荧光假单胞菌及其在烟草黑胫病防治中的应用

摘要

本发明提供一株荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)XF10，其保藏编号为：CGMCC No.13703。荧光假单胞菌的菌液、胞外代谢产物和挥发性产物能够有效抑制烟草黑胫病。本发明所筛选得到的荧光假单胞菌活性高而稳定，其发酵液、胞外代谢产物和挥发性产物能够有效杀灭烟草黑胫病菌，采用灌根方式，操作方法简单；无污染、对环境不构成危害。

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及对烟草黑胫病有拮抗作用的荧光假单胞菌及其应用。

背景技术

烟草黑胫病(Tobacco black shank)是烟草生产上一种毁灭性的土传病害，也是世界烟草生产中危害最严重的一种根茎病害。烟草黑胫病能危害整个烟草生育期，但主要危害大田期的烟株。苗期发病常引起“猝倒”症状，首先在茎基部出现黑斑，或从底叶发病后再沿叶柄扩展到茎上。苗床湿度过大或多雨天气常使烟苗成片死亡，病苗上长满白色菌丝；气候干燥时，病苗呈褐色干枯死亡。大田期烟株的根、茎、叶等各部位均可以被烟草黑胫病菌侵染，但主要以根茎部发病为主。

利用农业防治来控制烟草黑胫病主要通过种植抗病品种来实现，该种措施具有成本低、效果稳定、对环境无害等特点。但是选育抗病品种的难度相当大，首先烟草黑胫病病原菌能够侵染整个烟草生育期并且在一个生长季节可能会发生多次侵染，而且病原菌游动孢子数量大，速度快，使得侵染烟株潜育期短，发病迅速。其次，迄今为止国内外已发现烟草疫霉存在0号、1号、2号和3号4个生理小种。我国主要存在的是0号和1号生理小种，而推广的抗病品种仅对某一个生理小种表现抗性，可能会诱使致病原菌生理小种发生改变，从而导致品种丧失抗性。

利用作物轮作或间作是另一种控制烟草黑胫病的措施，长期连年在同一块田地种植同种作物，会使病原菌在土壤中大量繁殖并不断积累，而利用不易感病的作物进行轮作能减少病原菌的数量。但是由于实践生产中病原菌在土壤中积累的年限长，数量多，且轮作间隔较短无法达到理想的防治效果。总的来说，很难仅靠轮作来很好的防治烟草黑胫病。

化学防治因其方便快捷见效快仍是目前最有效、生产使用最多的防治烟草黑胫病的措施。但是这些农药的作用机制比较单一，很容易使植物产生不同程度的抗药性，长此以往会导致防治效果下降，从而会加大农药的施用量。而且目前市场上还没有出现新型的化学药剂，烟草是叶用作物，化学农药势必会影响烟叶品质，这与当前推崇的烟草生产的可持续发展相悖。

发明内容

针对现有技术存在的烟草黑胫病防治效果差的上述问题，本发明提供一种对烟草黑胫病有拮抗作用的荧光假单胞菌，以及利用该技术进行烟草黑胫病防治的方法。该技术不但能够有效防治烟草黑胫病，而且成本低、操作简单、无污染、对环境友好。

本发明一方面提供一株荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)XF10，其保藏编号为：CGMCC No.13703。其生理化鉴定结果见表1。

所述的荧光假单胞菌XF10，其培养温度为28℃，采用营养琼脂培养基(NA)进行培养，所述营养琼脂培养基为：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，最终pH7.1～7.5。

另一方面，荧光假单胞菌的菌液、胞外代谢产物和挥发性产物能够有效抑制烟草黑胫病。尤其是在防治烟草黑胫病为0号和1号生理小种。优选使用所述荧光假单胞菌的发酵液直接对烟草进行灌根；或者将荧光假单胞菌的干粉菌剂用水稀释200倍灌根，所述干粉菌剂由发酵液冷冻干燥制得。

同时，本发明同时提供一种用于防治烟草黑胫病的菌剂，将所述的荧光假单胞菌进行发酵获得发酵液，经冷冻干燥获得干粉菌剂。

本发明的有益效果是：所筛选得到的荧光假单胞菌活性高而稳定，其发酵液、胞外代谢产物和挥发性产物能够有效杀灭烟草黑胫病菌，采用灌根方式，操作方法简单；无污染、对环境不构成危害。

附图说明

图1为菌株XF10的系统发育树。

本发明的菌种保藏日期为2017年2月24日，保藏编号为：CGMCC No.13703，分类命名为：荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，保藏单位名称为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。

以下实施例中所用的培养基配方为：

营养琼脂培养基(NA)：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，最终pH7.1～7.5；

营养肉汤培养基(NB)：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，最终pH7.0～7.4；

燕麦培养基(OA)：燕麦30g，琼脂15g，蒸馏水1000mL；

实施例1荧光假单胞菌的筛选

本发明所述的荧光假单胞菌的筛选方法有如下步骤：

1、土壤细菌的分离

取10g土壤加90mL取采集到的土样10g，加入到盛有90mL无菌水的三角瓶中，将三角瓶置摇床上，180rpm振荡20min，制成土壤悬液。将制备好的土壤悬液静置5min，取上清液，采用10倍系列稀释法，依次稀释到10-2、10-3、10-4和10-5，每个浓度吸取200μL 于NA平板上，涂布均匀，每个浓度重复六次。然后将涂好的NA平板于28℃恒温培养箱中培养24h。

2、初筛

在直径为9cm的PDA平板中央接种直径为9mm的白地霉(Geotrichum candidum)菌饼， 28℃培养5d。将50mL无菌水倒入长满白地霉的培养皿，用移菌环轻轻刮白地霉，然后把白地霉节孢子悬液倒入无菌的微型喷雾器，轻轻振荡1min。调节其浓度到105个孢子/mL。(即 420nm时OD值为0.3)待NA平板出现细菌菌落时，将白地霉孢子悬液均匀的喷施于已经长出菌落的NA平板上(每个浓度梯度分别喷三个板)。喷布时要均匀，每皿大约200μL。喷施的量不要过多，以防止形成水流把长好的菌落冲散，影响筛选的准确性。

选取周围出现明显抑菌圈的菌落，用移菌环挑取菌体，在NA平板上划线，将平板放入 28℃生化培养箱中培养12h。待长出单菌落后再次挑取菌落划线，重复三次，得到纯的目的细菌。用牙签挑取筛选得到的菌落放入盛有5mL液体LB培养基的试管中，28℃振荡培养14-16h。取1mL菌液，加入到2mL的离心管中，然后再加入15％甘油混匀，于-80℃冰箱中保存。

3、复筛

复筛对峙培养的方法进行改进，在燕麦培养基平板的中心接入一块直径为5mm的黑胫病菌块，在距离中心24mm左右两侧各接10μL、初筛获得的有抑制作用的细菌菌悬液，每个菌株重复3次，暗培养72h，测量抑制圈大小，计算其抑制率，获得一株强拮抗作用的生防菌株(编号为XF10)。

实施例2荧光假单胞菌的鉴定

对上述获得的细菌进行生化鉴定，其表明为荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)。

1、生理生化鉴定

革兰氏染色、淀粉水解、氧化酶、硝酸还原、明胶液化等，生理生化特性的测定参照《植物病原细菌鉴定实验指导》

XF10菌株的生理生化鉴定如表1，XF10菌株表现为革兰氏阴性菌，能使明胶液化，并能还原硝酸盐，不能水解淀粉，且甲基红与V-P试验为阴性。初步确定该菌株为假单孢菌属。耐盐性试验结果为1％Nacl呈阳性，4％Nacl呈阴性。

表1 XF10菌株的生理生化鉴定

2、BIOLOG生物型鉴定

采用BIOLOG细菌自动鉴定系统，将菌株测得的生化特性与数据库中录入的细菌进行比对，观察相似值和间距，并观察该菌株对GENⅢ微孔板碳源的利用情况。

GNⅢ微孔板对拮抗细菌XF10进行了94种表型测试，其中71种碳源利用测试，23种化学敏感测试。细菌自动鉴定系统的鉴定结果显示，XF10菌株属于假单孢菌属的荧光假单胞菌，与数据库中的Pseudomonas fluorecens的相似值(SIM)最高，为0.653。该菌株对碳源的利用情况如表2。

表2XF10菌株对GNⅢ板碳源的利用情况

3、16S rDNA的分子型鉴定

①菌株DNA的提取

用细菌基因组提取试剂盒(青岛群昌科贸有限公司，全式金牌)提取菌株XF10的全基因组，步骤如下：

1)革兰氏阴性菌裂解

取过夜培养的革兰氏阴性细菌1mL，12000×g离心1分钟，尽量弃上清；加入100μLLB11 和20μL Proteinase K，振荡至菌体彻底悬浮；55℃孵育15分钟。(此时溶液应呈清亮状，如果此时溶液未呈清亮状，可延长孵育时间至30分钟，每隔5分钟摇匀一次。)

2)加入20μL RNase A混匀静置2分钟。

3)加入400μL BB11(使用前请先检查是否加入无水乙醇)涡旋30秒。(此步可能会产生白色絮状沉淀或者透明胶状物，但不影响基因组DNA的提取。)

4)将全部的溶液加入离心柱中，12000×g离心30秒，弃流出液。

5)加入500μL CB11，12000×g离心30秒，弃流出液。

6)重复步骤5一次

7)加入500μL WB11(使用前请先检查是否加入无水乙醇)，12000×g离心30秒，弃流出液。

8)重复步骤7一次。

9)12000×g离心2分钟，彻底出去残留的WB11.

10)将离心柱置于一干净的离心管中，在柱中央加入50-200μL预热EB(60-70℃)或去离子水(pH>7.0)，室温静置2分钟，12000×g离心1分钟，洗脱DNA。

11)重复步骤10一次，洗脱的DNA于-20℃保存。

②PCR扩增

采用的引物名称及序列如下27F：5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’；1492R：5’TACGGYTACCTTGTTACGACTT3’由擎科新业生物技术有限公司合成并提供。PCR扩增所用体系为20μL：DNA 1μL、一对引物各1μL、2*EasyTaq Mix10μL、补充ddH₂O到20μ>

PCR反应条件为：94℃预变性5min后进行循环(92℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min)循环进行完毕后72℃充分延伸5min。用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并送往擎科新业生物技术进行通测。

XF10菌株的16s rDNA测序结果如SEQ ID NO：3所示。

经PCR扩增所得的XF10菌株16S rDNA核苷酸序列长度为1418bp，GenBank登录号为： MF121986。通过在NCBI上进行同源性比较，即BLAST比对分析，发现该菌株的16S rDNA的序列与假单孢菌属(Pseudomonas)的多个菌株的同源性达99％。在此基础上构建系统发育树如图1，确定XF10菌株与荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorecens)进化关系最近。

实施例3菌液对烟草黑胫病的拮抗作用测定

1)烟草黑胫病的培养：在无菌操作台中，用打孔器取出直径为0.5cm的菌块，接种在燕麦培养基中，于28℃暗培养3-5d。

2)接种细菌：在燕麦培养基平板的中心接入一块直径为5mm的黑胫病菌块，在距离中心24mm左右两侧各接10μLXF10菌株菌液，重复3次，暗培养72h，测量抑制圈大小，计算其抑制率。

抑制率(％)＝(CK净生长量—处理净生长量)/CK净生长量×100

实施例4菌株胞外代谢产物粗提液对烟草黑胫病的抑制作用

取XF10菌株经180rpm、温度28℃振荡培养24h的后的菌液1mL，接种到装有100mlNB 培养基的250ml锥形瓶中，28℃、180rpm振荡培养72h，所得的菌体发酵液以8000rpm、4℃离心15min，上清液经细菌过滤器过滤得到XF10菌株胞外粗提液备用。

参照平板对峙法测定XF10无菌胞外粗提液对黑胫病菌的拮抗作用，以NB培养基为对照，在28℃暗培养，待对照平板长满菌丝时，测定其抑制率。

表3为实施例3和实施例4菌株对烟草黑胫病的抑制作用测定结果。

表3 XF10菌株对烟草黑胫病的抑制作用

应用实例1

时间：2017年5月7日-2017年8月12日

地点：贵州省贵阳市修文县小箐乡

剂量：每亩500g菌剂干粉，水稀释200倍

方式：移栽前沾根，移栽后七天，14天灌根

结果见表4。

表4 XF10菌株对烟草黑胫病的大田防治效果

调查得知，施用过XF10菌剂的烟草黑胫病的发病率明显低于对照组黑胫病的发病率，防治效果达到70.73％。

序列表

<110> 陈德鑫

中国农业科学院烟草研究所

四川省烟草公司攀枝花市公司

中国烟草总公司贵州省公司

贵四川省烟草公司凉山州公

中国烟草总公司云南省公司

中国烟草总公司四川省公司

安徽农业大学

<120> 绿针假单胞菌及其在烟草黑胫病防治中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tacggytacc ttgttacgac tt 22

<210> 3

<211> 1418

<212> DNA

<213> 荧光假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)

<400> 3

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