一株海洋假交替单胞菌及其脱色絮凝剂制法

摘要

本发明公开了一株海洋假交替单胞菌及其脱色絮凝剂制法，海洋假交替单胞菌是从中国浙江舟山朱家尖一处海水养殖场养殖的菲律宾蛤仔吐泥中分离筛选获得，经鉴定为假交替单胞菌（

说明书

技术领域

本发明涉及微生物絮凝剂制法领域，具体是一株海洋假交替单胞菌及其脱色絮凝剂制法。

背景技术

絮凝技术被广泛应用在给水、废水絮凝净化、发酵工业、固液分离等方面，絮凝效果取决于选取的絮凝剂的种类。 目前，用于水处理行业的絮凝剂主要有两大类 ：以铝系、铁系及其聚合物为代表的无机絮凝剂和以PAM及其衍生物为代表的有机高分子絮凝剂。它们凭借其在使用过程中絮凝效果好且成本低得到广泛的应用，但是它们对环境存在不安全性已引起人们足够的重视。 铝系絮凝剂中铝离子易引起老年性痴呆症 ；铁系絮凝剂中铁离子对金属有腐蚀作用，容易引起处理后水中带有颜色，增加污泥处理负荷；PAM的单体有很强的神经毒性，有很强的致癌性。

发明内容

本发明的目的在于提供一株海洋假交替单胞菌及其脱色絮凝剂制法，假交替单胞菌液体发酵培养基成本低，絮凝剂有效成分分离操作简单，制得的絮凝剂脱色率高，形成的絮团大，沉降速度快，性能稳定，脱色絮凝效果好；对生物体无潜在毒性，绿色健康。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一株海洋假交替单胞菌，从中国浙江舟山朱家尖一处海水养殖场养殖的菲律宾蛤仔吐泥中分离筛选获得，经鉴定为假交替单胞菌（Pseudoalteromonassp.），于2016年8月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC>

上述海洋菌株16S rDNA全基因（1277bp）已向美国国家生物技术信息中心（NCBI）的GenBank基因序列数据库提交，登陆号为KX702262。其全序列如下：

ATGCTTGGGAACATGCCTTGAGGTGGGGGACAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATAATGTCTACGGACCAAAGGGGGCTTCGGCTCTCGCCTTTAGATTGGCCCAAGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCAGGAGGAAAGGTTAGTAGTTAATACCTGCTATCTGTGACGTTACTGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTACGCAGGCGGTTTGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTCGAACTGGCAAACTAGAGTGTGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAACACTGACGCTCATGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACGGGATTAGATACCCCGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTAGAAGCTCGGAGCCTCGGTTCTGTTTTTCAAAGCTAACGCATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACACTTGACATACAGAGAACTTACCAGAGATGGTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCCTTAGTTGCTAGCAGGTAATGCTGAGAACTCTAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGTGCTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCGAATCACTTAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGTATCAGAATGACGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGC。

一株海洋假交替单胞菌的筛选方法为：采集新鲜菲律宾蛤仔，放入无菌水中吐泥，取1ml泥，采用梯度稀释倒平板分离和划线纯化，经活性测试筛选出具有高絮凝和脱色活性的菌株Pseudoalteromonassp.>

一株海洋假交替单胞菌的脱色絮凝剂制法，包括种子液培养、液体培养基的制备、扩大发酵培养、脱色絮凝剂的制备。其中，液体培养基的成分为：农作物废弃物水解液150-250ml/L、硫酸铵0.5-1.0g/L、酵母膏0.4-0.6g/L、磷酸氢二钾1.5-5 g/L、磷酸二氢钾0.4-2g/L和余量陈化海水或人工海水；调节pH为7.2-7.4，115-121℃高压灭菌20-30min。其中，人工海水配方为：氯化钠25.0 g/L、氯化镁1.9g/L、硫酸镁3.1 g/L、氯化钙1.3 g/L、碳酸氢钠0.2 g/L、氯化钾0.68g/L、溴化钠0.06 g/L、硼酸0.058 g/L、硅酸钠0.0024 g/L、磷酸0.002 g/L、六氯化二铝 0.014 g/L、氨水 0.002 g/L、硝酸锂 0.0014g/L、蒸馏水余量。农作物废弃物水解液代替葡萄糖为海洋假交替单胞菌提供碳源，大幅降低了培养基的制备成本。在发酵培养期间，本发明的海洋细菌可充分利用培养基中的碳源、氮源及生长因子，进行旺盛的新陈代谢，产生大量的代谢产物---胞外多糖。

作为优选，农作物废弃物水解液的制备方法为：将农作物废弃物切段烘干后粉碎过筛，按料液比1:4-10加入0.7-2.5%硫酸水解，水解温度为105-121℃，水解时间为1-4h，水解完加入氢氧化钙调节至中性，高速离心取上清液即为农作物废弃物水解液。无机酸将分子量大的纤维素水解成小分子糖，使得海洋假交替单胞菌可轻松将其作为碳源进行利用。以农作物废弃物为原料制备海洋假交替单胞菌的液体发酵培养基，变废为宝，大幅降低絮凝剂的制备成本。

作为优选，种子液培养步骤为先在斜面培养基上接种保藏号为CGMCC No. 12913的海洋细菌Pseudoalteromonassp.>

作为优选，扩大发酵培养步骤为每100ml液体发酵培养基接入0.2-0.5ml种子液和6-9g载体，于22-27℃恒温摇床发酵培养；摇床速率为100-140r/min，发酵培养时间为24-72h；载体为沙土，沙土重量比组成为60-90%沙和10-40%土。在发酵培养期间，海洋细菌可充分利用培养基中的碳源、氮源及生长因子，进行旺盛的新陈代谢，产生大量的代谢产物---胞外多糖；胞外多糖具有优异的脱色絮凝效果。

作为优选，脱色絮凝剂的制备步骤为将发酵液静置或低速离心，取下层固体，喷雾干燥或冷冻干燥得到絮凝剂。海洋细菌附着在沙土上生长繁殖，并随沙土一起沉降，同时菌种的代谢产物---胞外多糖可以一并获取。上述脱色絮凝剂有效成分分离操作简单，无需醇沉操作，降低人工成本和材料成本。脱色絮凝剂用量少，脱色率高，形成的絮团大，沉降速度快，性能稳定，脱色絮凝效果好；对生物体无潜在毒性，绿色健康。

作为优选，斜面培养基成分为：葡萄糖15-25g/L、尿素0.44-0.52g/L、硫酸铵0.19-0.24g/L、酵母膏0.4-0.6g/L、磷酸氢二钾1.5-5 g/L、磷酸二氢钾0.4-2g/L、琼脂12-17g/L和余量陈化海水或人工海水；调节pH为7.2-7.4，115-121℃高压灭菌20-35min。其中，人工海水配方为：氯化钠25.0 g/L、氯化镁1.9g/L、硫酸镁3.1 g/L、氯化钙1.3 g/L、碳酸氢钠0.2 g/L、氯化钾0.68g/L、溴化钠0.06 g/L、硼酸0.058 g/L、硅酸钠0.0024 g/L、磷酸0.002g/L、六氯化二铝 0.014 g/L、氨水 0.002 g/L、硝酸锂 0.0014g/L、蒸馏水余量。上述培养基不仅能提供适合本发明海洋细菌适宜的环境，还能提供菌种生长繁殖所需的碳源、氮源及生长因子，菌种的繁殖速度快，并且能诱导菌种分泌产生大量的胞外多糖，胞外多糖产量提高。

作为优选，沙土优选菲律宾蛤仔养殖地的天然沙土。菲律宾蛤仔养殖地的天然沙土对于絮凝剂产生菌有极佳的粘附性能，使得絮凝剂能简单地从培养液中分离出来，且分离率很高。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1.以农作物废弃物为原料制备海洋假交替单胞菌的液体发酵培养基，变废为宝，大幅降低絮凝剂的制备成本；

2. 沙土对于絮凝剂产生菌有极佳的粘附性能，使得絮凝剂能简单地从培养液中分离出来，且分离率很高；

3. 脱色絮凝剂用量少，脱色率高，形成的絮团大，沉降速度快，性能稳定，脱色絮凝效果好；对生物体无潜在毒性，绿色健康。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

一株海洋假交替单胞菌，从中国浙江舟山朱家尖一处海水养殖场养殖的菲律宾蛤仔吐泥中分离筛选获得，经鉴定为假交替单胞菌（Pseudoalteromonassp.），于2016年8月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC>

一株海洋假交替单胞菌的筛选方法为：采集新鲜菲律宾蛤仔，放入无菌水中吐泥，取1ml泥，采用梯度稀释倒平板分离和划线纯化，经活性测试筛选出具有高絮凝和脱色活性的菌株Pseudoalteromonassp.>

一株海洋假交替单胞菌的脱色絮凝剂最优选制法，包括以下步骤：

1）种子液培养：先在斜面培养基上接种保藏号为CGMCC No. 12913的海洋细菌Pseudoalteromonassp.>

2）液体培养基的制备：按照以下成份及其浓度配置液体培养基：芦苇秸秆水解液200ml/L、硫酸铵0.7g/L、酵母膏0.5g/L、磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.3g/L和余量陈化海水；调节pH为7.3，121℃高压灭菌20min。其中，芦苇秸秆水解液的制备方法为：将芦苇秸秆切段烘干后粉碎过筛，按料液比1:8加入1.7%硫酸水解，水解温度为121℃，水解时间为2h，水解完加入氢氧化钙调节至中性，高速离心取上清液即为芦苇秸秆水解液；

3）扩大发酵培养：每100ml液体发酵培养基接入0.4ml种子液和8g载体，于25℃恒温摇床发酵培养；摇床速率为140r/min，发酵培养时间为36h；载体为菲律宾蛤仔养殖地的天然沙土，沙土重量比组成为70%沙和30%土；

4）絮凝剂的制备：将发酵液静置3h，取下层固体，冷冻干燥得到脱色絮凝剂。

斜面培养基成分为：葡萄糖20g/L、尿素0.48g/L、硫酸铵0.21g/L、酵母膏0.54g/L、磷酸氢二钾3.8g/L、磷酸二氢钾1.2g/L、琼脂16g/L和余量陈化海水；调节pH为7.3，121℃高压灭菌20min。

实施例2：

一株海洋假交替单胞菌的脱色絮凝剂制法，包括以下步骤：

1）种子液培养：先在斜面培养基上接种保藏号为CGMCC No. 12913的海洋细菌Pseudoalteromonassp.>

2）液体培养基的制备：按照以下成份及其浓度配置液体培养基：水稻秸秆水解液250ml/L、硫酸铵1.0 g/L、酵母膏0.6g/L、磷酸氢二钾4.1g/L、磷酸二氢钾1.2g/L和余量人工海水；调节pH为7.4，115℃高压灭菌30min。其中，人工海水配方为：氯化钠25.0 g/L、氯化镁1.9g/L、硫酸镁3.1 g/L、氯化钙1.3 g/L、碳酸氢钠0.2 g/L、氯化钾0.68g/L、溴化钠0.06g/L、硼酸0.058 g/L、硅酸钠0.0024 g/L、磷酸0.002 g/L、六氯化二铝 0.014 g/L、氨水0.002 g/L、硝酸锂 0.0014g/L、蒸馏水余量。其中，水稻秸秆水解液的制备方法为：将水稻秸秆切段烘干后粉碎过筛，按料液比1:10加入2.1%硫酸水解，水解温度为121℃，水解时间为1.5h，水解完加入氢氧化钙调节至中性，高速离心取上清液即为水稻秸秆水解液；

3）扩大发酵培养：每100ml液体发酵培养基接入0.4ml种子液和9g载体，于24℃恒温摇床发酵培养；摇床速率为130r/min，发酵培养时间为72h；载体为菲律宾蛤仔养殖地的天然沙土，沙土重量比组成为80%沙和20%土；

4）絮凝剂的制备：将发酵液低速离心，取下层固体，喷雾干燥得到脱色絮凝剂。

斜面培养基成分为：葡萄糖22g/L、尿素0.48g/L、硫酸铵0.20g/L、酵母膏0.6g/L、磷酸氢二钾3.1 g/L、磷酸二氢钾1.2g/L、琼脂15g/L和余量人工海水；调节pH为7.3，121℃高压灭菌30min。其中，人工海水配方为：氯化钠25.0 g/L、氯化镁1.9g/L、硫酸镁3.1 g/L、氯化钙1.3 g/L、碳酸氢钠0.2 g/L、氯化钾0.68g/L、溴化钠0.06 g/L、硼酸0.058 g/L、硅酸钠0.0024 g/L、磷酸0.002 g/L、六氯化二铝 0.014 g/L、氨水 0.002 g/L、硝酸锂0.0014g/L、蒸馏水余量。

实施例3：絮凝活性的测定

采用絮凝活性测试法 (R.Kurane，K.Takeda，T.Suzuki.Screening andCharacteristeristics of Microbial Flocculants.Agric.Biol.Chem.1986 ：2301-2307) 对高岭土悬浊液的絮凝活性进行测定，取5g/L的高岭土悬浊液93ml，加入5ml 1％(m/v)CaCl₂做助凝剂，加入>

实施例4：脱色活性测定

取10ml亚甲基蓝和孔雀石绿(10mg/L)以及10mL结晶紫(20mg/L)于大试管中，加入 1ml浓度为 2g/L 的实施例1样品，漩涡振荡 1min，调节溶液 pH 值为9，静置 30min ，取水平面下 1cm 处的溶液，测定相应染料在最大吸收波长处的吸光度，脱色前溶液的吸光度为A，脱色后溶液的吸光度为A₀，计算脱色率，DR(％)>0)/A×100％。则絮凝剂对亚甲基蓝、孔雀石绿和结晶紫的脱色率分别为>

实施例5：沉降实验

在培养进入生长稳定期的100ml新鲜小球藻藻液中加入1ml浓度为2g/L的实施例1样品，混合快速搅拌1min，再慢速搅拌5min，静置30min，小球藻沉降率78%。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江海洋大学

<120> 一株海洋假交替单胞菌及其脱色絮凝剂制法

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1277

<212> DNA

<213> 海洋菌株Pseudoalteromonas sp. GHS18

<400> 1

atgcttggga acatgccttg aggtggggga caacagttgg aaacgactgc taataccgca 60

taatgtctac ggaccaaagg gggcttcggc tctcgccttt agattggccc aagtgggatt 120

agctagttgg tgaggtaatg gctcaccaag gcgacgatcc ctagctggtt tgagaggatg 180

atcagccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat 240

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ttgtaaagca ctttcagtca ggaggaaagg ttagtagtta atacctgcta tctgtgacgt 360

tactgacaga agaagcaccg gctaactccg tgccagcagc cgcggtaata cggagggtgc 420

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gaaagccccg ggctcaacct gggaactgca tttcgaactg gcaaactaga gtgtgataga 540

gggtggtaga atttcaggtg tagcggtgaa atgcgtagag atctgaagga ataccgatgg 600

cgaaggcagc cacctgggtc aacactgacg ctcatgtacg aaagcgtggg gagcaaacgg 660

gattagatac cccggtagtc cacgccgtaa acgatgtcta ctagaagctc ggagcctcgg 720

ttctgttttt caaagctaac gcattaagta gaccgcctgg ggagtacggc cgcaaggtta 780

aaactcaaat gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgatg 840

caacgcgaag aaccttacct acacttgaca tacagagaac ttaccagaga tggtttggtg 900

ccttcgggaa ctctgataca ggtgctgcat ggctgtcgtc agctcgtgtt gtgagatgtt 960

gggttaagtc ccgcaacgag cgcaacccct atccttagtt gctagcaggt aatgctgaga 1020

actctaagga gactgccggt gataaaccgg aggaaggtgg ggacgacgtc aagtcatcat 1080

ggcccttacg tgtagggcta cacacgtgct acaatggcgc atacagagtg ctgcgaactc 1140

gcgagagtaa gcgaatcact taaagtgcgt cgtagtccgg attggagtct gcaactcgac 1200

tccatgaagt cggaatcgct agtaatcgcg tatcagaatg acgcggtgaa tacgttcccg 1260

ggccttgtac acaccgc 1277