细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(p16)的SRM/MRM测定

摘要

提供了直接在生物样品中定量细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A蛋白质(p16)的方法，所述生物样品通过SRM/MRM质谱已经固定在福尔马林中。采用例如Liquid Tissue试剂和方案由生物样品制备蛋白质样品，并通过在蛋白质样品中定量来自p16的至少一个片段肽来定量所得样品中的p16蛋白质。肽能以修饰的或未修饰的形式进行定量。p16肽的修饰形式的一个实例为肽序列内的酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸和/或其他氨基酸残基的磷酸化。

说明书

本申请要求于2015年5月22日提交的临时申请No.62/165,614的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

背景技术

人们使用一批杀伤正在生长和分裂的细胞并以多种方式发挥功能的治疗剂来治疗癌症。常见的化疗剂集合已被单独或联合使用了数十年，且该常见的试剂集合已成为临床肿瘤学实践中传统且常规的癌症治疗手段。这些传统的化疗剂通过杀伤所有快速分裂的细胞来发挥作用，快速分裂是大多数癌细胞的主要特性之一。然而，这些试剂也杀伤正在生长的正常细胞，因此这些试剂不被视作杀伤癌细胞的“靶向”方法。近年来，已开发出大量仅选择性靶向癌细胞的癌症治疗剂，其中这些治疗剂特异性攻击仅由癌细胞表达而正常细胞不表达的蛋白质，或在癌细胞中表达比在正常细胞中表达更多的蛋白质。这种方式被视癌症治疗的“靶向”方法。最近，以“靶向”方式杀伤癌细胞的另一种方法是特异性调控免疫系统以增强癌症患者的免疫系统杀伤癌细胞的能力。

p16蛋白质最近在癌症治疗决策中愈发重要。在正常细胞中，p16蛋白质与细胞周期蛋白依赖性激酶4和6(CDK4/6)蛋白质复合物键合并失活，从而导致细胞周期停滞。通过诸如纯合基因缺失、促进子甲基化反应(转录抑制)或失活点突变的机制使p16蛋白质丧失表达，可通过CDK4/6蛋白质复合物的失调激活来控制肿瘤生长。众所周知，人类乳头状瘤病毒(HPV)的某些亚型感染会导致宫颈癌和头颈癌的发展，这些疾病的诊断标志之一就是p16蛋白质的高表达。已观察到，和HPV/p16阴性肿瘤相比，具有高表达p16的头颈癌则有良好的预后。由于这个原因，目前正在开发靶向CDK4/6途径的许多治疗剂，并有令人信服的证据表明测量p16水平可以预测这些靶向药剂的临床结果。

下文所述的方法提供了基于定量蛋白质组学的选择反应监测(SRM)测定，该测定提供了p16蛋白质水平的相关测量。具体而言，所述方法提供了质谱分析法，其定量来自癌症患者的福尔马林固定组织中的p16，并能够改善用于癌症治疗的治疗决策。

提供了从p16蛋白质的序列衍生的特定肽，也称为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A和CDKN2A，并且在本文中称为p16。针对每种肽的肽序列和片段/过渡离子在基于质谱的选择反应监测(SRM)中特别有用，其也可称为多反应监测(MRM)测定，在本文中称为SRM/MRM。描述了使用肽进行p16蛋白质的SRM/MRM定量分析。

所述SRM/MRM测定可用于测量来自p16蛋白质的一种或多种特定肽的相对或绝对定量水平，并因此提供了通过质谱测量从生物样品获得的给定蛋白质制剂中的p16蛋白质含量的方法。p16的测定可用于帮助识别或确认组织中潜在的HPV感染。

更具体地，SRM/MRM测定可直接测量由从诸如福尔马林固定的癌症患者组织的患者组织样品取得的细胞制备的复杂蛋白质裂解物样品中的那些肽。由福尔马林固定的组织制备蛋白质样品的方法描述在美国专利第7,473,532号中，其内容通过引用全文纳入本文。美国专利号7,473,532中描述的方法可使用获自表达病理学公司(Expression PathologyInc.)(马里兰州罗克维尔)的Liquid Tissue试剂和方案方便地进行。

来自癌症患者组织的最广泛且可方便获得的组织形式为福尔马林固定的石蜡包埋的组织。手术切除的组织的甲醛/福尔马林固定是迄今为止在全世界保存癌症组织样品的最常见方法，并且是用于标准病理学实践的公认惯例。甲醛水溶液被称为福尔马林。“100％”福尔马林由甲醛在水中的饱和溶液(约40体积％或37重量％)组成，其含有少量用于限制氧化和聚合程度的稳定剂，通常为甲醇。保藏组织的最常用方式是将整个组织在通常称为10％中性缓冲福尔马林的甲醛水溶液中长时间(8小时至48小时)浸泡，接着在室溫下将固定的整个组织包埋在石蜡中以便长期储存。因此，分析福尔马林固定的癌症组织的分子分析方法将是用于分析癌症患者组织的最被接受且大量利用的方法。

SRM/MRM测定的结果可用于关联自其中收集并保藏组织(生物样品)的患者或受试者的具体组织样品(例如癌症组织样品)内的p16蛋白质的准确且精确的定量水平。这不仅提供关于癌症的诊断和预后信息，而且容许医师或其它医疗专业人员来更加准确地确定用于患者的适当疗法。提供关于在患病组织中或在其他患者样品中蛋白质表达水平的诊断、预后和治疗重要信息的这一测定称为伴随诊断测定。例如，这一测定可设计用于诊断癌症的阶段或程度，并确定患者最可能应答的治疗剂。

发明内容

本发明所述的测量来自p16蛋白质的特定未修饰的肽的相对或绝对水平并且可测量来自p16蛋白质的特定修饰的肽的绝对或相对水平。修饰的示例包括可能在这些肽上存在的磷酸化氨基酸残基和糖基化氨基酸残基。

p16蛋白质的相对定量水平可通过SRM/MRM方法确定，例如通过比较不同样品中单个p16肽的SRM/MRM特征峰面积(signature peak area)(例如，特征峰面积或积分的片段离子强度)来确定。或者，可以比较多个p16特征肽的多个SRM/MRM特征峰面积，其中每个肽具有其自身的特异性SRM/MRM特征峰，以确定一种生物样品中的相对p16蛋白质含量和一种或多种额外或不同的生物样品中的p16蛋白质含量。以这种方式，在相同实验条件下通过两个或多个生物样品确定相对于相同p16肽的来自p16蛋白质的特定肽的含量，并从而确定p16蛋白质的含量。另外，确定单一样品内来自p16蛋白质的一种或多种给定肽的相对定量的方法可以是通过SRM/MRM方法比较该肽的特征峰面积与同一来自生物样品的蛋白质制备物中的来自不同的一种或多种蛋白质的其他和不同的一种或多种肽的特征峰面积。以这种方式，在相同的样品内确定彼此相对的来自p16蛋白质的特定肽的量，并从而确定p16蛋白质的量。

这些方法允许定量来自p16蛋白质的单个肽或多肽相对样品之间和样品内的另一个肽或多肽的量，其中由特征峰面积确定的量是彼此相对的，而与来自生物样品的蛋白质制剂中p16肽的绝对重量：体积或重量：重量的含量无关。将不同样品之间单个特征峰面积的相对定量数据标准化至每种样品的所分析蛋白质的含量。相对定量可跨越来自单一样品中同时存在的多种蛋白质和p16蛋白质的许多肽和/或跨越许多样品进行，以了解一种肽/蛋白质相对于其他肽/蛋白质的相对蛋白质含量。

p16蛋白质的绝对定量水平通过例如SRM/MRM方法确定，通过该方法将来自在一种生物样品中的p16蛋白质的单个肽的SRM/MRM特征峰面积与“掺入”的内标物的SRM/MRM特征峰面积相比较。在一个实施方式中，该内标物为合成形式的完全相同的p16肽，其含有用一种或多种重同位素标记的一个或多个氨基酸残基。合成这类同位素标记的内标物，使得当通过质谱进行分析时产生可预测且一致的SRM/MRM特征峰，其与天然p16肽特征峰不同且截然不同并可用作比较峰。因此，当内标物掺入已知含量的来自生物样品的蛋白质制剂中并通过质谱分析时，可将天然肽的SRM/MRM特征峰面积与内标肽的SRM/MRM特征峰面积相比较，并且该数值比较显示来自生物样品的原始蛋白质制剂中存在的天然肽的绝对摩尔浓度和/或绝对重量。片段肽的绝对定量数据根据每种样品中所分析的蛋白质的含量来显示。可在单个样品中和/或在许多样品上的多个肽、以及这样的蛋白质上同时进行绝对定量，以了解单个生物样品中和整个单个样品的组中的绝对蛋白质含量。

SRM/MRM测定方法可用于帮助癌症阶段的诊断和/或患者预后，例如，直接在来源于患者的组织(例如福尔马林固定的组织)中进行，并帮助确定哪种治疗剂用于治疗该患者最有利。分析通过手术(例如治疗性去除部分或全部肿瘤)或通过用于确定疑似疾病存在或不存在的活检程序而从患者中取出的癌组织，以确定是否有特定蛋白质或蛋白质、以及哪种形式的蛋白质存在于该患者的组织中。此外，可确定蛋白质或多种蛋白质的表达水平并将其与在健康组织中发现的“正常”或参考水平相比较。在健康组织中发现的蛋白质的正常或参考水平可来源于例如没有癌症的一个或多个个体的相关组织。或者，可通过分析未受癌症影响的相关组织来获得具有癌症的个体的正常或参考水平。蛋白质水平(例如，p16水平)的测定也可用于诊断并提供关于患者或受试者中癌症阶段的预后信息，其中所述患者或受试者是通过采用p16水平被诊断为患有癌症。单个p16肽的水平定义为通过SRM/MRM测定而确定的肽的摩尔量/分析蛋白质裂解物总量。因此，关于p16的信息可用于通过将p16蛋白质(或p16蛋白质的片段肽)的水平与正常组织中观察到的水平相关联，用以帮助确定癌症和/或患者预后的阶段或等级。一旦确定了癌细胞中p16蛋白质的定量量，就可以将该信息与开发用于特异性治疗癌症组织的治疗剂(化学和生物)的列表进行匹配，所述癌症组织的特征在于例如已测定到的蛋白质(例如，p16)的异常表达。将来自p16蛋白质测定的信息与特异性靶向(例如表达特异性蛋白质的细胞/组织)的治疗剂的列表进行匹配，定义了所谓的用于治疗疾病的个性化用药方法。本发明所述的测定方法使用来自患者自身的组织的蛋白质的分析作为诊断和治疗判断的来源，从而形成个性化用药方法的基础。

具体实施方式

原则上，来自p16蛋白质的任何预测的肽，例如通过采用已知特异性蛋白酶(例如，胰蛋白酶)消化制备，可用作替代性报告子(surrogate reporter)，用以采用基于质谱的SRM/MRM测定来确定样品中p16蛋白质的丰度。类似地，也可能使用已知在p16蛋白质中可能被修饰的位点处含有一个氨基酸残基的任何预测的肽序列来测定样品中p16蛋白质的修饰程度。

p16片段肽可通过多种方法来产生，包括使用在美国专利7,473,532中提供的Liquid Tissue方案。Liquid Tissue方案和试剂能够通过对组织/生物样品中的蛋白质进行蛋白水解消化来由福尔马林固定的石蜡包埋组织生成适用于质谱分析的肽样品。在Liquid Tissue方案中，将组织/生物制备物在缓冲液中加热延长一段时间(例如，约80℃至约100℃，持续约10分钟至约4小时的时间)以逆转或释放蛋白质交联。所采用的缓冲液为中性缓冲液(例如，基于Tris的缓冲液或含有去垢剂的缓冲液)。在加热处理之后，将组织/生物样品用包括但不限于胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶和胞内蛋白酶Lys-C的一种或多种蛋白酶处理足以破坏生物样品的组织和细胞结构，并溶解该样品(例如，在37℃至65℃的溫度下持续30分钟至24小时的时间)。加热和蛋白水解的结果为液态可溶性可稀释的生物分子裂解物。

令人惊讶的是，发现来自p16蛋白质的许多潜在肽序列并不适合在基于质谱的SRM/MRM测定中使用或者在基于质谱的SRM/MRM测定中使用时是失效的，其原因不明。这对来源于福尔马林固定组织的肽尤其如此。由于不可能预测最适合MRM/SRM测定的肽，因此必须通过实验在实际的Liquid Tissue裂解物中鉴定修饰的和未修饰的肽以开发针对p16蛋白质的可靠且准确的SRM/MRM测定。不希望受任何理论约束，但认为一些肽可能例如难以通过质谱检测，因为它们不会良好地电离，或者因为它们生成与其它蛋白质不同的片段。肽也可能无法在分离(例如，液相色谱)中良好地解析，或可能附着到玻璃或塑料器具上。

在本发明公开的多个实施方式中发现的p16肽(例如，表1)通过蛋白酶消化复杂的Liquid Tissue裂解物内的所有蛋白质而来源于p16蛋白质，所述裂解物由从福尔马林固定的癌症组织中取得的细胞制备。除非另外指出，否则在各种情况下，所述蛋白酶都为胰蛋白酶。Liquid Tissue裂解物随后通过质谱分析以确定通过质谱检测并分析的来源于p16蛋白质的那些肽。用于质谱分析的具体优选的肽亚组的鉴定基于：1)实验确定在Liquid Tissue裂解物的质谱分析中电离的来自蛋白质的一种或多种肽，和2)肽在制备Liquid Tissue裂解物中使用的方案和实验条件下继续存在的能力。后一性质的范围不仅是肽的氨基酸序列，而且是肽内的修饰的氨基酸残基在样品制备期间以修饰的形式继续存在的能力。

从福尔马林(甲醛)固定的组织中直接取得的细胞的蛋白质裂解物使用LiquidTissue试剂和方案制备，Liquid Tissue试剂和方案要求经由组织显微解剖将细胞收集到样品管中，接着在Liquid Tissue缓冲液中对细胞加热延长的一段时间。一旦负面地影响到福尔马林诱导的交联，则使用蛋白酶(例如包括但不限于胰蛋白酶的蛋白酶)以可预见的方式来消化组织/细胞至完全消化。通过用蛋白酶消化完整的多肽将各蛋白质裂解物而转化成肽的集合。分析(例如，通过离子阱质谱)各Liquid Tissue裂解物以对肽进行多重全局性蛋白组学研究，其中数据表示为来自各蛋白质裂解物中存在的所有细胞蛋白质的可通过质谱鉴定的尽可能多的肽的鉴定结果。通常采用离子阱质谱或能够进行全局性概要分析的另一形式的质谱来鉴定来自单一复杂蛋白质/肽裂解物的尽可能多的肽。然而，离子阱质谱可能是用于进行肽的全局性概要分析的最佳质谱类型。尽管可在包括MALDI、离子阱或三重四极质谱的任何类型的质谱上开发并进行SRM/MRM测定，但对于SRM/MRM测定而言有利的仪器平台则是三重四极质谱仪器平台。

一旦在所采用的条件下在单一裂解物的单一MS分析中鉴定出尽可能多的肽，则整理肽的列表并将其用于确定在该裂解物中检测到的蛋白质。对于多种Liquid Tissue裂解物重复该过程，且将非常大的肽列表整理成单一数据集。可将该类型的数据集视为代表可在分析的生物样品类型中(蛋白酶消化之后)、特别是在生物样品的Liquid Tissue裂解物中检测到的肽，且因此包括诸如p16蛋白质的具体蛋白质的肽。

在一个实施方式中，鉴定为可用于确定p16蛋白质的绝对含量或相对含量的p16胰蛋白酶肽包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中的一个、两个或全部三个，全部列于表1中。通过质谱来检测由福尔马林固定、石蜡包埋的组织制备而成的Liquid Tissue裂解物中的每种肽。因此，每种肽都是用于开发人类生物样品(包括直接在福尔马林固定的患者组织中)中p16蛋白质的定量SRM/MRM测定的候选物。

表1

表1中列出的p16胰蛋白酶肽是从包括前列腺、结肠和乳腺的不同人类器官的多种不同福尔马林固定的组织的多种Liquid Tissue裂解物中检测到的。那些肽各自被视为可用于福尔马林固定的组织中的p16蛋白质的定量SRM/MRM测定。这些实验的进一步数据分析表明，并没有优先观察到来自任何特定器官位点的这些肽中的任一种。因此，认为这些肽中的每一种都适合对来自来源于任何生物样品或体内的任何器官位点的任何福尔马林固定的组织的Liquid Tissue裂解物进行p16蛋白质的SRM/MRM测定。

在进行SRM/MRM测定时一个重要的考虑因素是可用于肽分析的仪器的类型。尽管可在包括MALDI、离子阱或三重四极质谱仪的任何类型的质谱仪上开发并进行SRM/MRM测定，但用于SRM/MRM测定的最有利的仪器平台目前很可能被认为是三重四极仪器平台。该类型的质谱是目前最适用于推定分析可由来自细胞内含有的所有蛋白质的数万至数百万个单个肽组成的很复杂的蛋白质裂解物内的单个分离的靶标肽。

为了对来源P16蛋白质的各种肽最有效地实施SRM/MRM测定，需要在分析中利用除了肽序列之外的信息。该额外信息可用于引导并指导质谱(例如，三重四极质谱)对特异性靶标肽进行正确且集中的分析，从而可有效地进行测定。

关于靶标肽总体和关于特定p16肽的额外信息可包括各种肽的单同位素质量、其前体电荷状态、前体m/z值、m/z过渡离子和各过渡离子的离子类型中的一种或多种。表1显示可用于开发p16蛋白质的SRM/MRM测定的额外肽信息。

如下所述的方法用于：1)鉴定可用于p16蛋白质的基于质谱的SRM/MRM测定的来自p16蛋白质的候选肽，2)针对来自p16蛋白质的靶标肽开发单个SRM/MRM测定或多种SRM/MRM测定以关联和3)将定量测定应用于癌症诊断和/或最佳疗法的选择。

测定方法

1.p16蛋白质的SRM/MRM候选片段肽的鉴定：

a.使用一种或多种蛋白酶(可能包括或可能不包括胰蛋白酶)消化蛋白质，从而由福尔马林固定的生物样品制备Liquid Tissue蛋白质裂解物

b.在离子阱串联质谱上分析Liquid Tissue裂解物中的所有蛋白质片段并鉴定来自p16蛋白质的所有片段肽，其中单个片段肽不含任何诸如磷酸化或糖基化的肽修饰

c.在离子阱串联质谱上分析Liquid Tissue裂解物中的所有蛋白质片段并鉴定来自带有诸如磷酸化或糖基化残基的肽修饰的p16蛋白质的所有片段肽

d.可测量由完整的全长p16蛋白质通过具体消化方法可能产生的所有肽，但用于开发SRM/MRM测定的优选肽为在由福尔马林固定的生物样品制备的复杂Liquid Tissue蛋白质裂解物中通过质谱直接鉴定的那些

e.在分析来自福尔马林固定的生物样品的Liquid Tissue裂解物时将在患者组织中特异性修饰(磷酸化、糖基化等)并在质谱中电离化且因此检测的肽鉴定为用于测定p16蛋白质的肽修饰的候选肽

2.来自p16蛋白质的片段肽的质谱测定

a.将针对Liquid Tissue裂解物中鉴定的单个片段肽的三重四极质谱上的SRM/MRM测定应用于来自p16蛋白质的肽

i.针对包括但不限于以下实验的最佳色谱条件确定片段肽的最佳保留时间：凝胶电泳、液相色谱、毛细管电泳、纳米反向液相色谱、高效液相色谱或反向高效液相色谱

ii.确定肽的单同位素质量、各肽的前体电荷状态、各肽的前体m/z值、各肽的m/z过渡离子和各片段肽的各过渡离子的离子类型以开发用于各肽的SRM/MRM测定。

iii.随后可使用来自(i)和(ii)的信息在三重四极质谱上进行SRM/MRM测定，其中各肽均具有特征性且独特的SRM/MRM特征峰，该特征峰精确地限定在三重四极质谱上进行的独特的SRM/MRM测定

b.进行SRM/MRM分析使得来自SRM/MRM质谱分析的独特SRM/MRM特征峰面积的函数形式的所检测的p16蛋白质的片段肽的含量可指示特定蛋白质裂解物中蛋白质的相对含量和绝对含量。

i.相对定量可通过以下实现：

1.通过比较以下数值来确定p16蛋白质的增加或减少的存在量：来自一种福尔马林固定的生物样品的Liquid Tissue裂解物中检测到的给定p16肽的SRM/MRM特征峰面积与来自至少第二、第三、第四或更多的福尔马林固定的生物样品的至少第二、第三、第四或更多的Liquid Tissue裂解物中相同p16片段肽的相同SRM/MRM特征峰面积

2.通过比较以下数值来确定p16蛋白质的增加或减少的存在量：来自一种福尔马林固定的生物样品的Liquid Tissue裂解物中检测到的给定p16肽的SRM/MRM特征峰面积与由来源于不同且单独的生物来源的其它样品中的其它蛋白质的片段肽发展的SRM/MRM特征峰面积，其中针对肽片段的两种样品之间的SRM/MRM特征峰面积的比较标准化至各样品中分析的蛋白质的含量。

3.通过比较以下数值来确定p16蛋白质的增加或减少的存在量：给定p16肽的SRM/MRM特征峰面积与来自福尔马林固定的生物样品的相同Liquid Tissue裂解物内的不同蛋白质来源的其它片段肽的SRM/MRM特征峰面积，从而将p16蛋白质的变化水平标准化至多种细胞条件下都不改变其表达水平的其它蛋白质的水平。

4.这些测定可应用于p16蛋白质的未修饰的片段肽和修饰的片段肽，其中修饰包括但不限于磷酸化和/或糖基化，且其中以与确定未修饰的肽的相对含量相同的方式确定修饰的肽的相对水平。

ii.给定肽的绝对定量可通过比较以下数值来实现：来自单个生物样品中的p16蛋白质的给定片段肽的SRM/MRM特征峰面积与掺入来自生物样品的蛋白质裂解物中的内部片段肽标准物的SRM/MRM特征峰面积

1.内标物为测量中的p16蛋白质的片段肽的经标记的合成形式。将该标准物以已知量掺入样品中，并可单独地确定生物样品中的天然肽片段和内部片段肽标准物的SRM/MRM特征峰面积，接着比较两个峰面积

2.这可应用于未修饰的片段肽和修饰的片段肽，其中这些修饰包括但不限于磷酸化和/或糖基化，且其中可以与确定未修饰的肽的绝对水平相同的方式来确定修饰的肽的绝对水平。

3.将片段肽定量应用于癌症诊断和治疗

a.进行p16蛋白质的片段肽水平的相对和/或绝对定量并说明证实了患者肿瘤组织中的p16蛋白质表达与阶段/等级/状况的先前确定的关联性，如同在癌症领域中充分理解的那样

b.进行p16蛋白质的片段肽水平的相对和/或绝对定量并说明与来自不同治疗策略的临床结果的关联性，其中该关联性已经在该领域中说明或可在将来说明(通过针对患者群或来自那些患者的组织的关联性研究)。一旦通过该测定证实了先前确立的关联性或将来得出的关联性，则该测定方法可用于确定最佳治疗策略

通过分析离子阱和三重四极质谱两者上的所有p16肽来开发有关特定p16肽的特定和独特的特征。该信息包括肽的单同位素质量、其前体电荷状态、前体m/z值、前体的过渡m/z值以及每个被识别的过渡的离子类型。该信息必须实验性地确定直接在来自福尔马林固定的样品/组织的Liquid Tissue裂解物中的每种候选SRM/MRM肽，因为，有趣的是，并非所有来自p16蛋白质的肽都可在这样的裂解物中检测到，所述裂解物采用如本文所述的SRM/MRM，这表明了未检测到的p16肽不能被认为是用于开发SRM/MRM测定的候选肽，所述SRM/MRM用于直接在来自福尔马林固定的样品/组织的Liquid Tissue裂解物中定量肽/蛋白质。

针对特定p16肽的特定SRM/MRM测定在三重四极质谱上进行。通过特定p16SRM/MRM测定分析的实验样品为例如由福尔马林固定并石蜡包埋的组织制备而成的Liquid Tissue蛋白质裂解物。来自例如测定的数据表明，在福尔马林固定的样品中该p16肽存在独特的SRM/MRM特征峰。

使用该肽的特定过渡离子特征来定量地测量福尔马林固定的生物样品中的特定p16肽。这些数据表明该p16肽的绝对含量作为每微克分析的蛋白质裂解物的肽的摩尔量的函数。基于福尔马林固定的患者来源的组织的分析对组织中p16蛋白质水平的评价可提供关于各特定患者的诊断、预后和治疗有关的信息。在一个实施方式中，本公开描述了一种测量生物样品中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A蛋白质(p16)的水平的方法，其包括使用质谱检测和/或定量由所述生物样品制备的蛋白质消化物中一种或多种修饰和/或未修饰的p16片段肽的含量；和计算所述样品中修饰的或未修饰的p16蛋白质的水平；且其中所述水平为相对水平或绝对水平。在一个相关实施方式中，定量一种或多种p16片段肽包括通过与添加的已知含量的内标肽比较来确定生物样品中各p16片段肽的含量，其中该生物样品中的各p16片段肽均与添加的具有相同氨基酸序列的内标肽相比较。在一些实施方式中，该内标物为同位素标记的内标肽，其包含选自¹⁸O、¹⁷O、³⁴S、¹⁵N、¹³C、²H或其组合的一种或多种重稳定同位素。

本发明所述的测量生物样品中p16蛋白质(或作为其替代的片段肽)的水平的方法可用作患者或受试者中癌症的诊断和/或预后指标。在一个实施方式中，可通过关联(例如比较)组织中发现的p16蛋白质的水平与正常和/或癌性或癌前期组织中发现的该蛋白质的水平来将p16蛋白质水平的测量结果用于确定癌症的诊断阶段/等级/状况和/或预后状况。

因为核酸和蛋白质两者都可由相同的Liquid>TM生物分子制备物分析，所以可以由用于蛋白质分析的相同样品中的核酸生成关于疾病诊断和药物治疗判断的额外信息。例如，如果p16蛋白质由某些细胞以增加的水平表达，当通过SRM测定时，数据可提供关于细胞的状态及其不受控制地生长的潜在性、潜在的抗药性和癌症发展的信息。同时，可从相同的Liquid>TM生物分子制备物中存在的核酸中获得关于p16基因和/或核酸及其编码的蛋白质的状况的信息(例如，mRNA分子及其表达水平或剪接变化)，可在p16蛋白质的SRM分析的同时对其进行评价。可在p16蛋白质的SRM分析的同时对不来自p16且存在于相同生物分子制备物中的任何基因和/或核酸进行评价。在一个实施方式中，关于p16蛋白质和/或一种、两种、三种、四种或更多种额外的蛋白质的信息可通过检查编码那些蛋白质的核酸来评价。那些核酸可例如通过以下方法中的一种或多种、两种或更多种或三种或更多种检查：测序方法、聚合酶链式反应方法、限制性片段多态性分析、插入、缺失的鉴定，和/或是否存在突变的确定，包括但不限于单碱基对多态性、转换、颠换或其组合。

序列表

<110> 爱科谱迅病理研究公司(Expression Pathology Inc.)

<120> 细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A（p16）的SRM/MRM测定

<130> 001152-8046.CN00

<150> 62/165,614

<151> 2015-05-22

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Ala Leu Leu Glu Ala Gly Ala Leu Pro Asn Ala Pro Asn Ser Tyr Gly

1 5 1015

Arg

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Glu Gly Phe Leu Asp Thr Leu Val Val Leu His Arg

1 5 10

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

Leu Pro Val Asp Leu Ala Glu Glu Leu Gly His Arg

1 5 10