一种乙肝病毒核心抗原检测用抗体IgG和应用

摘要

本发明公开了一种乙肝病毒核心抗原检测用抗体IgG和应用，所述抗体的重链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述抗体的轻链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫技术领域，具体的涉及一种乙肝病毒核心抗原检测用抗体和应用。

背景技术

乙肝是一种世界范围内普遍流行的代表性的病毒传染性疾病。其是一种普通的传染性疾病，被列为第九种致死性原因。全球有超过3亿的慢性乙肝病毒携带者。因此，每年慢性肝炎，肝硬化，肝癌等会夺去成百万的生命。在我国，据了解乙肝病毒携带者约占全人口5-10％。

乙肝病毒(HBV)是一种由病毒蛋白所组成的蛋白，该病毒蛋白包括三种抗原蛋白， HBsAg，HBcAg，和HBeAg。HBV DNA被一种称为核心抗原(HBcAg)的蛋白结构所保护，核心由被认为是表面抗原或S抗原(HBsAg)的包膜蛋白所包被。

乙肝抗体是针对乙型肝炎的抗体，最常见的有三种抗体，即表面抗体(抗-HBs)、E 抗体(抗-HBe)和核心抗体(抗-HBc)。抗-HBs这是乙肝病毒表面抗原(HBsAg)刺激人体免疫系统后产生的抗体，它是一种保护性抗体，也叫中和性抗体。它能中和掉乙肝病毒的感染力，保护人体免受乙肝病毒再度袭击。人感染乙型肝炎病毒后，血清中首先出现乙型肝炎病毒核酸(HBV-DNA)，约1个月后出现乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和e抗原 (HBeAg)，然后出现抗-HBc等。随着病情的逐渐好转，血清中HBV-DNA、HBsAg和HBeAg先后转为阴性，在HBsAg消失后隔一段时间，出现乙型肝炎表面抗体(抗-HBs)。此时抗-HBc 与抗-HBs可同时阳性。由于抗-HBs在血清中持续存在时间较抗-HBc短，因此，经过一段时间后，抗-HBs消失，仅单项抗-HBc阳性。无论是有临床症状的乙型肝炎病人还是没有临床表现的隐性感染者，他们康复后，血清学检查均可表现为单项抗-HBc阳性。

抗-HBe这是乙肝病毒e抗原刺激人体免疫系统后所产生的抗体，它是在标志着乙肝病毒复制的HBeAg消失后才出现的，抗-HBe阳性，说明大多数乙肝病毒的复制停止，随之病情也会由活动变为静止。医生在为慢性乙肝病人治疗时，希望达到的目标之一也是HBeAg 转阴、抗-HBe转阳，这叫“血清HBeAg/抗-HBe转换”，这一转换非常好，病人由免疫耐受转为免疫激活，病毒由活跃、复制(高传染性)而趋于复制的静止(无或有很低传染性)，病情及病变活动也逐渐稳定和静止。

但是，抗-HBe和抗-HBs不同，抗-HBe不是保护性抗体，它的阳性虽说明病毒趋于静止，但不是病毒彻底从体内消失，还要结合HBVDNA来分析。如抗-HBe阳性，而HBVDNA阴性，病毒处于稳定的非复制状态；但抗-HBe阳性，HBVDNA阳性时，仍说明病毒复制，有较高传染性。

抗-HBc这是乙肝核心抗原(HBCAg)刺激人体免疫系统后所产生的抗体。它与抗-HBs 和抗-HBe都不相同。它的阳性是感染过或新近正感染着乙肝病毒，它又分为两种类型抗 -HBcIgM型是新近感染乙肝病毒的标志；抗-HBcIgG型是既往感染乙肝病毒的标志。在我国，有大量的抗-HBc抗体阳性人群，在血液中抗-HBc存在时间很长，可达数十年乃至终生都是抗-HBcIgG型，不会因治疗而转阴，尽管病毒早己消失。抗-HBc本身不是病毒，也不直接反映病毒是否复制，更不提示有多大的传染性。

乙肝病毒的检测通常包括以下方法：

1、肝功能检查：包括胆红素，谷草转氨酶，谷丙转氨酶，白蛋白，球蛋白等。

2、血清学检查：包括HBsAg,Anti-HBs,ABeAg,Anti-HBe,Anti-HBc。即通常所说的“乙肝两对半”，有条件的还可以进行DNA检测。

其中，HBcAg的检测方法常用的有酶联免疫法，胶体金法和化学发光法。现有的 Anti-HBc得使用开壳剂，并且对抗原浓度要求高样本测不准或者灵敏度不高的问题，为了解决上述问题，本发明提供了一种新型抗体。可有效检测核心抗原的量。

发明内容

本发明提供了一种能检测乙肝病毒核心抗原的基因工程抗体。

1、一种乙肝病毒核心抗原检测用抗体IgG，其特征在于：包括一个重链和一个轻链。

2、根据权利要求1所述的抗体，其特征在于：所述重链的可变区氨基酸序列如 SEQ ID NO：1所示。

3、根据权利要求1所述的抗体，其特征在于：所述轻链的可变区氨基酸序列如 SEQ ID NO：2所示。

4、根据权利要求1所述的抗体，其特征在于：所述重链的可变区核苷酸序列如 SEQ ID NO：3所示。

5、根据权利要求1所述的抗体，其特征在于：所述轻链的可变区核苷酸序列如 SEQ ID NO：4所示。

6、根据权利要求2所述的抗体，其特征在于：所述重链可变区的CDR1，CDR2， CDR3的序列如SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7所示。

7、根据权利要求3所述的抗体，其特征在于：所述轻链可变区的CDR1，CDR2， CDR3的序列如SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10所示。

本发明的技术方案的有益效果有：制备了与现有抗体不同的鼠抗乙肝病毒的核心抗原的抗体，并且效价优于现有的鼠抗。

具体实施方式

下文将对本发明作进一步说明。应理解，这些具体描述的实施方案不应构成对本发明范围的限制。

本发明的抗乙肝病毒核心抗原单链抗体具有如上文所述的重链可变区部分、轻

链可变区部分(VH--VL)。

在一个实施方案中，抗乙肝病毒核心抗原单链抗体由本发明所述的重链可变区部分、轻链可变区部分和连接肽组成，其中所述重链可变区部分连接于所述连接肽的N-端或C- 端，而轻链可变区部分相应地连接于所述连接肽的另一端。优选地，所述重链可变区部分连接于所述连接肽的N-端。在本发明单链抗体的一个实施方案中，所述重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

实施例1.抗原免疫过程

1、抗原准备过程：取抗原HBcAg,将抗原稀释至1mg/ml，首次免疫取50μl抗原溶液、50μl 0.01M PBS与150μl弗式完全佐剂；后续免疫取25μl抗原溶液、75μl 0.01M PBS与100μl弗氏不完全佐剂。用两只2ml注射器分别吸取抗原溶液与佐剂，尽可能排掉注射器中的空气并用三通链接，先将抗原推入佐剂中，在反复推动连接好的注射器约20min--40min，直至乳化后的抗原在水中不扩散为止。

2、免疫小鼠过程：选择健康的实验鼠，体表无明显外伤，积极进食，活泼，6至 8周龄的老鼠为宜。采用腹腔注射方法，每14天免疫一次，当免疫两次之后，每次免疫后7天断尾取血检测效价，当效价达到要求时即可停止免疫。

实施例2.细胞融合过程

步骤如下：

2.1准备工作

2.1.1配制HAT培养基，分装DMEM及PEG。

2.1.2手术器械、50ml塑料离心管、50ml玻璃离心管灭菌。

2.1.3提前一周复苏SP2/0细胞，培养并使之处于良好的生长状态。

2.1.4提前一天用HAT培养基采饲养细胞并铺板，融合一只老鼠需要铺5块饲养细胞板。

2.2融合

2.2.1处理SP2/0：吹散，转移至50ml塑料离心管，1000r离心5min，弃上清，加 DMEM，吹散，1000r离心5min，加DMEM至10ml左右，吹散，计数，备用。

2.2.2提取脾细胞

2.2.2.1小鼠眼窝取血，脱颈处死，血样留作阳性对照。

2.2.2.2分离出小鼠脾脏，先用DMEM冲洗脾脏外部，再DMEM冲洗脾脏内部，收集冲洗液并转移至10ml玻璃离心管，计数。

2.2.2.3 1000r离心5min，弃上清，加DMEM吹散并转移至50ml玻璃离心管，将之前处理的SP2/0同时转移至50ml玻璃离心管，1000r离心5min，弃上清，在手背上磨匀。

2.2.2.4 37℃温水浴，1min内加入1ml PEG，边加边摇，静置90s。

2.2.2.5 1min内加1ml DMEM，30s内加1ml DMEM，逐渐加速，加DMEM至40～50ml， 37℃静置10min，800r离心6min，弃上清，加HAT铺板。

2.2.2.6 3天之后半换液，一周之后全换液，换HAT培养基培养。

实施例3.亚克隆挑选过程

3.1观察细胞状态，当96孔内有肉眼可观察到的细胞团后，进行整板检测，挑选阳性较高的孔进行亚克隆，一个阳性孔一块板。

3.2当6孔内有肉眼可观察到的细胞团后，进行亚克隆挑拣，每块板选择12个单个细胞团的孔进行亚克隆挑拣，选择阳性高，细胞状态好的细胞进行下一步亚克隆，至少进行三次亚克隆，最后挑选出阳性高、细胞状态好单克隆细胞团定株。

3.3将挑出来的细胞团转移至24孔培养，待24孔细胞长好后转移至小方瓶培养。

3.4待小方瓶内细胞长好之后，进行冻存及制备腹水。

实施例4.腹水制备过程

4.1提前一周给老鼠注射石蜡，每只老鼠0.5ml。

4.2待小方瓶内细胞长好之后，吹散，转移至10ml玻璃离心管，1000r离心5min，弃上清，加1ml DMEM，计数，按每只老鼠注射0.8×10⁶个细胞，每只老鼠注射0.5ml的量进行稀释，然后给老鼠腹腔注射细胞。

4.3观察老鼠状态，待小鼠腹部明显涨大即可开始抽取腹水并收集。

实施例5.抗体纯化过程

应用ProteinA2SepharoseCL24B亲和层析法纯化单克隆抗体,AKTAexplorer100进行监测。取腹水,在4℃,12000g条件下离心15min,以除去较大的凝块。将1.5gProteinA2SepharoseCL24B干粉用6～7ml三蒸水溶解,再用0.02M,pH7.4的磷酸盐缓冲液(上样缓冲液)浸泡15min,然后装入层析柱中。用10倍柱床体积的上样缓冲液过柱, 流速为1ml/min,pH试纸测试流出液体的pH为7.4。取预处理过的腹水5ml,用上样缓冲液稀释至50ml,用0.45μm的滤膜过滤,上样,流速为1ml/min。用上样缓冲液进行流洗,10倍柱床体积,流速为1ml/min。随后用0.02M,pH4.0的柠檬酸缓冲液洗脱抗体,同时应用 AKTAexplorer100进行监测,当观察到基线开始上升,即出现洗脱峰时,取干净的4ml离心管收集,每收集3ml后,立即用1M,pH9.0的TRis2Hcl缓冲液调整pH值至7.0。收集洗脱液至洗脱峰回到基线后,继续用上样缓冲液平衡5～10倍柱床体积,流速调至1ml/min。再用三蒸水平衡10倍柱床体积。采用SDS不连续丙烯酰胺凝胶电泳(SDS2PAGE),浓缩胶和分离胶浓度分别为120g/L和50g/L,每槽加样10μl,考马斯亮蓝R250染色。具体操作见参考文献萨姆布鲁克J,弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T,等著.金冬雁,黎孟枫,侯云德,等译.分子克隆实验指南[M].第2版.北京:科学出版社,1992,1713-1720.。应用间接ELISA法测定效价。

实施例6.抗体测序过程

将细胞样品反转录后获得cDNA；扩增并获得重链和轻链可变区；克隆至pMD18-T载体，测序；使用IMGT/V-QUEST进行测序结果比对，之后得到全部序列。抗体测序过程是本领域技术人员都得知的技术。具体序列见序列表。

最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本申请所作的举例，是优选的实施例。而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本申请型的保护范围之中。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京京达生物技术有限公司

<120> 一种乙肝病毒核心抗原检测用抗体IgG和应用

<130> 2

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 446

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 1

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala

1 5 1015

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

202530

Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile

354045

Ala Asn Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

505560

Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65707580

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

859095

Ala Arg Arg Gly Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Tyr Ser Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro

180 185 190

Ser Gln Ser Ile Thr Arg Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro

210 215 220

Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro

245 250 255

Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val

260 265 270

Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr

275 280 285

Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala

290 295 300

Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro

340 345 350

Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val

355 360 365

Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly

370 375 380

Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp

405 410 415

Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His

420 425 430

Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

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<211> 214

<212> PRT

<213> Mus musculus

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Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 1015

Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp

202530

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile

354045

Tyr Lys Thr Ser Asn Leu His Thr Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly

505560

Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65707580

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Phe

859095

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Val Ala

100 105 110

Pro Thr Ala Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly

115 120 125

Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile

130 135 140

Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu

145 150 155 160

Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr

180 185 190

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Phe Asn Arg Asn Glu Cys

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<212> DNA

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cctggacatg gccttgagtg gattgcaaat attttacctg gaagtggtag ttctaactac 180

aatgagaagt tcaagggcaa ggccacattc actgcagata catcctccaa cacagcctac 240

atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtgc aagaagggga 300

cgggggtttg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgcagc caaaacaaca 360

gccccatctg tctatccact ggcccctgtg tgtggagata caactggctc ctcggtgact 420

ctaggatgcc tggtcaaggg ttattcccct gagccagtga ccttgacctg gaactctgga 480

tccctgtcca gtggtgtgca caccttccca gctgtcctgc agtctggcct ctacaccctc 540

agcagctcag tgactgtaac ctcgagcacc tggcccagcc agtccatcac ccgcaatgtg 600

gcccacccgg caagcagcac caaggtggac aagaaaattg agcccagagg gcccacaatc 660

aagccctgtc ctccatgcaa atgcccagca cctaacctct tgggtggacc atccgtcttc 720

atcttccctc caaagatcaa ggatgtactc atgatctccc tgagccccat agtcacatgt 780

gtggtggtgg atgtgagcga ggatgaccca gatgtccaga tcagctggtt tgtgaacaac 840

gtggaagtac acacagctca gacacaaacc catagagagg attacaacag tactctccgg 900

gtggtcagtg ccctccccat ccagcaccag gactggatga gtggcaagga gttcaaatgc 960

aaggtcaaca acaaagacct cccagcgccc atcgagagaa ccatctcaaa acccaaaggg 1020

tcagtaagag ctccacaggt atatgtcttg cctccaccag aagaagagat gactaagaaa 1080

caggtcactc tgacctgcat ggtcacggac ttcatgcctg aagacattta cgtggagtgg 1140

accaacaacg ggaaaacaga gctaaactac aagaacactg aaccagtcct ggactctgat 1200

ggttcttact tcatgtacag caagctgaga gtggaaaaga agaactgggt ggaaagaaat 1260

agctactcct gttcagtggt ccacgagggt ctgcacaatc accacacgac taagagcttc 1320

tcccggactc cgggtaaa 1338

<210> 4

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<212> DNA

<213> Mus musculus

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gatattgtga tgacacagac tccatccagt ctgtctgcat cccttggaga cacaattacc 60

atcacttgcc atgccagtca gaacattaat gtttggttaa gctggtacca gcagaaacca 120

ggaaatattc ctaaactatt gatctataag acttccaact tgcacacagg cgtctcatca 180

aggtttagtg gcagtggatc tggaacaggt ttcacattaa ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagacattg ccacttacta ctgtcaacag ggtcaaagtt atccgttcac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggaaataaa acgggctgat gttgcaccaa ctgcatccat cttcccacca 360

tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 420

cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 480

aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 540

ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 600

tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gt 642

<210> 5

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<212> PRT

<213> Mus musculus

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<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

Gly Ser Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 7

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala

1 5 10

<210> 8

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

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Gln Asn Ile Asn Val Trp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln

1 5 10

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 9

Thr Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly Ser

1 5 10

<210> 10

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 10

Glu Ile Lys Arg Ala Asp Val Ala Pro Thr Ala Ser

1 5 10