一种葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的高密度发酵方法

摘要

本发明涉及微生物发酵技术领域，公开了一种葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的高密度发酵方法，该方法以保藏编号为CGMCC No.11626的毕赤酵母基因工程菌为出发菌株，采用体积比为20:1的甲醇和山梨醇进行诱导发酵，能够进一步提高GOD产量，下罐酶活达到905U/mL。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中 的高密度发酵方法。

背景技术

葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOD,EC1.1.3.4)可催化β～D～葡萄糖氧 化为δ～D～葡萄糖酸和过氧化氢，其作用表现在除葡萄糖，除氧，形成过氧化 氢等方面。葡萄糖氧化酶作为一种天然的生物催化剂，安全、无毒副作用， 在食品饮料工业、畜禽养殖业、医药行业等领域中有众多应用，并且已经取 得了可观的商业价值。GOD用于面包、牛奶、果汁、啤酒等领域去氧保鲜效 果良好；在动物饲料中添加的GOD能具有抗氧化的功能，能显著抑制霉变微 生物的产生，对霉变饲料毒素也有很好的降解作用，从而提高动物免疫能力， 来代替药物促生长剂发挥作用；葡萄糖氧化酶在医药行业中，可以制备成尿 糖、血糖试纸，因其具有操作简单、无害、无毒、容易控制等优点，现在在 临床上具有广泛的应用。

GOD的大规模生产广泛采用黑曲霉或青霉菌发酵，但黑曲霉和青霉菌发 酵生产GOD过程中，过氧化氢酶、纤维素酶及淀粉酶等大量杂蛋白的存在给 纯化带来相当大的困难。因此，通过构建工程菌实现葡萄糖氧化酶的高效表 达，研制及生产高品质的GOD制剂，是一条比较经济有效的途径。

毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统已经发展成为一个成熟的外源蛋白 表达系统，已有上千种蛋白在毕赤酵母系统中得到成功表达。近些年，毕赤 酵母被美国FDA认定为GRAS(Generally recognized as safe)，为其在食品 及医药上应用铺平了道路。毕赤酵母表达外源蛋白具有表达量高、稳定性好、 培养成本低和产物易分离纯化等优点，适于大体积高密度连续发酵，具有强 且易控的醇氧化酶(Alcohol oxidase，AOX)启动子等优点，可严格控制外源基 因的表达。重组葡萄糖氧化酶基因进行毕赤酵母异源表达可有效地解决纯化 困难的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的高密度发酵 方法，进一步提高葡萄糖氧化酶的酶活及产量。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的高密度发酵方法，以葡 萄糖氧化酶基因GOD转化的毕赤酵母基因工程菌为出发菌株，其保藏编号为 CGMCCNo.11626，包括如下步骤：

用质量浓度为28％的氨水调节发酵培养基的pH值为4.5～5.0，将活化的 菌种扩培液接入所述发酵培养基中，在28～30℃下通气搅拌18～24h进行发酵 处理；

在所述发酵处理的过程中，当碳源消耗完溶氧量迅速上升时，流加补料 培养基直至发酵液的OD₆₀₀值为150～200；

当碳源消耗完，发酵液的溶氧量再度升高至50％以上时，开始流加诱导 培养基进行诱导发酵；所述诱导培养基含有体积比为20:1的甲醇和山梨醇， 每升所述甲醇中还含有12～14mL的PTM1；所述诱导发酵的条件为：发酵温 度为28℃，发酵液pH值为6.5，维持整个诱导过程中甲醇的终浓度在0.3％， 溶氧量始终为0；在所述诱导发酵的过程中每隔24h加维生素C，使发酵液中 维生素C的终浓度为70～90μg/L，在诱导72h时一次性加入维生素B2，使发 酵液中微生素B2的终浓度为0.8～1.2mM。

优选的，所述发酵培养基为BSM培养基，每升发酵培养基中还含有 4～4.5mLPTM1。

优选的，所述补料培养基中含有质量体积浓度为50％的甘油，每升所述 甘油中还含有10～14mL的PTM1。

优选的，所述补料培养基的流加速率为18～20mL/h/L，流加时间为 3.5～4.5h。

优选的，所述甲醇的流加速率前10小时为2～4g/h/L，10小时后甲醇流加 速率提高到5～6g/h/L。

优选的，所述活化的菌种扩培液接入发酵培养基中的接种量为3～10％。

优选的，所述菌种扩培液的活化步骤包括：将保藏编号为CGMCC No.11626的菌种接种到YPD培养基中，在28～30℃下震荡培养12～16h，震 荡速率为200～250rpm，得到一级种子扩培液；

将所述一级种子扩培液转接到BMGY培养基中，在28～30℃下震荡培养， 震荡速率为200～250rpm，当培养液的OD₆₀₀为6～10时，得到活化的菌种扩>

更优选的，所述保藏编号为CGMCC No.11626的菌种接种到YPD培养基 上的接种量为3～10％。

更优选的，所述一级种子扩培液转接到BMGY培养基中接种量为3～10％。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

毕赤酵母诱导过程通常只单一的流加甲醇作为菌生长和诱导的碳源，过 多的甲醇残余发酵液时会抑制菌的生长，导致细胞死亡，降低目的蛋白的分 泌，但如果甲醇流加量不够，一方面会影响菌的生长，同时也会减少外源蛋 白的分泌。本发明采用双碳源混合流加山梨醇诱导葡萄糖氧化酶的表达，按 一定速率流加甲醇的同时，以20：1(W/W)甲醇：山梨醇的流加速率进行双 碳源补料，毕赤酵母工程菌以山梨醇做为生长的碳源，尽可能多的让甲醇流 向诱导外源蛋白表达途径，提高GOD的分泌，同时也减少了甲醇的用量。本 发明双碳源混合流加山梨醇GOD酶活较只流加甲醇提高约10％，能够进一步 提高GOD产量，下罐酶活达到905U/mL。

本发明诱导过程中以28℃做为诱导温度，控制发酵液的pH值为6.5，进 行诱导表达。结果显示低温有助于GOD表达，28℃分泌的蛋白酶活(905U/mL) 较30℃(633U/mL)提高约10％，且pH为6时酶活(627U/mL)也没有pH为 6.5时的酶活(905U/mL)高。

本发明在诱导过程中，在发酵液中添加了维生素C和维生素B2。相较于 未添加维生素C和维生素B2的酶活(505U/mL)，本发明在诱导过程中添加 了维生素C和维生素B2之后，酶活力达到905U/mL，提高了79.2％。

附图说明

图1为实施例1和对比例1不同方式诱导表达发酵GOD的酶活；

图2为实施例1和对比例3不同温度发酵GOD的酶活；

图3为实施例1和对比例4不同pH值诱导发酵GOD的酶活。

生物保藏说明

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，于2015年11月6日保藏在中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区 北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，生物保藏编号为 CGMCC No.11626。

具体实施方式

本发明提供了一种葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的高密度发酵方法，通过 调整流加甲醇与山梨醇的用量和比例，达到减少甲醇用量，提高葡萄糖氧化 酶酶活的效果。

本发明以葡萄糖氧化酶基因GOD转化的毕赤酵母基因工程菌为出发菌 株，其保藏编号为CGMCCNo.11626，于2015年11月6日保藏在中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心。已在申请号为201510893562.8，专利名称 为葡萄糖氧化酶基因GOD、利用其编码的蛋白、转化的巴斯德毕赤酵母及其 制备的专利中公开。

本发明将活化的上述菌种用于发酵。本发明对菌种的活化方法没有特殊 限定，采用本领域的常规活化方法即可，如先将保藏的菌种接种到YPD培养 基上进行一级活化得到一级种子扩培液，再将一级种子扩培液接种至BMGY 培养基上进行二级活化，得到扩培液。

本发明中，一级活化所用的培养基为YPD固体培养基，将保藏在固体培 养基上的菌种以3～10％的接种量接种到YPD培养基上进行一级活化培养，更优 选接种量为4～5％。本发明一级活化的温度优选为28～30℃，更优选为29℃。 一级活化优选在震荡条件下进行，优选震荡的速率为200～250rpm，更优选为 230～240rpm。在上述条件下震荡培养12～18h，优选为16h后，得到一级种子扩 培液。本发明对一级活化的设备没有特殊要求，优选在一级种子液试管中进 行培养。

本发明中，二级活化所用的培养基为BMGY培养基。将得到的一级种子 扩培液以3～10％的接种量接种到BMGY培养基上进行二级活化培养，更优选接 种量为4～5％。本发明二级活化的温度优选为28～30℃，更优选为29℃。二级 活化优选在震荡条件下进行，优选震荡的速率为200～250rpm，更优选为 230～240rpm。在上述条件下震荡培养12～18h，优选为16h后，培养液的OD₆₀₀为6～10，更优选为10时，得到活化的菌种扩培液。本发明对二级活化的设备>

活化的菌种扩培液用于葡萄糖氧化酶的高密度发酵。将活化的菌种扩培 液接入发酵培养基中进行发酵处理，优选在发酵罐中进行发酵。本发明对发 酵罐的种类和大小没有特殊限定，采用本领域技术人员所熟知的发酵罐类型 即可。

本发明中，优选采用BSM培养基作为发酵培养基。所述发酵培养基中每 升还包括4～4.5mL PTM1，更优选每升含有4.37mL PTM1。用质量浓度为28％ 浓氨水调节发酵培养基的pH值至4.5～5.0，更优选为4.8，使发酵培养基适合于 毕赤酵母工程菌发酵所需的适宜pH值。同时，氨水还可以作为菌种生长的氮 源。

将上述活化的菌种扩培液接种至发酵培养基中进行发酵培养。本发明中 优选菌种扩培液在发酵培养基中的接种量为3～10％，更优选为8～9％。所述发 酵的温度为28～30℃，通气搅拌培养18～24h，更优选为20h。发酵过程中随着 菌株的生长，培养基中的溶氧量由100％逐渐降低，当碳源消耗完后溶氧量迅 速上升。

当溶氧量再度升高至40％以上，优选为50～70％时，流加补料培养基。本 发明所述补料培养基为质量体积浓度为50％的甘油，其中，每升甘油中还含 有10～14mL的PTM1，更优选为12mL的PTM1。本发明所述补料培养基的流加 速率优选为18～20mL/h/L，更优选为18.15mL/h/L。本发明所述补料培养基在上 述流加速率下优选流加3.5～4.5h，更优选为4h。此流加补料培养基的阶段培养 基中的溶氧量为0。当发酵液中的OD₆₀₀值为150～200，更优选为180时，停止>

当碳源消耗完，发酵液的溶氧量再度升高至50～70％以上时，开始流加诱 导培养基。本发明中，所述诱导培养基含有体积比为20:1的甲醇和山梨醇，每 升所述甲醇中还含有12～14mL的PTM1，进行双碳源混合流加。本发明优选甲 醇的流加速率为2～6g/h/L，更优选为前10小时流加速率为2～4g/h/L，10小时后 甲醇流加速率提高到5～6g/h/L。毕赤酵母工程菌优先以山梨醇作为生长的碳 源，尽可能多的让甲醇流向诱导外源蛋白表达途径，提高GOD的分泌，同时 也减少了甲醇的利用量。

本发明中，双碳源混合流加的诱导条件为：发酵温度为28℃，发酵液pH 值为6.5，流加甲醇的过程中维持整个诱导过程中甲醇的终浓度在0.3％，溶氧 量始终为0，诱导葡萄糖氧化酶表达。

本发明在诱导过程中还流加一定量的维生素。优选在诱导过程中，每隔 20～24h加维生素C，更优选为每隔24h加维生素C，使发酵液中维生素C的终浓 度为70～90μg/L，更优选为80μg/L。微生素C作用是防氧化。在诱导60～72h， 优选72h时一次性加入维生素B2，使发酵液中微生素B2的终浓度为

0.8～1.2mM，优选为1mM。葡萄糖氧化酶有两个亚基，每个亚基都有FAD结合 位点，连结一个FAD，FAD是GOD的辅因子。在微生素B2粉末中含有FAD， 在本发明具体实施例中在甲醇诱导后期加入1mM微生素B2，证明了FAD对 GOD表达的影响。

定时取样，监测菌体生长情况及表达的葡萄糖氧化酶活性。本发明中， 优选每隔4h取样一次检测OD600，每隔12h测定表达的葡萄糖氧化酶的活性， 并同时进行SDS～PAGE监测表达量的累积。当葡萄糖氧化酶酶活下降时，发 酵中止。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对 本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下述实施例中，YPD培养基、BMGY培养基、BSM培养基以及PTM1均为 按照本领域技术人员所熟知的培养基配方进行配制。

实施例1

菌株按3％接种量接种到3mL YPD培养基的一级试管种子液中，30℃，250 rpm培养12h后，按3％接种量转接到500mL装液量100mL BMGY二级种子液 摇瓶中，30℃，250rpm培养12h后，培养液OD₆₀₀到10，得到活化的菌种扩培>

将活化的菌种扩培液按10％的接种量接种到10L的发酵罐中，发酵罐初始 装5.6LBSM培养基。初始发酵控制温度28℃，用28％的浓氨水控制发酵液的 pH为5.0，通过调节搅拌转速和通气量控制罐上溶氧在0。待BSM培养基中甘 油耗尽溶氧上升后，以18.15mL/h/L的速率流加含有1.2％(v/v)PTM1的50％(w/v) 甘油，待OD₆₀₀到180时停止流加甘油，饥饿培养30min。

流加含有1.2％(v/v)PTM1的甲醇，前10小时的流加速率为2g/h/L，10小时 后甲醇流加速率提高到6g/h/L。同时按甲醇：山梨醇＝20:1的比例流加山梨醇 进行诱导表达，同时调节搅拌转速和通气量控制溶氧在0。诱导时pH控制为 6.5，每隔24小时加一次VC溶液，使发酵罐中VC的终浓度为80μg/L；在诱导 72h时一次性加入维生素B2溶液，使发酵罐中维生素B2的终浓度为1mM。每 隔4h取样一次检测OD₆₀₀，每隔12h测定表达的葡萄糖氧化酶的活性(采用邻>

表达的葡萄糖氧化酶在10L发酵罐上酶活最高为905U/mL，比酶活最高为 224.5U/g。

实施例2

菌株按5％接种量接种到3mL YPD培养基的一级试管种子液中，30℃，230 rpm培养16h后，按5％接种量转接到500mL装液量100mL BMGY二级种子液 摇瓶中，30℃，230rpm培养16h后，培养液OD₆₀₀到10，得到活化的菌种扩培>

将活化的菌种扩培液按9％的接种量接种到10L的发酵罐中，发酵罐初始 装5.6LBSM培养基。初始发酵控制温度28℃，用28％的浓氨水控制发酵液的 pH为5.0，通过调节搅拌转速和通气量控制罐上溶氧在0。待BSM培养基中甘 油耗尽溶氧上升后，以18.15mL/h/L的速率流加含有1.2％(v/v)PTM1的50％(w/v) 甘油，待OD₆₀₀到180时停止流加甘油，饥饿培养40min。

流加含有1.2％(v/v)PTM1的甲醇，前10小时的流加速率为2g/h/L，10小时 后甲醇流加速率提高到6g/h/L。同时按甲醇：山梨醇＝20:1的比例流加山梨醇 进行诱导表达，同时调节搅拌转速和通气量控制溶氧在0。诱导时pH控制为 6.5，每隔24小时加一次VC溶液，使发酵罐中VC的终浓度为80μg/L；在诱导 72h时一次性加入维生素B2溶液，使发酵罐中维生素B2的终浓度为1mM。每 隔4h取样一次检测OD₆₀₀，每隔12h测定表达的葡萄糖氧化酶的活性(采用邻>

表达的葡萄糖氧化酶在10L发酵罐上酶活最高为897U/mL，比酶活最高为 221U/g。

实施例3

菌株按8％接种量接种到3mL YPD培养基的一级试管种子液中，30℃，200 rpm培养18h后，按8％接种量转接到500mL装液量100mL BMGY二级种子液 摇瓶中，30℃，200rpm培养18h后，培养液OD₆₀₀到10，得到活化的菌种扩培>

将活化的菌种扩培液按10％的接种量接种到10L的发酵罐中，发酵罐初始 装5.6LBSM培养基。初始发酵控制温度28℃，用28％的浓氨水控制发酵液的 pH为5.0，通过调节搅拌转速和通气量控制罐上溶氧在0。待BSM培养基中甘 油耗尽溶氧上升后，以18.15mL/h/L的速率流加含有1.2％(v/v)PTM1的50％(w/v) 甘油，待OD₆₀₀到180时停止流加甘油，饥饿培养50min。

流加含有1.2％(v/v)PTM1的甲醇，前10小时的流加速率为2g/h/L，10小时 后甲醇流加速率提高到6g/h/L。同时按甲醇：山梨醇＝20:1的比例流加山梨醇 进行诱导表达，同时调节搅拌转速和通气量控制溶氧在0。诱导时pH控制为 6.5，每隔24小时加一次VC溶液，使发酵罐中VC的终浓度为80μg/L；在诱导 72h时一次性加入维生素B2溶液，使发酵罐中维生素B2的终浓度为1mM。每 隔4h取样一次检测OD₆₀₀，每隔12h测定表达的葡萄糖氧化酶的活性(采用邻>

表达的葡萄糖氧化酶在10L发酵罐上酶活最高为885U/mL，比酶活最高为 220.5U/g。

对比例1

诱导表达时采用含有1.2％(v/v)PTM1的甲醇进行诱导，其余方法同实施例 1。

表达的葡萄糖氧化酶在10L发酵罐上酶活最高为814.5U/mL，比酶活最高 为202.1U/g。

对比例2

发酵过程中未添加维生素C和维生素B2，其余方法同实施例1。

表达的葡萄糖氧化酶在10L发酵罐上酶活最高为505U/mL，比酶活最高为 125.3U/g。

对比例3

发酵温度调整至30℃，其余方法同实施例1。

表达的葡萄糖氧化酶在10L发酵罐上发酵第144h时酶活为633U/mL，比酶 活最高为157.1U/g。

对比例4

诱导表达时发酵液的pH控制为6.0，其余方法同实施例1。

表达的葡萄糖氧化酶在10L发酵罐酶活为627U/mL，比酶活最高为 155.6U/g。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。