一种预测纤维素结晶度的方法

摘要

本发明公开了一种预测纤维素结晶度的方法，该预测方法通过构建碳水化合物结合单元—荧光蛋白探针，可以与各种预处理的纤维素进行结合，通过荧光检测，即可对纤维素的结晶度进行预测。本发明方法只需通过荧光检测即可对纤维素的结晶度进行预测，解决了纤维素经过XRD测定时可能会改变结晶度以及无法测定含水样品等问题，为纤维性改性、加工及处理等提供重要的理论依据，具备商品化的开发潜力。

说明书

技术领域

本发明属于生物能源领域，涉及一种利用碳水化合物结合单元—荧光蛋白探针与纤维素进行结合，通过荧光检测即可预测纤维素结晶度的方法。

背景技术

纤维素是地球上最古老、最丰富的天然高分子，是取之不尽用之不竭的人类最宝贵的天然可再生资源。纤维素是一种由重复的D-葡糖酸糖分子组成的线性大分子，它与1,4-糖基键相连，是大多数植物所制造的木质纤维素材料的主要成分，是生物燃料工业的主要潜在原料。

纤维素结构特点：纤维素是由β-D-吡喃型葡萄糖基(失水葡萄糖)组成。简单分子式为(C₆H₁₀O₅)_n。纤维素与很多其他高聚物一样是多晶，即由无数微晶体与非晶区交织在一起的。其结晶的程度视纤维品种而异。天然纤维素，如苎麻的结晶度略高于70％，而再生纤维素如粘胶纤维则只有35％左右。纤维素结晶度在一定程度上反应纤维的物理力学和化学性能，也直接影响材料的性能，是评价生物质材料性能和纤维品质的重要依据。

纤维素链之间的氢键以及葡萄糖分子之间的范德华力等作用力使得纤维素形成了有序的晶体区域和相关的晶格。目前广泛使用的测量纤维素结晶度方法主要有：x射线粉末衍射(XRD法)，红外光谱法(IR)，固态¹³C核磁共振法，密度测量法，振动和频率生成(SFG)光谱，以及最近发展起来的红外拉曼检测。

纤维素结晶度测定之后还需使用不同软件进行计算，计算方法主要包括：切线法，高度法，分峰法等等。

碳水化合物-结合模块(CBM)是一种多肽模块，在许多碳水化合物活性酶中发现，它可以与不同的碳水化合物结合。CBMs的主要功能是促进基质联合和催化活性酶对基质的催化效率。具有结合纤维素的CBMs可分为三种类型:A型CBMs可以与晶体纤维素结合，B型CBMs包含与非晶态纤维素区域相关联的单聚糖链，而C型CBMs只与小的糖结合。本发明所使用的CBMs类型为A型和B型。

现有方法均没有提及通过荧光测定即可预测纤维素结晶度的方法。本发明为了定量研究纤维素的结晶度，我们设计了可以与纤维素进行结合的荧光蛋白探针，利用对荧光强度的测量对二者的吸附率进行了计算，并观察了吸附率与XRD结晶之间的线性关系，由此可以对纤维素的结晶度进行预测。

本发明的方法不但方便快捷，适应范围也更加广泛，样品可以无需干燥，也无需研磨，避免了在干燥和研磨过程中造成的结晶度的损失和下降，同时，更加避免了在获得数据后在处理数据过程中的人为误差。可以说本方法无论是在样品处理过程还是在数据处理过程都大大提高了数据的准确性。如此便捷准确的纤维素结晶度预测方法，在生物质能源利用过程中尤为重要，其商业化应用前景也随之凸显。

发明内容

本发明目的在于提供一种预测纤维素结晶度的新方法。

为此，本发明提供了一种碳水化合物结合单元—荧光蛋白探针与纤维素进行结合，通过荧光检测即可预测纤维素结晶度的方法。所述方法包括先将所述纤维素通过酸处理、碱处理或球磨处理后获得经预处理的纤维素，并将其与制备好的荧光蛋白探针相结合，通过测定其荧光强度变化进而预测其结晶度。

一种预测纤维素结晶度的方法，其步骤为：先构建碳水化合物结合单元—荧光蛋白探针，为后续纤维素结晶度预测做准备；再通过荧光蛋白探针与纤维素底物结合前后上清中荧光强度的变化率来表示探针与纤维素底物的结合率，通过建立二者结合能力与纤维素标准品结晶度的线性关系，利用线性关系对纤维素样品的结晶度进行预测。

对于上文所述的技术方案，所述碳水化合物结合单元—荧光蛋白探针是对CBM编码基因进行全基因合成获得，再与荧光蛋白编码基因融合，表达形成可以与处理过纤维素进行结合的荧光探针。

对于上文所述的技术方案，所述的将合成的CBM编码基因与荧光蛋白编码基因融合表达的方法为：分别全基因合成CBM和荧光蛋白的编码基因，首先利用重叠延伸PCR将两部分基因利用5×甘氨酸连接臂进行融合。随后将融合的基因连接至带有亲和纯化标签的大肠杆菌表达载体中，并转化到大肠杆菌菌株中进行表达和亲和纯化。

对于上文所述的技术方案，所述蛋白质纯化用的标签包括组氨酸标签、GST标签和MBP标签中的一种或多种。

对于上文所述的技术方案，所述的碳水化合物结合单元CBM包括CBM1、CBM2a、CBM3、CBM17和CBM28中的一种或多种。CBM后面的数字代表一个家族蛋白，例如CBM17家族可以从不同来源的微生物中获得。在本发明的实施例中的CBM编码基因，源自一株耐热的褐色高温单孢菌Thermomonosporafusca和一株约氏梭菌Clostridium josui。

对于上文所述的技术方案，所述的荧光蛋白包括绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和青色荧光蛋白中的一种或几种。

所述荧光蛋白探针与纤维素底物结合条件为：在pH 5.5-8.5浓度1-30mM的磷酸缓冲液中加入浓度为5-50μg/mL的荧光蛋白探针，反应温度为20-60℃，反应时间为0-100min；

所述纤维素底物需经过前处理，前处理方法包括酸处理、碱处理和球磨处理中的一种或多种。

其中，所述酸处理过程是将所述纤维素在60％-85％磷酸0-25℃搅拌1-3h进行预处理，然后再加入0℃的丙酮进行搅拌，最后经洗涤和冻干得到预处理的纤维素；

所述碱处理过程是将所述纤维素在1-30％的氢氧化钠溶液中，0-25℃搅拌0-12h进行预处理，然后除去氢氧化钠之后，最后经洗涤和冻干得到预处理的纤维素；

所述的球磨处理过程是将所述纤维素的样品中加入(0.4-0.6mm)的玻璃珠，在20-30℃下以200-400rpm的速度处理2-12h，滤除玻璃珠后，最后经洗涤和冻干得到预处理的纤维素；

所述荧光探针与纤维素底物结合能力的定量分析是通过对二者结合后的反应体系上清中荧光强度的变化进行测定，计算吸附率，获得与结晶度的线性关系。

所述的处理好的纤维素与荧光探针的结合能力的定量分析是指通过对结合好的纤维素和荧光探针进行荧光强度的测定，将吸附率与结晶度进行计算获得线性关系。

所述的结晶度预测是指通过获得的线性关系对该纤维素的结晶度进行预测。

在一个优选实施方案中，所述纤维素为微晶纤维素、α纤维素、滤纸、秸秆纤维和松木纤维的天然纤维素或者半天然纤维素中的一种或多种。

在一个优选实施方案中，所述荧光探针与纤维素的结合能力的定量分析是通过对二者结合后的样品进行荧光强度的测定之后计算获得的。探针和纤维素的吸附率是通过相关的荧光强度计算得来的。

吸附率(％)＝100×(荧光强度_对照-荧光强度_终浓度)/荧光强度_对照

在一个优选实施方案中，所述荧光强度的测定条件为激发波长395nm，发射波长为475nm。

有益效果：本发明的方法首先对纤维素样品进行预处理，使之与构建的碳水化合物结合单元—荧光蛋白探针相结合，对纤维素与其结合能力进行定量分析，之后通过对荧光强度的测定即可对纤维素样品的结晶度进行预测，该方法可以应用到各种纤维素样品。本方法对纤维素样品要求低，无需烘干，也不会在测量结晶度过程中由于测量方法使结晶度造成损失，预测得到的纤维素结晶度结果与XRD测定的结晶度结果线性关系良好，既是准确可信的新方法，又为没有条件进行XRD测定的单位和个人提供方便便捷的方法，仅仅通过荧光强度的测量即可预测结晶度，为纤维素更好在应用提供了基础。

附图说明

图1是本发明的实施例1中的碳水化合物结合单元—荧光蛋白荧光探针的结构示意图；

图2是本发明的实施例1中的碳水化合物结合单元—荧光蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳图；

具体实施方式

本发明用酸碱或者球磨的方法对纤维素进行预处理，然后将其与制备好的碳水化合物结合单元—荧光蛋白荧光探针进行结合，之后通过对其荧光强度的变化进行测定，即可对纤维素的结晶度进行预测。

5×Gly核苷酸序列(15bp)ggtggtggtggtggt；

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

实施例1

酸处理方法:分别加入了30ml的冰水磷酸溶液，加入1g湿的微晶纤维素样品，最终达到酸浓度为70％(v/v)。将该混合物在0℃下搅拌60min，随后加入20ml的冰丙酮搅拌后，将样品用100ml的去离子水洗5次，直到洗至中性，处理好的样品冻干保存。

探针的构建：纤维素吸附实验所用的CBM-GFP探针构建流程如下：

一、来源于耐热褐色高温单孢菌(Thermomonospora fusca)中糖结合单元CBM2a的编码基因通过上海生工公司进行全基因合成，基因片段被亚克隆至载体pUC18形成重组载体pUC18-CBM2a，CBM2a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；含有绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein,GFP)的编码基因的商品化载体pVision-GFP-N购买于Biovison公司，GFP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

二、利用重叠延伸PCR将合成的CBM2a编码基因通过5×甘氨酸连接臂与GFP编码基因进行融合，具体反应体系及反应条件如下：

①带有GFP部分重叠序列的CBM2a基因片段的扩增：

反应体系包括20μM上游引物F2a(5’-gccGAATTCatgtgctcggtggactac-3’，gcc为保护碱基，下划线为EcoRI酶切位点)，20μM下游引物R2a(5’-gttcttctcctttactcatACCACCACCACCACCgcaggtaaccccgttcag-3’，前部分小写序列为扩增CBM2a下游引物，中间大写序列为5×甘氨酸序列，后段小写序列为GFP的5’端序列)，0.5μLDNA聚合酶PrimeSTAR>

②带有CBM2a部分重叠序列的GFP基因片段的扩增：

体系包括20μM上游引物Fgfp(5’-ctgaacggggttacctgcGGTGGTGGTGGTGGTatgagtaaaggagaagaac-3’，前部分小写序列为扩增CBM2a下游序列，中间大写序列为5×甘氨酸序列，后段小写序列为GFP的上游引物)，20μM下游引物Rgfp(5’-ctcAAGCTTtttgtagagctcatccatgc-3’，ctc为保护碱基，下划线为HindIII酶切位点)，0.5μL>

③将①和②获得的CBM2a和GFP基因片段纯化后作为模板进行重叠延伸PCR反应，体系为：模板各50ng，20μM上游引物F2a，20μM下游引物Rgfp，0.5μL DNA聚合酶PrimeSTARHS，10μL 5×buffer，4μL 2.5mM dNTPs，纯水补充体积反应液总体积为50μL。

PCR反应条件为：98℃ 5min，94℃ 45s，55℃ 40s，72℃ 3.5min，30个循环，72℃10min，20℃结束反应，将PCR反应获得的CBM2a-GFP融合基因片段利用胶回收试剂盒进行纯化。所获得的荧光探针示意图如图1所示，电泳图如图2所示；

三、将CBM2a-GFP融合基因与大肠杆菌表达载体pET32a利用EcoRI和HindIII分别进行双酶切，酶切反应的体系及条件为：EcoRI和HindIII各1μL，CBM2a-GFP或pET32a 1μg，1μL 10×buffer，纯水补充体积反应液总体积为10μL，将反应体系于37℃反应2h，利用胶回收试剂盒将双酶切片段进行纯化；

四、双酶切的将CBM2a-GFP融合基因与pET32a进行连接，反应的体系及条件为：CBM2a-GFP与pET32a片段各100ng，T4DNA ligase 1μL，10×ligation buffer 1μL，纯水补充体积反应液总体积为10μL，将反应体系于16℃反应2h；

五、将连接体系利用热激转化法转化至大肠杆菌感受DH5a态细胞中，反应体系及反应条件如下：10μL连接体系加入至100μL大肠杆菌感受态细胞中，冰上孵育30min，于42℃热激60s后立即置于冰上冷却2min，将800μL的LB培养基加入至转化体系中，于37℃ 150rpm培养45min，随后取100μL菌液涂布于含有50μM氯霉素的LB固体平板，37℃温箱培养12h；

六、将转化平板上生长的阳性转化子接菌至含有50μM氯霉素的5mL LB液体培养基中，37℃ 200rpm培养12h，利用质粒纯化试剂盒进行质粒提取，获得的质粒送至TaKaRa大连公司进行测序，确定正确的表达载体为pET32-CBM2a-GFP；

七、利用热激转化法将pET32-CBM2a-GFP转化至大肠杆菌表达菌株Rosetta-gamiB(DE3)-plysS中，转化方法同(五)中描述，重组菌命名为DH-CBM2a-GFP；

八、将DH-CBM2a-GFP接菌于200mL LB液体培养基中，37℃ 200rpm培养至OD_600nm为0.6，加入IPTG至终浓度为1mmol/L；16℃，200rpm诱导20h；5000g离心6min收集菌体，70mLNative>

以上探针构建所用的引物由上海生工公司合成；PCR及酶切连接反应所需的酶及各试剂均购自TaKaRa大连公司；大肠杆菌克隆菌株DH5a、表达菌株Rosetta-gamiB(DE3)-plysS及表达载体pET32a购自Novagen公司；Ni亲和填料及相关试剂购自GE healthcare公司。Bio-Rad试剂盒购自Bio-Rad美国公司。

纤维素与荧光探针的结合：制备好荧光探针后，将其与之前处理好的纤维素进行结合。

首先，向pH为6，浓度为15mM的磷酸缓冲液中加入浓度为25μg/mL的CBM-GFP探针，反应体系在35℃搅拌25min后，取1mL反应混合液在4℃，12000g离心5min，取800μL上清液进行荧光强度测定。

荧光强度是用F-4600荧光分光光度计(激发波长395nm，发射波长为475nm)测得的。

探针与纤维素吸附率与结晶度线性关系的建立：探针和纤维素的吸附率是通过相关的荧光强度计算得来的。

吸附率(％)＝100×(荧火强度_对照-荧光强度_终浓度)/荧火强度_对照

计算得到的吸附率为40.1％。

通过吸附率对纤维素结晶度进行预测：通过吸附率对纤维素结晶度进行预测，结果为69.5％，同时拿所测样品进行XRD测定，结晶度为74.7％，将预测的结果与XRD测定结果进行比较，结果十分接近。

XRD测定的结晶度的计算公式如下：

结晶度＝100×(I₀₀₂-I_am)/I₀₀₂(1)

注：当样品为I型纤维素时使用公式(1)，样品为II型纤维素时使用公式(2)

实施例2

碱处理方法：1g的α纤维素样品加入到50ml浓度为10％的氢氧化钠溶液中浸泡，在0℃下搅拌9h。之后使用过滤的方法去除氢氧化钠溶液，用100ml去离子水洗五次，洗至中性。清洗后的滤饼冻干处理。

探针的构建：同实施例1。

纤维素与荧光探针的结合：制备好荧光探针后，将其与之前处理好的纤维素进行结合。

首先，向pH为7，浓度为25mM的磷酸缓冲液中加入浓度为5μg/mL的CBM-GFP探针，反应体系在55℃搅拌55min后，取1mL反应混合液在4℃，12000g离心5min，取800μL上清液进行荧光强度测定。

荧光强度测定同实施例1。

探针与纤维素吸附率与结晶度线性关系的建立：探针和纤维素的吸附率是通过相关的荧光强度计算得来的。计算公式同实施例1。计算得到的吸附率为34.4％。

通过吸附率对纤维素结晶度进行预测：通过吸附率进行纤维素结晶度的预测，预测结果为60.1％，同时拿所测样品进行XRD测定，测定后对其结晶度进行计算，计算公式同实施例1。计算得到的结晶度为61.1％，将预测的结果与XRD测定结果进行比较，预测结果非常准确。

实施例3

球磨处理：在20ml的2.5％(w/v)的滤纸样品中，加入5g玻璃珠(0-4-0.6mm)，在30℃下，以400rpm的转速处理24h。玻璃珠滤除后，将滤饼冻干。

探针的构建：同实施例1。

纤维素与荧光探针的结合：制备好荧光探针后，将其与之前处理好的纤维素进行结合。首先，向pH为8，浓度为5mM的磷酸缓冲液中加入浓度为35μg/mL的CBM-GFP探针，反应体系在15℃搅拌85min后，取1mL反应混合液在4℃，12000g离心5min，取800μL上清液进行荧光强度测定。

荧光强度测定同实施例1。

探针与纤维素吸附率与结晶度线性关系的建立：探针和纤维素的吸附率是通过相关的荧光强度计算得来的。计算公式同实施例1。计算得到的吸附率为45.9％。

通过吸附率对纤维素结晶度进行预测：通过吸附率进行纤维素结晶度的预测结果，预测结果为79.3％，同时拿所测样品进行XRD测定，测定后对其结晶度进行计算，计算公式同实施例1。计算得到的结晶度为75.1％，将预测的结果与XRD测定结果进行比较，预测结果非常接近。

实施例4

酸处理方法:加入30ml的冰水磷酸溶液，加入1g秸秆纤维样品，最终达到酸浓度为82.3％(v/v)。将该混合物在0℃下搅拌60min，随后加入20ml的冰丙酮搅拌后，将样品用100ml的去离子水洗5次，直到洗至中性，处理好的样品冻干保存。

探针的构建：纤维素吸附实验所用的CBM-GFP探针构建流程如下：一、来源于约氏梭菌(Clostridium josui)中糖结合单元CjCBM17的编码基因通过上海生工公司进行全基因合成，基因片段被亚克隆至载体pUC18形成重组载体pUC18-CjCBM17，CjCBM17基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；后续所有探针的构建方法同实施例1。

纤维素与荧光探针的结合：制备好荧光探针后，将其与之前处理好的纤维素进行结合。首先，向pH为5.5，浓度为35mM的磷酸缓冲液中加入浓度为15μg/mL的CBM-GFP探针，反应体系在45℃搅拌45min后，取1mL反应混合液在4℃，12000g离心5min，取800μL上清液进行荧光强度测定。

荧光强度测定同实施例1。

探针与纤维素吸附率与结晶度线性关系的建立：探针和纤维素的吸附率是通过相关的荧光强度计算得来的。计算公式同实施例1。计算得到的吸附率为24.1％。

通过吸附率对纤维素结晶度进行预测：通过吸附率进行纤维素结晶度的预测结果，预测结果为42.7％。同时拿所测样品进行XRD测定，测定后对其结晶度进行计算，计算公式同实施例1。计算得到的结晶度为45.3％，将预测的结果与XRD测定结果进行比较，预测结果十分可信。

实施例5

碱处理方法：5g松木刨花纤维样品加入到50ml的浓度为2％的氢氧化钠溶液中浸泡，在121℃下搅拌30min。之后使用过滤的方法去除氢氧化钠溶液，用100ml去离子水洗五次，洗至中性。清洗后的滤饼冻干处理。

探针的构建：纤维素吸附实验所用的CBM-GFP探针构建流程如下：一、来源于约氏梭菌Clostridium josui中糖结合单元CjCBM28的编码基因通过上海生工公司进行全基因合成，基因片段被亚克隆至载体pUC18形成重组载体pUC18-CjCBM28，CjCBM28基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；后续所有探针的构建方法同实施例1。

纤维素与荧光探针的结合：制备好荧光探针后，将其与之前处理好的纤维素进行结合。首先，向pH为8.5，浓度为20mM的磷酸缓冲液中加入浓度为40μg/mL的CBM-GFP探针，反应体系在25℃搅拌65min后，取1mL反应混合液在4℃，12000g离心5min，取800μL上清液进行荧光强度测定。

荧光强度测定同实施例1。

探针与纤维素吸附率与结晶度线性关系的建立：探针和纤维素的吸附率是通过相关的荧光强度计算得来的。计算公式同实施例1。计算得到的吸附率为30.5％。

通过吸附率对纤维素结晶度进行预测：通过吸附率进行纤维素结晶度的预测结果，预测结果为53.5％。同时拿所测样品进行XRD测定，测定后对其结晶度进行计算，计算公式同实施例1。计算得到的结晶度为53.9％，将预测的结果与XRD测定结果进行比较，预测结果基本一致。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110> 大连工业大学

<120> 一种预测纤维素结晶度的方法

<130> 2015

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 300

<212> DNA

<213> CBM2a 基因的核苷酸序列

<400> 1

atgtgctcgg tggactacac ggtcaactcc tggggtaccg ggttcaccgc caacgtcacc 60

atcaccaacc tcggcagtgc gatcaacggc tggaccctgg agtgggactt ccccggcaac 120

cagcaggtga ccaacctgtg gaacgggacc tacacccagt ccgggcagca cgtgtcggtc 180

agcaacgccc cgtacaacgc ctccatcccg gccaacggaa cggttgagtt cgggttcaac 240

ggctcctact cgggcagcaa cgacatcccc tcctccttca agctgaacgg ggttacctgc 300

<210> 2

<211> 714

<212> DNA

<213> 绿色荧光蛋白GFP 核苷酸序列

<400> 2

atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60

gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120

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aaagatgacg ggaactacaa gacgcgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 360

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cttgagtttg taactgctgc tgggattaca catggcatgg atgagctcta caaa 714

11

<210> 3

<211> 618

<212> DNA

<213> CBM17 基因的核苷酸序列

<400> 3

atggtgtgga gcctgaaaga actgagcgtg agcggcgaat atgcgcgtgc gcgtattaaa 60

ggcattaaat atgaaccgat tgaacgtagc gaaaaagaag aatttaccac caatgtgtgg 120

gattttaatg atggcaccac ccagggcttt ggcattaatg gcgatagccc gattaaagcg 180

gatagcatta ccctggcgaa tgaaaaaaat gcgctgaaaa ttaccggcct gaataatagc 240

aatgatctga ccgaaggcaa ttattgggcg aatgtgcgtc tgagcgcgga tggcaccagc 300

aataaaccga atatttttgg cgcggaaaaa ctgaccatgg atgtgattac cgcggcgccg 360

gcgaccgtga gcattgcggc gattccgcag agcagcaccc atggctgggc gaatccgacc 420

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<210> 4

<211> 582

<212> DNA

<213> CBM28 基因的核苷酸序列

<400> 4

atgcgtgctg tggtagaagc acctgttgaa catgctccaa taggaaaggc aactcttcct 60

tcaacctttg aagattcaac ccgacaggga tgggcttggg atgctacctc aggagttcag 120

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