适用于电动‑微生物协同修复石油烃污染土壤中混合菌剂及其制备和应用

摘要

本发明属于电动‑微生物协同修复石油烃污染土壤技术领域，具体涉及一种适用于电动‑微生物协同修复高盐度石油烃污染土壤中混合菌剂及其制备和应用。菌剂由仙河盐单胞菌、地衣芽孢杆菌及蜡样芽孢杆菌分别发酵混合获得；本发明组合菌剂应用于电动‑微生物协同修复技术中，打破修复过程中所形成的土壤高盐状态的修复瓶颈，合理利用功能菌剂资源，有效实现了石油土壤中石油烃的降解，降低土壤中石油烃有机污染物毒性。

说明书

技术领域

本发明属于电动-微生物协同修复石油烃污染土壤技术领域，具体涉及一种适用于电动-微生物协同修复高盐度石油烃污染土壤中混合菌剂及其制备和应用。

背景技术

石油经济的不断发展壮大致使石油烃的开采需求量逐年提高，由于开采落地、运输泄漏等原因进入土壤的石油烃类物质数量也随之不断增加，危害自然环境与生态安全。对此，针对石油污染土壤的治理修复工作迅速开展并得到越来越广泛的关注。目前，以生物及化学方法为主的石油烃污染土壤修复技术愈发受到青睐。然而，鉴于石油烃污染物的强疏水特性，单一的微生物修复技术难以实现高效稳定的石油烃降解效果，对此，通过单一处理技术的有机组合而形成的联合修复技术是实现石油污染土壤修复技术突破的有力方向。

电动修复技术作为一种近几年来愈加受到关注的有机污染土壤修复技术，是石油烃污染土壤修复的新希望。然而，电动修复技术亦存在修复效率“拖尾”的不利效应。对此，采用电动-微生物协同修复技术，以微生物修复为主体，通过电动修复过程实现微生物代谢的强化，将是快速启动石油烃污染物降解过程，并维持快速降解时段的有效手段。但目前，电动-微生物的协同修复技术依然存在土壤性质极端化的趋势，其中，电极端的“离子墙”现象所导致的高盐特征是该技术应用对土壤性质改变的显著特征之一。高盐特征产生盐胁迫作用，导致诸多微生物脱水而丧失繁殖代谢功能，乃至大量死亡，失去石油烃代谢活性。对此，选用高耐盐特性菌株将是适应盐渍土壤石油烃污染修复的可行方法之一。

发明内容

本发明目的在于提供一种适用于电动-微生物协同修复石油烃污染土壤中混合菌剂及其制备和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种适用于电动-微生物协同修复高盐度石油烃污染土壤中混合菌剂，菌剂由仙河盐单胞菌、地衣芽孢杆菌及蜡样芽孢杆菌分别发酵混合获得；仙河盐单胞菌保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCCNO.1.6848，保藏日2008年9月15日，分类学命名Halomonas xianhensis；地衣芽孢杆菌及蜡样芽孢杆菌均保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为武汉市武昌珞珈山，保藏登记号分别为CCTCC NO：M 2011261和M 2015705，保藏日分别为2011年7月22日和2015年12月3日，分类学命名分别为Bacillus licheniformis和Bacillus cereus。

三株菌株均具有耐盐特性，可在盐度为3～5％(w/v)的液体环境中生长，其中，仙河盐单胞菌、地衣芽孢杆菌及蜡样芽孢杆菌分别可分别利用PAHs(菲、蒽或荧蒽)、烷烃(C16～C24)及脂肪酸(棕榈酸、硬脂酸)作为唯一碳源进行生长代谢。

所述菌剂由仙河盐单胞菌、地衣芽孢杆菌及蜡样芽孢杆菌分别发酵混合后经载体固定化获得。

所述仙河盐单胞菌、地衣芽孢杆菌与蜡样芽孢杆菌菌悬液按照2～3:5～6:1(v:v)的比例混合并经固定得初始混合菌剂；

所述仙河盐单胞菌、地衣芽孢杆菌与蜡样芽孢杆菌菌悬液按照1:3～5:2～3(v:v)的比例混合并经固定化得补强混合菌剂。

一种适用于电动-微生物协同修复高盐度石油烃污染土壤中混合菌剂的应用，所述菌剂在与电场协同作用下对高盐度石油烃污染土壤修复的应用。

所述仙河盐单胞菌、地衣芽孢杆菌与蜡样芽孢杆菌菌悬液按照2～3:5～6:1(v:v)的比例混合并经固定得初始混合菌剂；

所述仙河盐单胞菌、地衣芽孢杆菌与蜡样芽孢杆菌菌悬液按照1:3～5:2～3(v:v)的比例混合并经固定化得补强混合菌剂。

所述电场条件为施加0.5～2.0v/cm的直流电场，进行电动修复的开端使用初始混合菌剂，细菌微生物数量达2～8×10⁸CFU·g^-1，当污染土壤中烷烃组分降解率达40～50％时，施加补强混合菌剂，维持土壤内细菌总量达初始含量的90～110％，修复全程以电动-微生物协同修复的方式进行。

仙河盐单胞菌、地衣芽孢杆菌与蜡样芽孢杆菌分别按照2～3:5～6:1(v:v)和1:3～5:2～3(v:v)的比例混合，经固定化后分别制成初始混合菌剂及补强混合菌剂，应用于电动-微生物协同修复技术对石油污染土壤的修复过程；混合菌液经酸化矿化度达10～20％(w/w)的稻壳制成的载体进行固定化处理，但不局限于采用碳化稻壳进行菌株固定化。

一种修复高盐度石油烃污染土壤的方法，将所述菌剂与电场协同作用下对石油污染土壤修复。

对待处理污染土壤采用0.5～2.0v/cm的直流电场进行电动修复的开端使用初始混合菌剂，使土壤中细菌微生物数量达2～8×10⁸CFU·g^-1，当污染土壤中烷烃组分降解率达40～50％时，施加补强混合菌剂，维持土壤内细菌总量达初始土壤中细菌总含量的90～110％，修复全程以电动-微生物协同修复的方式进行。

混合菌剂均可在含盐量达0.5％～2％(w/w)的土壤内生长，并对石油烃污染物具有代谢降解活性。

本发明所具有的优点包括：

本发明鉴于石油烃的复杂成分，通过筛选不同单一组分的功能降解菌株，将多种具有高耐盐特性的不同石油烃组分代谢功能菌株进行有机组合制成混合菌液及固定化菌剂，可有效实现功能互补，降解污染物毒性，实现菌株间的协同共代谢作用，通过特制配方制备专有菌剂，以实现石油烃污染土壤的电动-微生物协同修复的持续高效过程，以解决该修复技术应用效率“拖尾”的缺陷，具体：

1)本发明中的仙河盐单胞菌、地衣芽孢杆菌及蜡样芽孢杆菌均具有耐高盐特征，隶属于中度嗜盐菌，可在盐度为3～5％(w/v)的液体环境中生存，所制成的混合菌剂同样具有耐高盐特性，故而对于电动修复过程中产生的局部“离子堆积”作用具有良好的适应能力，其生长代谢活性不会受到影响，同时更加适宜于油田区盐碱地内石油污染土壤的修复应用。

2)本发明中的仙河盐单胞菌、地衣芽孢杆菌及蜡样芽孢杆菌分别具有PAHs(菲、蒽或荧蒽)、烷烃(C16～C24)及脂肪酸(棕榈酸、硬脂酸)的代谢能力，且均筛选自石油烃污染土壤中，所以在耐受高盐土壤环境的同时可有针对性地对石油烃中各特异组分进行代谢降解，而又具有对非特异降解底物的免疫特性，从而保证其在电场强化处理条件下的可持续代谢活性。

3)本发明中的初始混合菌剂及补强混合菌剂均由三种不同功能代谢菌株按比例制成，其中修复开端采用以代谢PAHs及烷烃为主要组成部分的混合菌剂，针对初始石油组分进行降解作用，当烷烃降解率达40～50％时，此时脂肪酸类物质具有一定程度积累，补给提高脂肪酸代谢菌株含量比例的混合菌剂进行接续处理，可针对性地去除所积累的脂肪酸类物质，有效跨越代谢瓶颈，改善较高积累量的脂肪酸的毒性作用，促进功能降解菌群的组成稳定与功能强效。

附图说明

图1为本发明实施例2提供的电动处理参与组中使用的电动装置模式图。

图2为本发明实施例2提供的试验处理35d时电动-微生物协同修复处理A(EK-Bio-A)中土壤的各位置总盐含量变化图。

图3为本发明实施例2提供的各试验处理阳极端土壤内土壤pH及细菌微生物数量变化图。

图4为本发明实施例2提供的各试验处理总石油烃降解率随时间变化图。

具体实施方式

本发明混合菌剂由仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCCNO.1.6848、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CCTCC NO：M 2011261和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)CCTCC NO：M 2015705按不同比例混合后经固定化制成，三株菌株均具有耐高盐特性，并分别针对石油烃组分中的PAHs(菲、蒽或荧蒽)，烷烃(C16～C24)及脂肪酸(棕榈酸或硬脂酸)具有高效代谢能力。仙河盐单胞菌、地衣芽孢杆菌与蜡样芽孢杆菌分别按照2～3:5～6:1(V:V)的比例混合，经固定化后制成初始混合菌剂，施加于初始电动-微生物协同修复石油烃污染土壤中，细菌微生物数量达4～8×10⁸CFU·g^-1。当烷烃组分降解率达40～50％时，补给由仙河盐单胞菌、地衣芽孢杆菌与蜡样芽孢杆菌分别按照1:3～5:2～3(V:V)的比例混合并固定化制成的补强混合菌剂，维持土壤内细菌总量达初始含量的90～110％。补强菌剂施加同时补给有机碳源及无机营养离子。该组合菌剂应用于电动-微生物协同修复技术中，打破修复过程中所形成的土壤高盐状态的修复瓶颈，合理利用功能菌剂资源，有效实现了石油土壤中石油烃的降解，降低土壤中石油烃有机污染物毒性。

下面结合附图及实施例对本发明做进一步的详细说明。

实施例1适用于电动-微生物协同修复石油烃污染土壤中混合菌剂的制备

本实施例所用菌源样品采自油田区长期受石油烃污染的高盐含量土壤，土壤内含盐总离子量达1.6％(w/w)，采用30ml无机盐培养基震荡悬浮5.0g石油烃污染盐渍土壤，160rpm/min震荡培养20min，静置3min，吸取1ml上层悬液至分别含有100mg/L菲、300mg/L正十六烷及100mg/L棕榈酸三种无机盐的无机盐液体培养基中富集驯化培养15d，经固体无机盐培养基划线分离纯化鉴定后得到以PAHs中菲为可代谢碳源的仙河盐单胞菌、以正十六烷为可代谢碳源的地衣芽孢杆菌及以棕榈酸为可代谢碳源的蜡样芽孢杆菌。

所述仙河盐单胞菌保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.1.6848，保藏日2008年9月15日，分类学命名Halomonas xianhensis；地衣芽孢杆菌及蜡样芽孢杆菌均保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为武汉市武昌珞珈山，保藏登记号分别为CCTCC NO：M 2011261和M 2015705，保藏日分别为2011年7月22日和2015年12月3日，分类学命名分别为Bacillus licheniformis和Bacillus cereus。

所述无机盐液体培养基的组成为：1.5g·L^-1NaCl，0.2g·L^-1MgSO₄，1.5g·L^-1NH₄NO₃，1.0g·L^-1K₂HPO₄，0.5g·L^-1KH₂PO₄，0.02g·L^-1CaCl₂，0.02g·L^-1FeSO₄，1L蒸馏水，pH值7.0-7.3，121℃灭菌20min备用。

所述无机盐固体培养基的组成为：1.5g·L^-1NaCl，0.2g·L^-1MgSO₄，1.5g·L^-1NH₄NO₃，1.0g·L^-1K₂HPO₄，0.5g·L^-1KH₂PO₄，0.02g·L^-1CaCl₂，0.02g·L^-1FeSO₄，15g·L^-1琼脂，1L蒸馏水，添加pH值7.0-7.3，121℃灭菌20min，固体培养基表面分别涂制1ml浓度为1mg/ml菲的乙醚溶液、10ul正十六烷及1ml浓度为1mg/ml棕榈酸正己烷溶液，待有机溶剂挥发后备用。

将保存的三株菌株分别挑取单一菌落接种在5ml含3％(w/v)NaCl的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃震荡培养16h，获得种子液。分别吸取300ul菌株培养种子液进一步接种至含3％(w/v)NaCl的牛肉膏蛋白胨扩大培养基中，37℃震荡培养48h，6000rpm·min^-1离心10min以收集菌体。所收集的菌体分别采用无机盐培养基进行清洗，并使用无机盐培养基制备成菌体悬液。将仙河盐单胞菌、地衣芽孢杆菌与蜡样芽孢杆菌菌悬液分别按照2.5:5:1(v:v)和1:4:3(v:v)的比例混合制成初始混合菌液和补强混合菌液。

所述无机盐液体培养基的组成为：3.0g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨，5.0g/L NaCl，蒸馏水1L，pH 7.0。

采用50％(w/w)硫酸对完整稻壳进行碳化处理，当稻壳矿化率达15％时，采用氨水中和硫酸体系至中性后，清水冲洗并风干，按照20％(w/v，g/ml)的比例加入至混合菌液中，在4℃条件下进行固定化处理，制成初始混合菌剂与补强混合菌剂。其中，初始混合菌剂具有以石油烃组分中烷烃及芳烃代谢为主的降解特性，补强混合菌剂具有更强的脂肪酸降解的特性。

实施例2混合菌剂在电动-微生物协同修复石油烃污染土壤中的应用

试验所用污染土壤采自油田区石油烃污染土壤，土壤中石油烃含量达4.6％(w/w)，待处理土壤经去除肉眼可见杂草杂质等后，自然风干，过2mm筛备用。土壤初始性质包括，pH 7.2，土壤总离子含盐量1.2％(w/w)，将土壤水分含量调至23％(w/w)后待处理用。

试验设置如表1所示，共设置六组处理，分别记为对照(CK)、电动处理A(EK-A)、电动处理B(EK-B)、微生物处理(Bio)、电动-微生物协同处理A(EK-Bio-A)及电动-微生物协同处理B(EK-Bio-B)。

含微生物的修复处理组(Bio、EK-Bio-A、EK-Bio-B)处理开端均施加如实施例1中所制备的初始混合菌剂，施加后土壤中细菌微生物数量达5.2×10⁸CFU·g^-1。石油烃污染土壤电动修复装置为长28cm×宽15cm×高14cm的盒体(图1)，每个盒体内装入1600g石油烃污染土壤；电动修复所用电极采用不锈钢棒状电极，电极直径为1.2cm，高为18cm，两侧电极间距为24cm，施加24V直流电压。

表1各试验处理设置的基本情况与试验参数表。

试验每7d为一个取样周期，样品采集后监测石油烃及石油烃族组分含量，当石油烃族组分中烷烃总降解率达42％时，施加补强混合菌剂，使土壤内细菌微生物总量达6.1×10⁸CFU·g^-1，继续进行修复处理，电动处理组B(EK-B)和电动-微生物处理组(EK-Bio-A及EK-Bio-B)中定期跟踪监测土壤pH值参数变化，当阳极端pH值小于6时或阴极端pH值大于8时补给1mol/L>

试验结果表明，随着电动处理的持续进行，土壤pH出现极端酸碱化，影响细菌微生物数量(图3)；然而，通过调节有效调控土壤pH在6～7的水平，但土壤内电极两侧总盐含量在电动处理后期显著提高，土壤盐渍化明显(图2)，导致在土壤pH得到了有效调节的电动处理B(EK-B)中土著微生物数量仍然显著降低。当施加初始混合菌剂B后，微生物数量得到有效维持(图3)，但处理后期，有机酸的积累在此限制了微生物的活性，当在电动-微生物协同处理B中施加补强混合菌剂之后，微生物数量得到补给，代谢活性得到有效延续。总的石油烃降解率测定表明，初始混合菌剂的施用显著加速了初期石油烃的降解去除，而补强菌剂的加入则进一步优化了石油烃的高效持续降解过程，处理63d后，石油烃总降解率达到40.1％(图4)，较未施加补强混合菌剂的处理组石油烃的降解率提高8％。由此表明，混合菌剂适宜于在电动-微生物协同修复技术处理中的应用，达到克服电极端“离子堆积”的不利条件的目的；且针对于烷烃、PAHs及脂肪酸代谢的功能互补作用，使得初始混合菌剂与补强混合菌剂的组合应用方式更有利于发挥功能菌剂的修复功能。