分析.中国农业科学,47(23):4563-4572)。

表1含有NLP家族功能结构域的基因的基因组位置信息

1.2利用NLP基因家族各成员的位置信息设计特异性引物，其中ZmNLP1的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，ZmNLP2的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，ZmNLP3的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，ZmNLP4的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示，ZmNLP5的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示，ZmNLP6的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示，ZmNLP7的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示，ZmNLP8的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示，ZmNLP9的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示，UPF1的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示。将玉米自交系B73(获得于江苏省农业科学院农业生物技术研究所作物分子育种研究室)种植于充分拌匀的沙土中，生长至V3期进行瞬时氮处理(15mM>3，对照为15mM>

1)RNA的提取及反转录：收集各时间点植物根部组织鲜样，液氮研磨后利用TRIzol方法所述提取总RNA，每份样品RNA定量为统一浓度后利用Prime ScriptTM RT Reagent kit(Takara)试剂盒将RNA反转录为cDNA。

2)qPCR反应体系：总反应体积为10.0μl，包括：Premix Ex Taq^TMII(TaKaRa,Dalian,China),1.0μl模板(cDNA浓度为10ng/μl),1.0μl>

3)qPCR反应条件：95℃3min；95℃10s,58℃20s,72℃20s,40个循环；72℃5min。

结果请参见图1所示，经qPCR分析表明在氮处理后0.5h玉米NLP基因的表达均有不同程度的上调，其中ZmNLP4，ZmNLP5，ZmNLP6，ZmNLP8四个基因在0.5h表达量较0h时上调超过2倍，为氮敏感基因。上调最为显著的是ZmNLP5基因(0.5h表达量上调超过5倍)，且在氮处理后1h时ZmNLP5表达量仍上调约为0h时的4倍，ZmNLP5基因为氮响应最敏感的基因。

2.ZmNLP5基因在调控玉米氮响应上的应用

2.1ZmNLP5基因对苗期植株表型的影响

首先在MaizeGDB网站UniformMu突变体库(http://www.maizegdb.org/uniformmu)中筛选ZmNLP5基因的玉米突变体材料zmnlp5(编号：UFMu-01175，突变体及野生型种子均获得于美国玉米遗传资源联合存储中心-UniformMu转座子资源库Maize Genetics Cooperation Stock Center UniformMu Transposon Resource)。检测野生型材料(W22)和突变材料(zmnlp5)在足氮(+N：15mM>3)和低氮环境(-N:0.15mM>3)下生长至V3期植株的表型变化情况(见图2)。结果发现：在足氮和低氮两种环境下，突变体材料的生理指标(初始根长度、叶长、干重、植株总氮含量、氨基酸含量)均比野生型低(见图2和图3，表2)。尤其在低氮环境下突变体较野生型植株主根长下降30.68％，植株总氮含量下降11.70％，突变体材料在响应外界氮浓度变化的能力上明显减弱。

表2野生型和zmnlp5突变体在两种氮环境下的总氮及氨基酸的含量

2.2ZmNLP5基因对苗期植株表达谱的影响

将zmnlp5突变体和野生型植株种植于15mM>3环境，种植条件如1.2所述。10天后，植株进行氮饥饿处理(0mM>3)处理，10天后后重新进行15mM>3或KCl处理，0.5h后对植株进行取样(WT+N，WT-N，zmnlp5+N，zmnlp5-N)，利用RNA-seq测序技术，监测不同氮处理下突变体和野生型玉米植株表达谱的变化情况。请参见图4A所示，结果发现:WT中氮处理后共有9690个基因存在显著性的差异表达，为野生型的氮响应基因；然而近44.37％(4299/9660)的氮响应基因在zmnlp5突变体中不存在显著的差异表达，即近一半的氮响应基因在突变体中部分丧失氮响应功能，富集分析(具体利用agriGO(http://bioinfo.cau.edu.cn/agriGO/analysis.php,Du>

本发明通过本发明的上述的控制玉米氮响应的基因的获得方法获得了控制玉米氮响应的基因，通过氮响应分析以及基因突变体遗传验证，表明该控制玉米氮响应的基因可以对受氮肥调控的转录本的表达起调节作用。

综上所述，本发明的控制玉米氮响应的基因能够对受氮肥调控的转录本的表达起调节作用，为研究玉米氮响应调控机制奠定良好的基础，促进玉米氮素利用率(NUE)研究的进展，适于大规模推广应用。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。