一种UPLC-MS-MS快速筛查延胡索与醋延胡索差异性的方法

摘要

本发明公开了一种UPLC‑MS‑MS快速筛查延胡索与醋延胡索差异性的方法，包括：（1）收集待区分的延胡索与醋延胡索药材，制成标准汤剂样品；（2）将样品进入UPLC‑MS‑MS进行分析，得到对应的质谱数据；（3）将原始采集的数据直接导入至Compound Discoverer2.1，进行数据分析；（4）采用动态规划计算法校正色谱峰漂移，对齐色谱峰，利用最邻近聚类方法将保留时间较为接近的物质注册成为一个化合物；（5）利用方差分析计算样品间差异性的物质，确定差异性。本发明将化合物质谱信息输出为原始文件，不需转换成其他格式，可直接导入至Compound Discoverer2.1库中搜索化合物，该方法能够实现快速锁定中药材样本中存在的差异性化合物，适用于大批量样本快速分析测定。

说明书

技术领域

本发明属于中药成分研究技术领域，具体涉及一种UPLC-MS-MS快速筛查延胡索与醋延胡索差异性的方法。

背景技术

延胡索为罂粟科植物延胡索Corydalis yanhusuo W.T.Wang的干燥块茎。其性味辛、苦，温，归肝、脾经，具有活血、行气、止痛之功，用于胸胁、脘腹疼痛，胸痹心痛，经闭痛经，产后瘀阻，跌仆肿痛。又名元胡、玄胡，与白术、白芍、浙贝母、杭白菊、玄参、笕麦冬、温郁金并称“浙八味”，为大众常用中药。延胡索的药用最早记载于陈藏器《本草拾遗》(公元739年)与李珣《海药本草》(约公元10世纪)。历代处方用名有延胡索、玄胡索、玄胡、元胡、延胡等，目前《中华人民共和国药典》用“延胡索”作为药名。

醋延胡索是延胡索的醋制品，醋制后可以提高延胡索的有效利用率，可以增加治疗效果。由于经过炮制，会存在活性成分的差异。因此，对不同炮制方法的同种药材进行筛选，对于提升中药品质具有重要的实际意义。

目前，对中药材的鉴别方法主要有HPLC、IR、NIR、TLC等，这些方法中存在大量的假阳性和假阴性问题，导致利用这些方法进行分析时，可能漏掉重要的物质信息，进而导致所筛选出的差异性物质无法有效表征组别差异，对确定不同炮制方法的同种中药材鉴别带来困难。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种快速、准确度高的UPLC-MS-MS快速筛查延胡索与醋延胡索差异性的方法。

本发明是通过以下技术方案实现：

一种UPLC-MS-MS快速筛查延胡索与醋延胡索差异性的方法，包括以下步骤：

(1)收集待区分的延胡索与醋延胡索药材，将相同炮制方法的不同批次延胡索和醋延胡索药材各分为一组，将每组延胡索与醋延胡索药材制成相应的延胡索标准汤剂样品和醋延胡索标准汤剂样品，粉碎，过60目筛，于-20℃下避光保存；

(2)取步骤(1)的延胡索和醋延胡索标准汤剂样品各0.2g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25ml，称定重量，超声处理20-40分钟，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得到供试品溶液，随后进入UPLC-MS-MS系统进行分析，得到每个延胡索标和醋延胡索标准汤剂样品对应的质谱数据；

(3)将步骤(2)采集的数据直接导入至Compound Discoverer2.1，然后进行数据分析，针对每个样品进行色谱峰提取和质谱信息表征；

(4)选择物质色谱峰数量最多的样品作为参照样品，采用动态规划计算法校正样品间的色谱峰漂移，对齐属于同一物质的色谱峰，然后利用最邻近聚类方法将保留时间较为接近的物质注册成为一个化合物，最终建立一个样品和色谱峰的注册图表；经过外标校正后，用于后续的分析；

(5)利用方差分析计算样品间差异性的物质，置信水平阈值设定为0.05，将置信水平小于0.05的物质视作差异性化合物，将所有差异性物质的质谱信息的原始文件直接导入到Compound Discoverer2.1库中进行匹配，确定物质结构，从而得到差异性物质；然后通过色谱的峰面积和出峰保留时间对应的准分子离子峰的质量数确定延胡索与醋延胡索的差异性。

优选的，所述延胡索和醋延胡索标准汤剂样品是通过如下方法得到的：

分别取延胡索和醋延胡索药材，各加水煎煮两次，第一次加8-10倍量水，浸泡30分钟，武火(500w)煮沸后文火(300w)保持微沸20-40分钟，煎液经350目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却；第二次加6-8倍量水，武火(500w)煮沸后文火(300w)保持微沸20-30分钟，煎液经100-350目筛网趁热过滤，滤液迅速冷水冷却，合并两次滤液，浓缩至清膏相对密度为1.04～1.06g/ml，冷冻干燥，即得。

本发明的延胡索和醋延胡索标准汤剂样品的制备方法，符合传统中医药理论推崇的中药饮片以汤剂入药的观点，以饮用水作为提取溶媒避免了使用有机溶剂作溶媒带来的安全性风险，能较好的保留延胡索和醋延胡索中大部分化合物的信息，更符合中药临床使用习惯，且得到延胡索和醋延胡索样品的信息量更大，提高了检测的准确性和重现性。

优选的，步骤(2)中，所述UPLC-MS-MS系统的分析条件为：

色谱条件：

C18色谱柱，以含5mM甲酸铵的0.2％氨水为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱如下表所示；流速：0.4ml/min；柱温为40℃；检测波长为280nm；理论板数按延胡索乙素计算应不低于3000；

质谱条件：

MS系统:Q Exactive Focus四极杆-静电场轨道阱高分辨串联质谱，离子化模式:ESI^–&>+，锥孔电压:3500/3200V(+/-)；蒸发器温度：350℃；毛细管温度：320℃；全扫描：扫面范围为分子量100～1500，一级质谱分辨率70000，二级质谱分辨率为17500。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

(1)本发明首次利用UPLC-MS-MS快速筛查延胡索与和醋延胡索的差异性，该方法具有快速、准确、稳定等优点；

(2)本发明将化合物质谱信息输出为原始文件，该文件不需转换成其他格式，可直接导入至Compound Discoverer2.1库中搜索化合物，该方法能够实现快速锁定中药材样本中存在的差异性化合物，适用于大批量延胡索和醋延胡索样本的快速分析测定。

(3)本发明采用延胡索和醋延胡索药材的标准汤剂样品作为供试品，针对水溶性提取物进行研究分析，通过提取工艺的优化考察，研究得出延胡索和醋延胡索标准汤剂的制备工艺；结合本发明所建立的延胡索和醋延胡索的筛查方法，能推广应用在延胡索和醋延胡索配方颗粒产品及其相关制剂的原料选择和制备工艺中。

附图说明

图1为延胡索和醋延胡索标准汤剂样品的高效液相色谱图和TIC图；

图2为延胡索和醋延胡索标准汤剂样品的PCA图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。

实施例1

一种UPLC-MS-MS快速筛查延胡索与醋延胡索差异性的方法，包括以下步骤：

(1)收集待区分的延胡索与醋延胡索药材，将相同炮制方法的不同批次延胡索和醋延胡索药材各分为一组，将每组延胡索与醋延胡索药材制成相应的延胡索标准汤剂样品和醋延胡索标准汤剂样品，粉碎，过60目筛，于-20℃下避光保存；

其中，所述延胡索与醋延胡索标准汤剂样品是通过如下方法得到的：

分别取延胡索和醋延胡索药材，各加水煎煮两次，第一次加9倍量水，浸泡30分钟，武火(500W)煮沸后文火(300W)保持微沸30分钟，煎液经350目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却；第二次加7倍量水，武火(500W)煮沸后文火(300W)保持微沸25分钟，煎液经350目筛网趁热过滤，滤液迅速冷水冷却，合并两次滤液，在水浴温度50℃、真空度-0.09MPa的条件下浓缩至清膏相对密度为1.05g/ml，冷冻干燥，即得。

(2)取步骤(1)的延胡索和醋延胡索标准汤剂样品各0.2g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得到供试品溶液，随后进入UPLC-MS-MS系统进行分析，得到每个延胡索和醋延胡索标准汤剂样品对应的质谱数据；

色谱条件：

C18色谱柱，以含5mM甲酸铵的0.2％氨水为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱如下表所示；流速：0.4ml/min；柱温为40℃；检测波长为280nm；理论板数按延胡索乙素计算应不低于3000；

质谱条件：

MS系统:Q Exactive Focus四极杆-静电场轨道阱高分辨串联质谱，离子化模式:ESI^–&>+，锥孔电压:3500/3200V(+/-)；蒸发器温度：350℃；毛细管温度：320℃；全扫描：扫面范围为分子量100～1500，一级质谱分辨率70000，二级质谱分辨率为17500。

(3)将步骤(2)采集的数据直接导入至Compound Discoverer2.1，然后进行数据分析，针对每个样品进行色谱峰提取和质谱信息表征；

(4)选择物质色谱峰数量最多的样品作为参照样品，采用动态规划计算法校正样品间的色谱峰漂移，对齐属于同一物质的色谱峰，然后利用最邻近聚类方法将保留时间较为接近的物质注册成为一个化合物，最终建立一个样品和色谱峰的注册图表；经过外标校正后，得到延胡索与醋延胡索标准汤剂样品的高效液相色谱图(HPLC图)和总离子流图(TIC图)，如图1所示，用于后续的分析；

(5)利用主成分分析(PCA)对延胡索和醋延胡索标准汤剂样品的总离子流图数据进行分析，结果显示(如图2)，每组数据聚集在各自的95％的置信限椭圆图内，且两组数据能够完全分离，说明延胡索和醋延胡索标准汤剂样品可以得到完全的分离。利用方差分析计算样品间差异性的物质，置信水平阈值设定为0.05，将置信水平小于0.05的物质视作差异性化合物，将所有差异性物质的质谱信息的原始文件直接导入到CompoundDiscoverer2.1库中进行匹配，确定物质结构，从而得到差异性物质；然后通过色谱的峰面积和出峰保留时间对应的准分子离子峰的质量数确定延胡索与醋延胡索的差异性。结果如下表1所示，延胡索标准汤剂样品中，17个化合物含量较醋延胡索高，其中Taxilamine，二氢白屈菜红碱，Sanjoinenine含量较醋延胡索高约2-10倍；醋延胡索标准汤剂样品中，48个化合物含量显著升高，其中狮足草碱，DL-Tryptophan，四氢黄连碱，Lirioferine同分异构体，去氢延胡索甲素，二氢小檗碱，水苏碱，m/z＝465.25844等化合物差异显著，醋炒后含量升高的物质起重要作用。

表1延胡索和醋延胡索标准汤剂的成分分析结果

续表1