一种新萘醌类化合物及其制备方法和用途

摘要

本发明公开了一种新萘醌类化合物。该萘醌类化合物的分子式为C

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种新萘醌类化合物及其制备方法和用途。

背景技术

山葡萄(Vitis amurensis Rupr.)为是葡萄科葡萄属植物的果实。山葡萄广泛分布于我国各地，资源非常丰富。山葡萄作为一种传统的中药材在我国广泛使用，具有祛风湿、利尿、消炎、止血等作用。现代文献报道，山葡萄能够治疗风湿痹痛，对大鼠实验性关节炎疗效显著，并具有抗衰老、抗氧化等作用。对山葡萄进行成分提取及分离纯化，寻找其活性成分及新的药理活性，可以更好地利用山葡萄丰富的植物资源。

发明内容

本发明的目的在于从山葡萄中提取分离出一种新的萘醌类化合物，该化合物具有肝保护的活性。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

一种新萘醌类化合物，所述萘醌类化合物的分子式为C₁₉H₂₂O₃，结构式如下：

上述萘醌类化合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)山葡萄用乙醇水溶液提取，提取液浓缩，得到山葡萄总稠膏；

(2)将步骤(1)得到的山葡萄总稠膏上大孔吸附树脂柱，用乙醇水溶液进行梯度洗脱；

(3)将步骤(2)洗脱得到的馏分上硅胶柱，用氯仿-甲醇进行梯度洗脱；

(4)将步骤(3)洗脱得到的馏分上硅胶柱，用石油醚-丙酮进行梯度洗脱；

(5)将步骤(4)洗脱得到的馏分上半制备液相C18柱，用乙腈水溶液洗脱，波长210nm；

(6)将步骤(5)洗脱得到的馏分上葡聚糖凝胶柱，用甲醇水溶液洗脱，得到所述的萘醌类化合物。

优选地，步骤(1)中，用浓度为60～80vt％的乙醇水溶液提取山葡萄。

利用生物活性指导分离的方法，可采用MTT法检测在上述各柱分离过程中洗脱得到的馏分对肝星状细胞HSC-T6的抑制活性，从而对洗脱液进行筛选收集。

优选地，步骤(2)梯度洗脱时，乙醇水溶液的浓度由20vt％梯度变化至95vt％，优选地，乙醇水溶液的浓度梯度变化为20vt％→40vt％→60vt％→95vt％，收集乙醇水溶液浓度为60vt％时的馏分。

优选地，步骤(3)梯度洗脱时，氯仿-甲醇的体积比由10:1梯度变化至6:1，优选地，氯仿-甲醇的体积比梯度变化为10:1→8:1→6:1，收集氯仿-甲醇的体积比为8:1时的馏分。

优选地，步骤(4)梯度洗脱时，石油醚-丙酮的体积比由8:1梯度变化至4:1，优选地，石油醚-丙酮的体积比梯度变化为8:1→6:1→4:1，收集石油醚-丙酮的体积比为6:1时的馏分。

优选地，步骤(5)所述乙腈水溶液的浓度为85-90vt％，步骤(6)所述甲醇水溶液的浓度为95vt％。

优选地，步骤(3)所述硅胶柱采用100-200目的硅胶；和/或步骤(4)所述硅胶柱采用200-300目的硅胶；和/或步骤(6)所述葡聚糖凝胶柱为羟丙基葡聚糖凝胶柱。

上萘醌类化合物在制备肝保护药物中的应用，如在制备抗肝纤维化药物中的应用。

本发明选取药食两用果实--山葡萄作为研究对象，该原料资源丰富，营养价值高，并首次从山葡萄中得到了一种新的萘醌类化合物，其提取和分离方法简便、快捷，产率较高，且该萘醌类化合物具有显著的肝保护活性，对于研制肝保护药物具有重要意义。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是从山葡萄中提取分离出化合物I的流程示意图；

图2是化合物I的偶联相关图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

如无特别说明，本发明中“vt％”表示体积百分比。

一种新萘醌类化合物，所述萘醌类化合物的分子式为C₁₉H₂₂O₃，结构式如下：

从山葡萄中提取分离上述萘醌类化合物的步骤包括：

(1)山葡萄用乙醇水溶液提取，提取液浓缩，得到山葡萄总稠膏，可采用浓度为60～80vt％的乙醇水溶液提取山葡萄，如浓度为60vt％、65vt％、70vt％、75％或80vt％的乙醇水溶液，提取时料液无特别要求，可以在1:1-20；

(2)将步骤(1)得到的山葡萄总稠膏上大孔吸附树脂柱，用乙醇水溶液进行梯度洗脱，优选地，梯度洗脱时，乙醇水溶液的浓度由20vt％梯度变化至95vt％，如乙醇水溶液的浓度梯度变化为20vt％→40vt％→60vt％→95vt％，收集乙醇水溶液浓度为60vt％时的馏分；

(3)将步骤(2)得到的馏分上硅胶柱(100-200目)，用氯仿-甲醇进行梯度洗脱，优选地，梯度洗脱时，氯仿-甲醇的体积比由10:1梯度变化至6:1，如氯仿-甲醇的体积比梯度变化为10:1→8:1→6:1，收集氯仿-甲醇的体积比为8:1时的馏分；

(4)将步骤(3)得到的馏分上硅胶柱(200-300目)，用石油醚-丙酮进行梯度洗脱，优选地，梯度洗脱时，石油醚-丙酮的体积比由8:1梯度变化至4:1，如石油醚-丙酮的体积比梯度变化为8:1→6:1→4:1，收集石油醚-丙酮的体积比为6:1时的馏分；

(5)将步骤(4)得到的馏分上半制备液相C18柱，用浓度为85-90vt％的乙腈水溶液洗脱，波长210nm；

(6)将步骤(5)得到的馏分上葡聚糖凝胶柱，用浓度为95vt％的甲醇水溶液洗脱，得到所述的萘醌类化合物。

(7)可利用生物活性指导上述分离过程：在上述各柱分离过程中采用MTT法检测洗脱得到的各馏分对肝星状细胞HSC-T6的抑制活性，对各馏分进行筛选收集。

实施例1

(一)新萘醌类化合物的制备方法(流程如图1所示)

(1)将干燥的山葡萄果实(15.0千克)粉碎，用70vt％乙醇进行加热回流提取3次，每次2.5小时，合并滤液在低温(50℃)条件下干燥浓缩至无醇味，得到山葡萄总稠膏(0.86千克)；

(2)将步骤(1)得到的总稠膏上大孔吸附树脂(HP-20)柱，依次用20vt％、40vt％、60vt％、95vt％乙醇进行梯度洗脱，蒸干溶剂分别得到4个的馏分A(96.2克)、B(188.5克)、C、(205.7克)、D(75.6克)；

(3)利用生物活性指导分离的方法，采用MTT法(具体过程详见肝保护活性的测试方法，MTT：噻唑蓝)对上述馏分进行活性筛选，确定肝保护活性部位(C馏分)，后继的分离步骤也采用同样的方法筛选活性部位；

(4)将步骤(2)得到的C馏分上硅胶柱(100-200目)，用氯仿-甲醇作为流动相进行梯度洗脱(氯仿:甲醇＝10:1→8:1→6:1，体积比)，得到3个亚馏分：C-1(52.5克)、C-2(86.2克)、C-3(42.7克)；

(5)将步骤(4)得到的亚馏分C-2上硅胶柱(200-300目)，用石油醚-丙酮作为流动相进行梯度洗脱(石油醚:丙酮＝8:1→6:1→4:1，体积比)，得到3个次馏分：C-2-1(18.8克)、C-2-2(29.6克)、C-2-3(14.5克)；

(6)将步骤(5)得到的次馏分C-2-2上半制备液相(条件：C-18柱；流动相为88vt％乙腈；波长210nm；流速6mL/min)，得到2个细馏分C-2-2-1(12.4克)和C-2-2-2(9.7克)；

(7)将步骤(6)得到的细馏分C-2-2-2上Sephadex LH-20柱，用95vt％甲醇作为流动相进行洗脱，经过反复的分离、纯化，最终得到单体化合物I(8.75毫克)。

本发明得到的化合物I为黄色粉末(甲醇)，HR-ESI-MS m/z 321.2631[M+Na]⁺提示其分子组成为C₁₉H₂₂O₃(calcd.for>19H₂₂O₃Na，321.2633)，不饱和度为9。

化合物I的UV(MeOH)λ_max:210，322nm；IRν_max:3568.3，2924.4，1661.3，1356.2cm^-1；化合物I的¹H>6，400MHz)和¹³C>6，400MHz)数据见表1。

利用现代波谱技术和化合物I的HMBC、2D-NOESY、¹H-¹H>

表1化合物I的¹H>13C>

(二)化合物I的肝保护活性

肝纤维化(fibrosis of liver)实质是一种由多种原因病毒、代谢、药物、酒精、血吸虫等引起的慢性肝损伤的伤口愈合反应，它的主要表现是肝内细胞外基质(extracelluar matrix，ECM)在狄氏间隙(Space of Disse)的肝窦内皮细胞层大量过度沉积及所导致的肝脏功能的损伤。大量实验研究已经证实，活化的肝星状细胞(hepaticstellate cell，HSC)是过度沉积的ECM的主要来源，而且HSC的活化是肝纤维化发生发展过程中的核心环节，通过抑制HSC活化增殖可以减缓肝纤维化的发生发展。

(1)仪器、试剂和材料

DMEM培养液；肝星状细胞；小牛血清置于-20℃冰箱保存，在56℃水浴30min灭活后使用；青霉素(100IU/m L)；链霉素(100μg/m L)；PBS缓冲液；50mm²细胞培养瓶；96孔细胞培养板；酶标仪；显微镜；MTT溶液：MTT粉剂溶于pH为7.4的PBS溶液中，浓度为5mg/ml，避光、超声助溶，过滤除菌，现配现用。

(2)细胞培养

本发明采用的肝星状细胞HSC-T6为贴壁生长细胞株，采用含10％的小牛血清(FCS)的DMEM培养液，加入青霉素100IU/m L和链霉素100μg/m L进行培养。待细胞密度长到75％-90％时传代，传代时先弃去原培养液，再用PBS缓冲液洗涤3遍；然后用0.5％胰蛋白酶消化大约1min，再加入少量新鲜培养液终止消化，吹打多次至细胞大部分都吹下来，移取适量至新鲜培养瓶中，再补充新鲜培养液至原来的体积，培养环境为37℃，5％的CO₂培养箱，每2天更换一次培养液，取处于对数生长期的细胞进行实验。

(3)测定方法

将肝星状细胞HSC-T6以8×10⁴个/ml的浓度接种在96孔培养板中，每孔接种100μL。待细胞贴壁后，分为空白对照组(加入DMEM培养液100μL)、TGFβ1刺激的肝星状细胞对照组、6个不同浓度的受测化合物(3.125、6.25、12.5、25、50、100μmol/L)组，每组设5个复孔，每孔的总体积为200μL。待48h后加入MTT(浓度为5mg/m>490)值，利用酶联免疫检测仪重复检测3次，取其平均值。用SPSS法计算细胞IC₅₀值，根据测定的光密度(OD值)，制作细胞生长抑制率的标准曲线，求得其对应的药物浓度。按照下列公式计算细胞生长抑制率：细胞生长抑制率＝〔(对照组平均A₄₉₀值－实验组平均A₄₉₀值)/对照组平均A₄₉₀值〕×100％。

(4)实验结果

IC₅₀(半抑制浓度)是指HSC-T6细胞增殖被抑制一半时的化合物浓度，IC₅₀越小，抑制肝星状细胞增殖的活性越高。本发明中受试化合物I的IC₅₀＝53.21μM(表2)，充分表明化合物I对HSC-T6的增殖显示出较好的抑制活性。因此，本发明所述的新萘醌类化合物对于研制具有肝保护药物具有重要意义。

表2化合物抑制细胞增殖活性对抗TGFβ1刺激的HSC-T6细胞

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。