大麦抗病蛋白MLA10突变体在提高植物对白粉菌抗性中的应用

摘要

本发明涉及大麦抗病蛋白MLA10突变体在提高植物对白粉菌抗性中的应用，所述突变体是MLA10的两个自激活突变体MLA10(F99E)和MLA10(D502V)。本发明首次发现利用PR1启动子驱动大麦MLA10(F99E)和MLA10(D502V)表达的拟南芥能够增强拟南芥对拟南芥白粉菌的抗性，而对植株本身的生长发育影响不大。转基因拟南芥不受限于MLA10的小种专化抗性，将抗菌谱由大麦白粉菌拓展至其它的白粉菌或病原菌，对于农业生产具有重要的指导作用。

说明书

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体地说，涉及大麦抗病蛋白MLA10突变体在提高植物对白粉菌抗性中的应用。

背景技术

植物应对病原微生物的侵袭主要依赖先天性免疫机制防御病原微生物入侵及扩增(Ausubel,2005；Chisholm et al.,2006；Dangl and Jones,2001)。植物的免疫机制主要由两层防御体系构成。第一层次防御系统是由植物细胞膜表面的模式识别受体(patternrecognition receptors,PRRs)识别病原微生物保守的模式分子(microbial-orpathogen-associated molecular patterns,MAMPs or PAMPs)如细菌的鞭毛蛋白、真菌的几丁质等，而引发的抗病反应，称之为PTI(PAMPs-triggered immunity)。第二层次的防御系统是由植物细胞内的抗病蛋白(disease resistance protein,R protein)，主要是NLR类型的抗病蛋白直接或间接的识别病原微生物分泌到植物细胞内的效应因子，引发的效果更为强烈的免疫反应，称之为ETI(effector-triggered immunity)(Dangl et al.,2013；Dodds and Rathjen,2010；Jones and Dangl,2006)，R蛋白介导的抗性往往又称之为小种专化抗性。ETI往往伴随着植物受侵染处的细胞产生大量的过氧化物，并且发生细胞死亡，这种现象又称植物的超敏反应(hypersensitive response,HR)(Dangl et al.,2013)。

植物细胞内的NLRs免疫受体，包含中间的核酸结合结构域(NB-ARC)和C末端富含亮氨酸的结构域(LRR)，以及N末端的CC或TIR结构域，根据R蛋白N端结构域的不同，可以分为两种类型，即N端含有卷曲-螺旋(coiled-coil，CC)结构域的CC-NB-LRR(CNL)和含有TIR结构域的TIR-NB-LRR(TNL)两种类型(Sukarta et al.,2016)。

MLA是在大麦中特有的一类抗病蛋白，介导大麦对大麦白粉菌的小种专化抗性，大麦的小种专化抗性比如含有MLA10基因的大麦小种只能针对含有相应效应蛋白AvrMLA10的大麦白粉菌小种产生抗性，而不能对其他的白粉菌生理小种产生抗性。

R蛋白在引发植物ETI同时，往往伴随着ROS积累、细胞死亡、生长受抑制的现象。如在烟草中瞬时过表达大麦抗病蛋白MLA10及其自激活突变体MLA10(F99E)和MLA10(D502V)能够引发烟草细胞死亡(Bai et al.,2012)。小麦抗病蛋白SR33和SR50也能够在烟草中引发细胞死亡(Cesari et al.,2016)。R蛋白在拟南芥中过表达会影响植株的生长，植株往往表现矮小的表型。例如拟南芥TNL型R基因At2g32140在拟南芥中过表达引起植株矮小的表型(Kato et al.,2014)。R蛋白的获得性功能突变在增强抗病的同时，也能影响植物的生长，造成植株矮小的表型。例如，SNC1是拟南芥中TNL类型的抗病蛋白，其功能获得性突变体snc1表现为植株生长矮小、叶片卷曲等表型(Zhang and Gassmann,2003)。利用突变体snc1EMS诱变构建突变体库，获得一系列调控SNC1功能及表达的基因，从而揭示了SNC1的抗病机制(Huang et al.,2016；Johnson et al.,2017；Wu et al.,2017)。如何获得既具有抗病功能又不影响植株的生长的植物一直是培育新品种的目标。最近有研究发现，TBF1基因上游开放式阅读框元件即uORFs_TBF1(upstream>TBF1序列驱动表达snc1的转基因拟南芥既保持较强的抗病性，又不影响植株的生长(Xu>

拟南芥pen2pad4sag101(pps)三突变体丧失了对大麦白粉菌的非寄主抗性(Lipkaet al.,2005)。将大麦中的抗病蛋白MLA1在拟南芥三突变体pps中表达，依然能够发挥MLA1对大麦白粉菌的小种专化抗性，并且引发植物细胞的超敏反应(Maekawa et al.,2012)。

发明内容

本发明的目的是摆脱大麦抗病蛋白MLA10对大麦白粉菌这种小种专化抗性的限制，拓宽其抗菌谱范围，使其能够对其它的白粉菌或其它病原菌获得抗性的植株，从而指导农业生产。

本发明构思如下：MLA是大麦中特异表达的一类CNL类型的抗病蛋白，介导大麦对大麦白粉菌的小种专化抗性。MLA的小种专化性抗病功能在大麦和拟南芥中相对保守，在拟南芥三突变体pps中过表达MLA1转基因拟南芥表现出对大麦白粉菌的小种专化抗性(Maekawa et al.,2012)。与本底抗性相比，MLA介导的小种专化抗性引发的免疫反应更强烈。但是，MLA介导的小种专化抗性只能针对某一种或几种含有相对应无毒蛋白的大麦白粉菌生理小种发挥免疫作用，导致其应用性的局限。为此，本发明构建了过表达和诱导表达MLA10自激活突变体MLA(F99E)、MLA(D502V)的转基因拟南芥，发现MLA(F99E)、MLA(D502V)在拟南芥中表达能够引发拟南芥植株矮小表型，同时伴随着病程相关基因PR1、PR2的上调表达，引发植物过氧化物积累，叶片细胞死亡。

为了实现本发明目的，本发明提供大麦抗病蛋白MLA10突变体在提高植物对白粉菌抗性中的应用，所述突变体是MLA10的两个自激活突变体MLA10(F99E)和MLA10(D502V)，具体地，是如SEQ ID NO:1所示的大麦抗病蛋白MLA10的第99位苯丙氨酸突变为谷氨酸形成的突变体MLA10(F99E)，或者第502位天冬氨酸突变为缬氨酸所形成的突变体MLA10(D502V)。大麦抗病蛋白MLA10的GenBank登录号为AAQ55541。

突变体MLA10(F99E)是MLA10蛋白的CC结构域第99位苯丙氨酸突变为谷氨酸，突变体MLA10(D502V)是MLA10蛋白的NB-ARC结构域第502位天冬氨酸突变为缬氨酸。

本发明所述植物包括但不限于拟南芥、小麦。

本发明所述白粉菌包括但不限于拟南芥白粉菌(Golovinomyces orontii)、丁香假单胞杆菌(Pseudomonas syringae)、卵菌(Hyaloperonospora arabidopsidis)。

本发明还提供一种大麦抗病蛋白MLA10突变体表达盒，其是由病原菌诱导型启动子及由其驱动的大麦抗病蛋白MLA10突变体的编码基因组成。

优选地，所述病原菌诱导型启动子为拟南芥PR1基因启动子，其核苷酸序列如SEQID NO:2所示。

本发明还提供含有上述表达盒的表达载体。

本发明还提供含有上述表达盒、表达载体的工程菌和转基因细胞系。

本发明还提供一种提高拟南芥对拟南芥白粉菌抗性的方法，包括：

1)使拟南芥含有上述大麦抗病蛋白MLA10突变体MLA10(F99E)和/或MLA10(D502V)表达盒；或

2)使拟南芥表达大麦抗病蛋白MLA10突变体MLA10(F99E)和/或MLA10(D502V)。

在本发明的一个具体实施方式中，所述方法包括以下步骤：

S1、构建大麦抗病蛋白MLA10突变体MLA10(F99E)和/或MLA10(D502V)表达盒；

S2、将上述表达盒插入改造的表达载体cTAPi(图4)上，得到重组质粒；

S3、将上述重组质粒导入拟南芥中，筛选阳性转基因植株。

步骤S2所述改造的表达载体cTAPi是指去掉原始载体cTAPi的35S启动子，然后将除草剂BASTA抗性换成卡那霉素抗性，并在目标基因后面加上3HA标签得到的。改造的表达载体cTAPi的结构如图4所示。含有MLA10(F99E)表达盒的重组质粒的结构如图5所示，含有MLA10(D502V)表达盒的重组质粒的结构如图6所示。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

利用PR1启动子驱动大麦MLA10(F99E)和MLA10(D502V)表达的拟南芥能够增强拟南芥对拟南芥白粉菌的抗性，而对植株本身的生长发育影响不大。转基因拟南芥MLA10(F99E)和MLA10(D502V)不受限于MLA10的小种专化抗性，将抗菌谱由大麦白粉菌拓展至其它的白粉菌或病原菌，对于农业生产具有重要的指导作用。

附图说明

图1为本发明实施例1中过表达MLA10(D502V)引发拟南芥植株矮小及PR基因表达量上升；其中，A：转基因植株表型分析。35S:MLA10(D502V)-3HA#17-3、35S:MLA10(D502V)-3HA#19-1及野生型Col-0生长3周表型，标尺为1cm；B：半定量PCR检测图(A)中转基因MLA10(D502V)的表达量；C：Real-time PCR检测图(A)中MLA10(D502V)、PR1和PR2基因的表达。

图2为本发明实施例2中在拟南芥中表达MLA10(F99E)、MLA10(D502V)造成拟南芥矮小表型，引发PR基因上调表达，造成过氧化物积累及细胞死亡；其中，A：pER8:MLA10(F99E)-HA和pER8:MLA10(D502V)-HA转基因植株表型分析。分别在1/2MS培养基和添加10μM雌二醇的1/2MS培养基中生长7天的野生型和转基因植株表型，标尺为1cm；B：WesternBlotting检测图A中MLA10(F99E)和MLA10(D502V)的蛋白水平；C：Real-time PCR检测图A中添加10μM雌二醇的1/2MS培养基中转基因植株及野生型植株中PR1和PR2基因表达量；D：DAB和台盼蓝染色检测雌二醇诱导下pER8:MLA10(F99E)-HA、pER8:MLA10(D502V)-HA及野生型Col-0子叶中过氧化物的积累量及细胞死亡情况，标尺为1mm。

图3为本发明实施例3中MLA10(F99E)和MLA10(D502V)能够增强拟南芥对拟南芥白粉菌的抗性；其中，A：转基因拟南芥接菌表型分析。pps、PR1:MLA10(F99E)-HA(pps)和PR1:MLA10(D502V)-HA(pps)在短日照条件下生长28天，接种G.orontii 8天后表型，标尺为1cm；B：图A接菌后的叶片白粉菌生长情况，标尺为1cm；C：显微镜观察图B中拟南芥经DAB和考马斯亮蓝染色后叶片菌丝的生长状况及过氧化物积累情况，标尺为100μm。

图4为本发明改造的表达载体cTAPi-native promoter-GW-3HA的质粒图谱。

图5为本发明实施例3中重组表达载体PR1:MLA10(F99E)-HA的质粒图谱。

图6为本发明实施例3中重组表达载体PR1:MLA10(D502V)-HA的质粒图谱。

图7为本发明实施例1中原始载体:cTAPi-3HA的质粒图谱。

图8为本发明实施例1中重组表达载体CTAPi-MLA10(F99E)-3HA的质粒图谱。

图9为本发明实施例1中重组表达载体cTAPi-MLA10(D502V)-3HA的质粒图谱。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1-3中构建重组质粒所用的引物序列信息如表1所示。

实施例1构建35S启动子驱动过表达MLA10(F99E)和MLA10(D502V)的转基因拟南芥株系

本实施例中通过构建35S启动子分别驱动过表达MLA10(F99E)和MLA10(D502V)的转基因拟南芥株系，分别获得了17个和29个转基因株系。

具体地，利用GATEWAY的载体构建方法，将人工合成的MLA10(F99E)和MLA10(D502V)基因分别克隆并连接至目的载体CTAPi-GW-3HA(质粒图谱如图7所示，即CTAPi-3xHA)，得到重组表达载体CTAPi-MLA10(F99E)-3HA(图8)和CTAPi-MLA10(D502V)-3HA(图9)。

然后分别转化农杆菌感受态GV3101，利用浸花法，侵染拟南芥，利用除草剂BASTA进行筛选得到阳性拟南芥转基因植株。

35S:MLA10(F99E)-3HA和35S:MLA10(D502V)-3HA过表达植株与野生型相比有50％的T2代植株表现出矮小的表型。然而，这种矮小表型在传代的过程中逐渐消失，其中，35S:MLA10(F99E)-3HA所有株系表型均在T3代全部丢失，目前仅获得2个T3代表型较稳定的35S:MLA10(D502V)-3HA转基因拟南芥株系，分别是35S:MLA10(D502V)-3HA#17-3和35S:MLA10(D502V)-3HA#19-1，它们均表现为矮小表型(图1A)。通过半定量PCR对转基因植株进行检测，发现与对照Col-0相比，35S:MLA10(D502V)-3HA#17-3和35S:MLA10(D502V)-3HA#19-1植株中的MLA10基因在RNA水平有明显积累(图1B)。Real-time PCR结果表明，35S:MLA10(D502V)-3HA#17-3和35S:MLA10(D502V)-3HA#19-1中病程相关基因PR1和PR2的表达量也有明显上调(图1C)。

以上实验结果表明，MLA10(D502V)过表达能够造成拟南芥矮小表型，但是，其表型不稳定，容易在下一代的转基因植株中减弱或丢失。MLA10(D502V)过表达能够引发病程相关基因PR1和PR2的上调表达。

实施例2构建雌二醇诱导型启动子驱动表达MLA10(F99E)和MLA10(D502V)的转基因拟南芥株系

由于35S启动子分别驱动过表达MLA10(F99E)和MLA10(D502V)的转基因拟南芥株系表型不稳定，且传代过程中表型容易消失。为了进一步确定MLA10(F99E)和MLA10(D502V)在拟南芥中表达能够引发矮小表型，我们进一步利用雌二醇诱导型启动子，驱动MLA10(F99E)和MLA10(D502V)在拟南芥中表达，构建诱导型表达MLA10(F99E)和MLA10(D502V)转基因拟南芥株系pER8:MLA10(F99E)-HA和pER8:MLA10(D502V)-HA，分别获得了47和53个转基因拟南芥株系。

具体地，利用酶切连接的载体构建方法，将pER8载体利用XholⅠ与SpeⅠ双酶切，酶切后回收的载体片段分别与MLA10(F99E)-HA和MLA10(D502V)-HA PCR片段连接，得到重组表达载体pER8:MLA10(F99E)-HA和pER8:MLA10(D502V)-HA，然后分别转化农杆菌感受态GV3101，利用浸花法，侵染拟南芥，利用潮霉素Hygromycin进行筛选得到阳性拟南芥转基因植株。

其中有11个pER8:MLA10(F99E)-HA和17个pER8:MLA10(D502V)-HA转基因株系在含有雌二醇的1/2MS培养基上表现出矮小表型。与35S:MLA10(F99E)-3HA和35S:MLA10(D502V)-3HA转基因拟南芥相比，这两类转基因植株的表型相对较稳定。T3代纯合的pER8:MLA10(F99E)-HA#8和pER8:MLA10(D502V)-HA#1在添加雌二醇的培养基上，均有明显的矮小表型(图2A)。在正常1/2MS培养基上，转基因拟南芥表型与野生型相比无明显差异，但在雌二醇诱导培养基中，转基因拟南芥植株表现为叶片变小、卷缩，叶柄变短等表型。Westernblotting检测结果表明在添加雌二醇的1/2MS培养基上pER8:MLA10(F99E)-HA#8和pER8:MLA10(D502V)-HA#1有明显的MLA10(F99E)和MLA10(D502V)蛋白表达，而在不含雌二醇的1/2MS培养基上时，检测不到MLA10(F99E)和MLA10(D502V)表达(图2B)。以上实验结果进一步表明了MLA10(F99E)和MLA10(D502V)在拟南芥中表达能够造成拟南芥植株矮小的表型。

Real-time PCR对雌二醇诱导培养基上转基因拟南芥中的PR基因表达量检测发现，pER8:MLA10(F99E)-HA#8和pER8:MLA10(D502V)-HA#1中病程相关基因PR1和PR2的表达量与野生型相比有明显的上升(图2C)。pER8:MLA10(F99E)-HA#8和pER8:MLA10(D502V)-HA#1在正常培养基上生长7天，表型正常，与野生型相比，没有明显区别，但将其转移至含有雌二醇的培养基上继续生长7天，发现植株除了生长延滞之外，其叶片特别是子叶出现变黄、干枯等表型，我们利用DAB染色和台盼蓝对其子叶进行染色，发现pER8:MLA10(F99E)-HA#1和pER8:MLA10(D502V)-HA#8中有明显过氧化物积累及细胞死亡现象(图2D)。

上述实验结果表明，MLA10(F99E)和MLA10(D502V)在拟南芥中表达，不仅能够影响拟南芥的正常生长，致使产生矮小表型，同时也能诱导拟南芥PR基因的上调表达，引发植物产生过氧化物积累，细胞死亡等反应。这些反应与植物在抵抗外界病原菌时所引发的HR反应十分相似。MLA10作为一个抗病蛋白，介导大麦对含有无毒效应因子AvrMLA10的大麦白粉菌生理小种的小种专化抗性。那么，MLA10(F99E)和MLA10(D502V)作为MLA10的两个功能获得性突变体，是否能够在拟南芥中介导对拟南芥白粉菌的抗病反应。接下来，我们对生长28天的pER8:MLA10(F99E)-HA#8和pER8:MLA10(D502V)-HA#1外源喷施雌二醇诱导MLA10(F99E)和MLA10(D502V)表达，并接种拟南芥白粉菌Golovinomyces orontii，观察抗病表型。但是经蛋白检测(Wstern Blotting法)发现体外喷施雌二醇诱导MLA10(F99E)和MLA10(D502V)表达效果不明显。

实施例3构建PR1启动子驱动表达MLA10(F99E)和MLA10(D502V)的转基因拟南芥株系

很多报道表明PR1在拟南芥白粉菌的诱导下，表达量显著上升(Wu et al.,2015；Zhao et al.,2015)。为了确定MLA10(F99E)和MLA10(D502V)在拟南芥中是否介导拟南芥对白粉菌的抗性，我们构建了PR1的启动子驱动MLA10(F99E)和MLA10(D502V)表达的转基因拟南芥株系PR1:MLA10(F99E)-HA和PR1:MLA10(D502V)-HA，并接种拟南芥白粉菌Golovinomyces orontii，观察其抗病情况。

我们克隆了拟南芥PR1基因上游2112bp启动子序列(SEQ ID NO:2)，分别与MLA10(F99E)和MLA10(D502V)基因序列融合，在高感拟南芥白粉菌三突变体(pen2pad4sag101,pps)背景下，构建了PR1启动子驱动表达MLA10(F99E)和MLA10(D502V)的转基因拟南芥株系，即PR1:MLA10(F99E)-HA(pps)和PR1:MLA10(D502V)-HA(pps)。

具体地，利用酶切连接的载体构建方法，将cTAPi-native promoter-GW-3HA载体(即改造的表达载体cTAPi，自命名为CTAPi-native promoter-3xHA kan，图4)利用XbalⅠ与SpeⅠ双酶切，酶切后回收的载体片段分别与PR1-MLA10(F99E)和PR1-MLA10(D502V)PCR片段利用无缝连接酶连接，得到重组表达载体PR1:MLA10(F99E)-HA(即CTAPi-P PR1：MLA10(F99E)-3xHA kan，图5)和PR1:MLA10(D502V)-HA(即CTAPi-P PR1：MLA10(D502V)-3xHAkan，图6)，然后分别转化农杆菌感受态GV3101，利用浸花法，侵染拟南芥三突变体pps，在含有100μM的卡那霉素的1/2MS培养基上进行筛选，获得转基因拟南芥阳性植株。。

其中，PR1-MLA10(F99E)和PR1-MLA10(D502V)PCR片段设计引物时需将PR1启动子反向引物PR1-R 5’端连接MLA10正向序列，MLA10的正向序列5’端连接PR1-R的序列，利用搭建的方法，设计两轮PCR，扩增得到PR1-MLA10(F99E)和PR1-MLA10(D502V)PCR片段。

观察生长28天T2代的转基因拟南芥表型，发现有10％左右的植株与pps相比，表现为类似于35S:MLA10(D502V)-3HA的矮小表型，其它转基因植株大小与对照相比无明显区别。我们将正常大小的转基因植株接种拟南芥白粉菌Golovinomyces orontii，发现接菌3天后，PR1:MLA10(F99E)-HA(pps)和PR1:MLA10(D502V)-HA(pps)叶片表现出脱水症状，8天后观察其表型发现转基因拟南芥PR1:MLA10(F99E)-HA(pps)、PR1:MLA10(D502V)-HA(pps)表现叶片死亡干枯，白粉菌生长受到抑制，表现为抗病表型(图3A、B)。

对接菌后的拟南芥叶片进行DAB染色和考马斯亮蓝染色观察叶片中过氧化物的积累及菌丝的生长情况。实验发现对照pps的叶片表面有大量白粉菌菌丝及其孢子密布，几乎无过氧化物的积累。而转基因拟南芥MLA10(F99E)、MLA10(D502V)白粉菌的菌丝的生长受到明显的抑制，仅有少量菌丝及孢子，而且在受菌丝侵染的叶片细胞有过氧化物的积累(图3C)。从以上实验结果可以看出，转基因拟南芥植株大小正常，并且接种拟南芥白粉菌时，转基因拟南芥能够迅速启动对拟南芥白粉菌的抗病反应，引发ROS积累及细胞死亡等反应，抑制白粉菌生长繁殖，增强对拟南芥白粉菌的抗性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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序列表

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 大麦抗病蛋白MLA10突变体在提高植物对白粉菌抗性中的应用

<130> KHP171117219.0

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 951

<212> PRT

<213> 大麦( Hordeum vulgare L. )

<400> 1

Met Asp Ile Val Thr Gly Ala Ile Ser Asn Leu Ile Pro Lys Leu Gly

1 5 1015

Glu Leu Leu Thr Glu Glu Phe Lys Leu His Lys Gly Val Lys Lys Asn

202530

Ile Glu Asp Leu Gly Lys Glu Leu Glu Ser Met Asn Ala Ala Leu Ile

354045

Lys Ile Gly Glu Val Pro Arg Glu Gln Leu Asp Ser Gln Asp Lys Leu

505560

Trp Ala Asp Glu Val Arg Glu Leu Ser Tyr Val Ile Glu Asp Val Val

65707580

Asp Lys Phe Leu Val Gln Val Asp Gly Ile Lys Ser Asp Asp Asn Asn

859095

Asn Lys Phe Lys Gly Leu Met Lys Arg Thr Thr Glu Leu Leu Lys Lys

100 105 110

Val Lys His Lys His Gly Ile Ala His Ala Ile Lys Asp Ile Gln Glu

115 120 125

Gln Leu Gln Lys Val Ala Asp Arg Arg Asp Arg Asn Lys Val Phe Val

130 135 140

Pro His Pro Thr Arg Thr Ile Ala Ile Asp Pro Cys Leu Arg Ala Leu

145 150 155 160

Tyr Ala Glu Ala Thr Glu Leu Val Gly Ile Tyr Gly Lys Arg Asp Gln

165 170 175

Gly Leu Met Arg Leu Leu Ser Met Glu Gly Asp Asp Ala Ser Asn Lys

180 185 190

Arg Leu Lys Lys Val Ser Ile Val Gly Phe Gly Gly Leu Gly Lys Thr

195 200 205

Thr Leu Ala Arg Ala Val Tyr Glu Lys Ile Lys Gly Asp Phe Asp Cys

210 215 220

Arg Ala Phe Val Pro Val Gly Gln Asn Pro Asp Met Lys Lys Val Leu

225 230 235 240

Arg Asp Ile Leu Ile Asp Leu Gly Asn Pro His Ser Asp Leu Ala Met

245 250 255

Leu Asp Ala Asn Gln Leu Ile Lys Lys Leu His Glu Phe Leu Glu Asn

260 265 270

Lys Arg Tyr Leu Val Ile Ile Asp Asp Ile Trp Asp Glu Lys Leu Trp

275 280 285

Glu Gly Ile Asn Phe Ala Phe Ser Asn Arg Asn Asn Leu Gly Ser Arg

290 295 300

Leu Ile Thr Thr Thr Arg Ile Val Ser Val Ser Asn Ser Cys Cys Ser

305 310 315 320

Ser Asp Gly Asp Ser Val Tyr Gln Met Glu Pro Leu Ser Val Asp Asp

325 330 335

Ser Arg Met Leu Phe Tyr Lys Arg Ile Phe Pro Asp Glu Asn Ala Cys

340 345 350

Ile Asn Glu Phe Glu Gln Val Ser Arg Asp Ile Leu Lys Lys Cys Gly

355 360 365

Gly Val Pro Leu Ala Ile Ile Thr Ile Ala Ser Ala Leu Ala Gly Asp

370 375 380

Gln Lys Met Lys Pro Lys Cys Glu Trp Asp Ile Leu Leu Arg Ser Leu

385 390 395 400

Gly Ser Gly Leu Thr Glu Asp Asn Ser Leu Glu Glu Met Arg Arg Ile

405 410 415

Leu Ser Phe Ser Tyr Ser Asn Leu Pro Ser Asn Leu Lys Thr Cys Leu

420 425 430

Leu Tyr Leu Cys Val Tyr Pro Glu Asp Ser Met Ile Ser Arg Asp Lys

435 440 445

Leu Ile Trp Lys Trp Val Ala Glu Gly Phe Val His His Glu Asn Gln

450 455 460

Gly Asn Ser Leu Tyr Leu Leu Gly Leu Asn Tyr Phe Asn Gln Leu Ile

465 470 475 480

Asn Arg Ser Met Ile Gln Pro Ile Tyr Asn Tyr Ser Gly Glu Ala Tyr

485 490 495

Ala Cys Arg Val His Asp Met Val Leu Asp Leu Ile Cys Asn Leu Ser

500 505 510

Asn Glu Ala Lys Phe Val Asn Leu Leu Asp Gly Thr Gly Asn Ser Met

515 520 525

Ser Ser Gln Ser Asn Cys Arg Arg Leu Ser Leu Gln Lys Arg Asn Glu

530 535 540

Asp His Gln Ala Arg Pro Phe Thr Asp Ile Lys Ser Met Ser Arg Val

545 550 555 560

Arg Ser Ile Thr Ile Phe Pro Ser Ala Ile Glu Val Met Pro Ser Leu

565 570 575

Ser Arg Phe Asp Val Leu Arg Val Leu Asp Leu Ser Arg Cys Asn Leu

580 585 590

Gly Glu Asn Ser Ser Met Gln Leu Asn Leu Lys Gly Val Gly His Leu

595 600 605

Thr His Leu Arg Tyr Leu Gly Leu Glu Gly Thr Asn Ile Ser Lys Leu

610 615 620

Pro Ala Glu Ile Gly Lys Leu Gln Phe Leu Glu Val Leu Asp Leu Glu

625 630 635 640

Asn Asn His Asn Leu Lys Glu Leu Pro Ser Thr Val Cys Asn Phe Arg

645 650 655

Arg Leu Ile Tyr Leu Asn Leu Val Gly Cys Gln Val Val Pro Pro Val

660 665 670

Gly Val Leu Gln Asn Leu Thr Ser Ile Glu Val Leu Ser Gly Ile Leu

675 680 685

Val Ser Leu Asn Ile Ile Ala Gln Glu Leu Gly Asn Leu Lys Arg Leu

690 695 700

Arg Glu Leu Asn Ile Leu Phe Asn Asp Gly Ser Leu Asp Phe Tyr Glu

705 710 715 720

Gly Phe Val Lys Ser Leu Cys Asn Leu His His Ile Glu Ser Leu Ile

725 730 735

Phe Asp Cys Lys Ser Ile Glu Thr Ser Ser Phe Glu Leu Met Asp Leu

740 745 750

Leu Gly Glu Arg Trp Ile Pro Pro Val His Leu Arg Glu Phe Lys Ser

755 760 765

Phe Met Pro Ser Gln Leu Ser Ala Leu Arg Gly Trp Ile Gln Arg Asp

770 775 780

Pro Ser His Leu Ser Asn Leu Ser Glu Leu Thr Leu Thr Ser Val Lys

785 790 795 800

Glu Val Gln Gln Asp Asp Val Val Ile Ile Gly Ala Leu Ser Ser Leu

805 810 815

Arg Arg Leu Cys Ile Arg Ser Thr His Gln Thr Gln Arg Leu Leu Val

820 825 830

Ile His Ala Asp Gly Phe Arg Cys Ile Val Tyr Phe Gln Leu Asp Cys

835 840 845

Gly Ser Ala Thr Gln Ile Leu Phe Glu Pro Gly Ala Leu Pro Arg Ala

850 855 860

Glu Val Val Ala Phe Ser Leu Ala Val Arg Val Ala Lys Glu Asp Gly

865 870 875 880

Asn Cys Gly Phe Asp Leu Gly Leu Gln Gly Asn Leu Phe Ser Leu Arg

885 890 895

Gln Phe Val Ser Val Ile Ile Tyr Cys Gly Gly Ala Arg Val Gly Glu

900 905 910

Ala Lys Glu Ala Glu Ala Ala Val Arg Arg Ala Leu Asp Ala His Pro

915 920 925

Asn His Pro Gln Ile Ala Ile Phe Met His Pro Pro Ile Ala Glu Gly

930 935 940

Ala Gln Asp Asp Asp Leu Met

945 950

<210> 2

<211> 2112

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 2

taggcagcaa gtcatttaca aagtaaaaaa tttctccatg catgtaacct tcatttatca 60

ttcattttag tttgtaactt tttattagat tttgatcaag ttaaccgcta aaatctcatt 120

ttatccgttc gcattaaagt taaatagatt gctgacatat tttaaatcta atagaaaatg 180

ccatctggca aataaacaac ggacacgatt ttaaactaaa ttttaccaaa aagaaaaaac 240

ttatacgact tttcttgctt agaagtcttt gcattgttaa tagattgttg aaaaggttta 300

ttcattactt tcatgcagag agataacata tcatcgcgtg gggatttatt caatccaaag 360

aaaagcttcc aaaaactgac tttgcttcat gaaacactca ctctaatttg cttcatcaat 420

cttaggactg acttttccaa atcaatatgc gaactatctt ctaatttaca ttggtttcgt 480

gttttttcga aaggagacaa ctatcttttt aaaagctttt ctatagtgtg atgacaaaaa 540

aaaaatgtaa ttgttagttg caaaagaaaa gtacaatagt cttttctagt tttgagagtt 600

taaggtttat gatcggaact tagagtttaa atttaaacta ttttgttaat ttttggactg 660

ataacagttt ttttttgaaa atattgaaac gttgtttacc taatgtaaca tgttattcta 720

cttaaattac tttatatttt aataacatat aatattgaat aggatatcat aggatattat 780

tacgtaataa tatcctatgg tgtcatttta taagttagca caagcttgtt ttaacttata 840

aaatgattct ccctccatat aaaaaagttt gattttatag aatgtttata ccgattaaaa 900

aaataataat gcttagttat aaattactat ttattcatgc taaactattt ctcgtaacta 960

ttaaccaata gtaattcatc aaattttaaa attctcaatt aattgattct tgaaattcat 1020

aaccttttaa tattgattga taaaaatata cataaactca atctttttaa tacaaaaaaa 1080

ctttaaaaaa tcaatttttc tgattcggag ggagtatatg ttattgctta gaatcacaga 1140

ttcatatcag gattggaaaa ttttaaagcc agtgcatatc agtagtcaaa attggtaaat 1200

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gtatacaatg tcaatcggtg atcttttttt tttttttttt tttttttttt ctttttggat 1380

aaatctcaat gggtgatcta ttgactgttt ctctacgtca ctattttact tacgtcatag 1440

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atatgcatga aacactaaga aacaaataat tcttgacttt ttttctttta tttgaaaatt 1560

gactgtagat ataaactttt attttttctg actgtaaata taatcttaat tgccaaactg 1620

tccgatacga tttttctgta ttatttacag gaagatatct tcaaaacatt ttgaatgaag 1680

taatatatga aattcaaatt tgaaatagaa gacttaaatt agaatcatga agaaaaaaaa 1740

aacacaaaac aactgaatga catgaaacaa ctatatacaa tgtttcttaa taaacttcat 1800

ttagggtata cttacatata tactaaaaaa atatatcaac aatggcaaag ctaccgatac 1860

gaaacaatat taggaaaaat gtgtgtaagg acaagattga caaaaaaata gttacgaaaa 1920

caacttctat tcatttggac aattgcaatg aatattacta aaatactcac acatggacca 1980

tgtatttaca aaaacgtgag atctatagtt aacaaaaaaa aaaagaaaaa aatagttttc 2040

aaatctctat ataagcgatg tttacgaacc ccaaaatcat aacacaacaa taaccattat 2100

caacttagaa aa 2112