一种利用DNA序列构建核苷酸分子式鉴定海棠品种的方法

摘要

本发明公开了一种鉴定海棠品种的方法。本发明提供了鉴定海棠品种的方法，包括如下步骤：1)以待测海棠品种的基因组DNA为模板，用由序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；2)将所述PCR产物测序，根据测序结果列出所述待测海棠品种的核苷酸分子式；3)将步骤2)所得的核苷酸分子式与对应的若干个海棠品种的核苷酸分子式进行比对，从而确定所述待测海棠品种。本发明所提供的鉴定海棠品种的方法精确、操作简捷，提高相关产业的生产效率和质量监测水平，有效弥补现有技术的不足；另外，该方法同时实现了海棠品种非花期(如苗期)的鉴定，具有较高的灵敏度。

说明书

技术领域

本发明属于林业生物技术领域，涉及一种鉴定或辅助鉴定植物的方法，特别涉及一种利用DNA序列 构建核苷酸分子式鉴定海棠品种的方法。

背景技术

海棠(Malus spectabilis)是蔷薇科(Rosaceae)苹果属(Malus)的树种。海棠的花、叶和果实 具有重要的园林观赏价值，是名贵观赏花木。

海棠品种通常根据果实和花的特征进行分类，果期和花期以外的时间存在品种鉴定难的问题。由于 表型标记和DNA分子标记的数量少，现有标记灵敏度有限，存在同物异名和同名异物现象，苹果属植物， 尤其是海棠品种的鉴定是当前研究的难点。海棠品种资源的精确鉴定对于海棠育种、深度开发利用以及相 关的科学研究具有极为重要意义和价值。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测海棠品种的方法。

本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定待测海棠品种的方法，是利用DNA序列中的变异位点构建核苷 酸分子式，进而鉴定或辅助鉴定待测海棠品种的方法，具体包括如下步骤：

(1)以待测海棠品种的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA 分子组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；

(2)将所述PCR产物测序后获得了长度为786bp的一条DNA序列(截去前19碱基和第806个碱 基之后的剩余的变异区序列)。该序列中包含揭示海棠品种间遗传差异的变异位点；

(3)将所述待比对序列与DNA序列数据库中的全部序列放在一起，利用ClustalX或Mega等软件 进行比对，自动生成一个DNA比对序列矩阵；

所述DNA比对序列矩阵是根据特定的计分规则，将两个或多个序列按位置比较排列后产生的数据集， 最大限度地反映了序列间的相似性。其中涉及到的特定的计分规则和算法等相关常识和原理在“生物序列 分析”方面的专著中均有记载。所述DNA比对序列矩阵可直接反映各序列在同一核苷酸位点之间是否存 在差异，以及存在怎样的差异。找到核苷酸字母有差异的列在所述DNA比对序列矩阵中的位置，核准该 位置位于所述DNA比对序列矩阵5’端起的位置顺序编号，即确定了一个多态位点。

所述DNA序列库为如下(a1)：

(a1)由序列表中序列3至序列10中的至少一种组成；其中，序列3-10为长度786bp的序列。

(4)根据所述DNA比对序列矩阵列出所述待测海棠品种的核苷酸分子式；

所述待测海棠品种的核苷酸分子式的通式为：

B₄₉B₅₄B₁₁₈B₂₁₅B₃₂₂B₃₃₅B₃₄₈B₄₇₄B₅₁₅B₅₇₆B₅₇₇B₆₉₁；

在所述通式中，所述B₄₉、所述B₅₄、所述B₁₁₈、所述B₂₁₅、所述B₃₂₂、所述B₃₃₅、所述B₃₄₈、所述>474、所述B₅₁₅、所述B₅₇₆、所述B₅₇₇和所述B₆₉₁，依次表示在所述DNA序列比对数据矩阵中的第49、>

在所述通式中，每一个B为A、T、C和G中的任一品种或两个品种；

当所述待测海棠品种为纯合型时，在所述通式中，每一个B为A、T、C和G中的任一种，在测序 时显示单一峰；当所述待测海棠品种为杂合型时，在所述通式中，每一个B可能为A、T、C和G中的两 种，在测序时会得到明显的叠加套峰。

(5)将步骤(4)所得所述待测海棠品种的核苷酸分子式与核苷酸分子式组I进行比对；

所述核苷酸分子式组I由如下a1)-a10)共10种核苷酸分子式组成：

a1)A₄₉G₅₄G₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅C₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁；

a2)G₄₉G₅₄G₁₁₈G₂₁₅Y₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅C₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁；

a3)G₄₉G₅₄G₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅C₅₇₆A₅₇₇Y₆₉₁；

a4)G₄₉R₅₄G₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄R₅₁₅C₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁；

a5)G₄₉G₅₄S₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂W₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅Y₅₇₆W₅₇₇T₆₉₁；

a6)G₄₉R₅₄G₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅Y₅₇₆W₅₇₇T₆₉₁；

a7)G₄₉G₅₄G₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈R₄₇₄G₅₁₅C₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁；

a8)G₄₉G₅₄G₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅M₃₄₈R₄₇₄G₅₁₅C₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁；

a9)G₄₉R₅₄S₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅Y₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁；

a10)G₄₉G₅₄G₁₁₈R₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅T₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁；

在a1)-a10)中，M表示A和C；W表示A和T；K表示G和T；Y表示T和C；R表示A和G； S表示G和C；D表示G、A和T(即所述待测海棠品种的相应位点为杂合型)；

(6)根据步骤(5)的比对结果，按照如下方法对所述待测海棠品种进行品种鉴定：

若所述待测海棠品种的核苷酸分子式为a1)所示的核苷酸分子式，则所述待测海棠品种为或候选为 钟诺斯海棠(Malus tschonoskii)；

若所述待测海棠品种的核苷酸分子式为a2)所示的核苷酸分子式，则所述待测海棠品种为或候选为 ‘金胡蜂’珠美海棠(Malus×zumi‘Golden Hornet’)；

若所述待测海棠品种的核苷酸分子式为a3)所示的核苷酸分子式，则所述待测海棠品种为或候选为 ‘鲁道夫’海棠(Malus‘Rudolph’)；

若所述待测海棠品种的核苷酸分子式为a4)所示的核苷酸分子式，则所述待测海棠品种为或候选为 ‘粉屋顶’海棠(Malus‘Pink Spire’)；

若所述待测海棠品种的核苷酸分子式为a5)所示的核苷酸分子式，则所述待测海棠品种为或候选为 ‘火焰’海棠(Malus‘Flame’)；

若所述待测海棠品种的核苷酸分子式为a6)所示的核苷酸分子式，则所述待测海棠品种为或候选为 ‘钻石’海棠(Malus‘Sparkler’)；

若所述待测海棠品种的核苷酸分子式为a7)所示的核苷酸分子式，则所述待测海棠品种为或候选为 ‘斯普伦教授’珠美海棠(Malus×zumi‘Professor Sprenger’)；

若所述待测海棠品种的核苷酸分子式为a8)所示的核苷酸分子式，则所述待测海棠品种为或候选为 ‘奈微利考伯曼’海棠(Malus‘Neville Copeman’)；

若所述待测海棠品种的核苷酸分子式为a9)所示的核苷酸分子式，则所述待测海棠品种为或候选为 ‘红久’海棠(Malus‘Red Long’)；

若所述待测海棠品种的核苷酸分子式为a10)所示的核苷酸分子式，则所述待测海棠品种为或候选为 ‘垂丝’海棠(Malus halliana)；

当然，所述一种鉴定或辅助鉴定待测海棠品种的方法方法中，步骤(1)中采用的引物对不限于序列 表中序列1和序列2组成的引物对，位于保守区的其他的引物对也可以，只要能够扩增得到步骤(2)中 的所述待比对序列(非保守区)即可。

再有，在所述一种鉴定或辅助鉴定待测海棠品种的方法方法中，进行比对的所述待比对序列(非保 守区)，其两端保守区序列的去除不限于以上步骤(2)中所述，只要能够涵盖用于供试样品(如海棠品种) 鉴定的核苷酸分子式中的多态位点即可；相应的，步骤(4)中通式中B的右下角的编号也会因为5’端 保守区序列取舍的多少而相应地发生变化，但是，多态位点之间的相对位置不变。

进一步，以上本发明所提供的鉴定或辅助鉴定待测海棠品种的方法，其操作步骤可转化为如下：

(1)以待测海棠品种的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA 分子组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；

(2)将所述PCR产物测序，将测序结果与核苷酸序列组I进行比对；

所述核苷酸序列组I由序列表中序列3-12，共10个序列组成；

(3)根据步骤(2)的比对结果，按照如下方法对所述待测海棠品种进行鉴定：

若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列3，则所述待测海棠品种为或候选为钟诺斯海棠(Malus tschonoskii)；

若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列4，则所述待测海棠品种为或候选为‘金胡蜂’珠美海棠 (Malus×zumi‘Golden Hornet’)；

若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列5，则所述待测海棠品种为或候选为‘鲁道夫’海棠(Malus ‘Rudolph’)；

若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列6，则所述待测海棠品种为或候选为‘粉屋顶’海棠(Malus ‘Pink Spire’)；

若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列7，则所述待测海棠品种为或候选为‘火焰’海棠(Malus ‘Flame’)；

若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列8，则所述待测海棠品种为或候选为‘钻石’海棠(Malus ‘Sparkler’)；

若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列9，则所述待测海棠品种为或候选为‘斯普伦教授’珠美海 棠(Malus×zumi‘Professor Sprenger’)；

若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列10，则所述待测海棠品种为或候选为‘奈微利考伯曼’海棠 (Malus‘Neville Copeman’)；

若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列11，则所述待测海棠品种为或候选为‘红久’海棠(Malus‘Red Long’)；

若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列12，则所述待测海棠品种为或候选为‘垂丝’海棠(Malus halliana)。

在上述方法中，所述待测海棠品种为如下10个品种中的任一品种：钟诺斯海棠(Malus tschonoskii)、 ‘金胡蜂’珠美海棠(Malus×zumi‘Golden Hornet’)、‘鲁道夫’海棠(Malus‘Rudolph’)、‘粉屋顶’海棠(Malus ‘Pink Spire’)、‘火焰’海棠(Malus‘Flame’)、‘钻石’海棠(Malus‘Sparkler’)、‘斯普伦教授’珠美海棠 (Malus×zumi‘Professor Sprenger’)、‘奈微利考伯曼’海棠(Malus‘Neville Copeman’)、‘红久’海棠(Malus ‘Red Long’)、‘垂丝’海棠(Malus halliana)。

本发明的另一个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定待测海棠品种的试剂盒。

本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定待测海棠品种的试剂盒，具体可包括引物对、记载有核苷酸分 子式组I的对比卡；

所述引物对具体由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成；

所述核苷酸分子式组I具体由如下a1)-a10)共10种核苷酸分子式组成：

a1)A₄₉G₅₄G₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅C₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁；

a2)G₄₉G₅₄G₁₁₈G₂₁₅Y₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅C₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁；

a3)G₄₉G₅₄G₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅C₅₇₆A₅₇₇Y₆₉₁；

a4)G₄₉R₅₄G₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄R₅₁₅C₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁；

a5)G₄₉G₅₄S₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂W₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅Y₅₇₆W₅₇₇T₆₉₁；

a6)G₄₉R₅₄G₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅Y₅₇₆W₅₇₇T₆₉₁；

a7)G₄₉G₅₄G₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈R₄₇₄G₅₁₅C₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁；

a8)G₄₉G₅₄G₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅M₃₄₈R₄₇₄G₅₁₅C₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁；

a9)G₄₉R₅₄S₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅Y₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁；

a10)G₄₉G₅₄G₁₁₈R₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅T₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁；

在a1)-a10)中，M表示A和C；W表示A和T；K表示G和T；Y表示T和C；R表示A和G； S表示G和C；D表示G、A和T(即所述待测海棠品种的相应位点为杂合型)；

所述待测海棠品种可为如下10个品种中的任一品种：钟诺斯海棠(Malus tschonoskii)、‘金胡蜂’珠 美海棠(Malus×zumi‘Golden Hornet’)、‘鲁道夫’海棠(Malus‘Rudolph’)、‘粉屋顶’海棠(Malus‘Pink Spire’)、 ‘火焰’海棠(Malus‘Flame’)、‘钻石’海棠(Malus‘Sparkler’)、‘斯普伦教授’珠美海棠(Malus×zumi‘Professor Sprenger’)、‘奈微利考伯曼’海棠(Malus‘Neville Copeman’)、‘红久’海棠(Malus‘Red Long’)、‘垂丝’海棠 (Malus halliana)。

所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测海棠品种中的应用也属于本发明的保护范围。

所述待测海棠品种为如下10个品种中的任一品种：钟诺斯海棠(Malus tschonoskii)、‘金胡蜂’珠美 海棠(Malus×zumi‘Golden Hornet’)、‘鲁道夫’海棠(Malus‘Rudolph’)、‘粉屋顶’海棠(Malus‘Pink Spire’)、 ‘火焰’海棠(Malus‘Flame’)、‘钻石’海棠(Malus‘Sparkler’)、‘斯普伦教授’珠美海棠(Malus×zumi‘Professor Sprenger’)、‘奈微利考伯曼’海棠(Malus‘Neville Copeman’)、‘红久’海棠(Malus‘Red Long’)、‘垂丝’海棠 (Malus halliana)。

本发明的再一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测植物的方法。

本发明所提供的鉴定或辅助鉴定待测海棠品种的方法，具体可包括如下步骤：

(1)通过比对属于同一植物的多个品种的DNA序列，选取所述海棠品种的DNA序列中存在单核 苷酸多态位点的区域作为目的DNA区域；

(2)利用所述目的DNA区域两侧保守区域的序列，设计能够扩增得到含有所述目的DNA区域的 DNA片段的引物；

(3)用所述引物对所述多个植物中的每种植物的基因组DNA分别进行PCR扩增，从每个品种中得 到含有所述目的DNA区域的DNA片段；

(4)对步骤(3)从每种植物中获得的含有所述目的DNA区域的DNA片段进行测序，从而获得每 种植物的所述目的DNA区域的核苷酸序列；

(5)将所述多种植物的所述目的DNA区域的核苷酸序列放在一起进行比对，得到DNA比对序列 矩阵，根据所述DNA比对序列矩阵确定单核苷酸多态位点，列出每种植物的鉴定用核苷酸分子式；

所述核苷酸分子式由根据所述DNA比对序列矩阵从5’末端到3’末端或从3’末端到5’末端依次列出 所有的所述单核苷酸多态位点的核苷酸种类及其在所述DNA比对序列矩阵中的位置顺序编号组成；所述 核苷酸分子式通式为B_x1B_x2B_x3……B_xn，通式中，B为单核苷酸多态位点上的核苷酸种类，为A、T、C、>

所述B_x1B_x2B_x3……B_xn为将所有的所述单核苷酸多态位点按照在所述DNA比对序列矩阵中从5’末端>

(6)将具有相同所述核苷酸分子式的植物组成一个谱系，具有不同核苷酸分子式的植物作为不同的 谱系，所有谱系构成核苷酸分子式谱系表；

所述核苷酸分子式谱系表中，每一种核苷酸分子式对应来自一个谱系的植物或植株；

(7)将属于步骤(1)中所述同一植物的待测植物样品按照步骤(3)-(5)重复操作，用所述待测 植物替代步骤(3)-(5)中的所述每个植物植株，得到所述待测植物样品的核苷酸分子式；将所述待测植 物样品的核苷酸分子式与所述核苷酸分子式谱系表中的所有核苷酸分子式进行比较，按照如下方法确定所 述待测植物样品的名称及其隶属的谱系：若所述待测植物样品的核苷酸分子式与所述核苷酸分子式谱系表 中的一个核苷酸分子式相同，则所述待测植物样品为或候选为所述一个核苷酸分子式对应的所述谱系中的 任意一个品种。

所述方法灵敏度高，适用于鉴定某一种植物的不同品种。

在本发明中，所述植物具体为海棠品种的不同品种。

在所述方法中，所述目的DNA区域具体可来自于所述植物样品的基因组内的泛素连接酶基因区。

在本发明中，步骤(2)中，所述引物具体为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子 组成的引物对；所述目的DNA区域具体来自于采用所述引物对对所述植物样品的基因组DNA进行PCR 扩增所得的PCR产物。

进一步，所述海棠品种的多个品种及其对应的所述目的DNA区域为如下：

所述海棠品种的多个品种为如下10品种中的至少两品种：钟诺斯海棠(Malus tschonoskii)、‘金胡蜂’ 珠美海棠(Malus×zumi‘Golden Hornet’)、‘鲁道夫’海棠(Malus‘Rudolph’)、‘粉屋顶’海棠(Malus‘Pink Spire’)、 ‘火焰’海棠(Malus‘Flame’)、‘钻石’海棠(Malus‘Sparkler’)、‘斯普伦教授’珠美海棠(Malus×zumi‘Professor Sprenger’)、‘奈微利考伯曼’海棠(Malus‘Neville Copeman’)、‘红久’海棠(Malus‘Red Long’)、‘垂丝’海棠(Malus halliana)。

所述海棠品种的钟诺斯海棠(Malus tschonoskii)的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列3；

所述海棠品种的‘金胡蜂’珠美海棠(Malus×zumi‘Golden Hornet’)的所述DNA区域的核苷酸序列为 序列表中序列4；

所述海棠品种的‘鲁道夫’海棠(Malus‘Rudolph’)的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列5；

所述海棠品种的‘粉屋顶’海棠(Malus‘Pink Spire’)的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列6；

所述海棠品种的‘火焰’海棠(Malus‘Flame’)的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列7；

所述海棠品种的‘钻石’海棠(Malus‘Sparkler’)的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列8；

所述海棠品种‘斯普伦教授’珠美海棠(Malus×zumi‘Professor Sprenger’)的所述DNA区域的核苷酸 序列为序列表中序列9；

所述海棠品种‘奈微利考伯曼’海棠(Malus‘Neville Copeman’)的所述DNA区域的核苷酸序列为序 列表中序列10；

所述海棠品种的‘红久’海棠(Malus‘Red Long’)的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列11；

所述海棠品种的‘垂丝’海棠(Malus halliana)的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列12。

钟诺斯海棠(Malus tschonoskii)、‘金胡蜂’珠美海棠(Malus×zumi‘Golden Hornet’)、‘鲁道夫’海棠 (Malus‘Rudolph’)、‘粉屋顶’海棠(Malus‘Pink Spire’)、‘火焰’海棠(Malus‘Flame’)、‘钻石’海棠(Malus ‘Sparkler’)、‘斯普伦教授’珠美海棠(Malus×zumi‘Professor Sprenger’)、‘奈微利考伯曼’海棠(Malus‘Neville Copeman’)、‘红久’海棠(Malus‘Red Long’)、‘垂丝’海棠(Malus halliana)。

更加具体的，所述钟诺斯海棠(Malus tschonoskii)的所述DNA区域的核苷酸分子式为 A₄₉G₅₄G₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅C₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁；

所述‘金胡蜂’珠美海棠(Malus×zumi‘Golden Hornet’)的所述DNA区域的核苷酸分子式为>49G₅₄G₁₁₈G₂₁₅Y₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅C₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁；

所述‘鲁道夫’海棠(Malus‘Rudolph’)的所述DNA区域的核苷酸分子式为>49G₅₄G₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅C₅₇₆A₅₇₇Y₆₉₁；

所述‘粉屋顶’海棠(Malus‘Pink Spire’)的所述DNA区域的核苷酸分子式为>49R₅₄G₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄R₅₁₅C₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁；

所述‘火焰’海棠(Malus‘Flame’)的所述DNA区域的核苷酸分子式为>49G₅₄S₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂W₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅Y₅₇₆W₅₇₇T₆₉₁；

所述‘钻石’海棠(Malus‘Sparkler’)的所述DNA区域的核苷酸分子式为>49R₅₄G₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅Y₅₇₆W₅₇₇T₆₉₁；

所述‘斯普伦教授’珠美海棠(Malus×zumi‘Professor Sprenger’)的所述DNA区域的核苷酸分子式为>49G₅₄G₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈R₄₇₄G₅₁₅C₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁；

所述‘奈微利考伯曼’海棠(Malus‘Neville Copeman’)的所述DNA区域的核苷酸分子式为>49G₅₄G₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅M₃₄₈R₄₇₄G₅₁₅C₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁；

所述‘红久’海棠(Malus‘Red Long’)的所述DNA区域的核苷酸分子式为>49R₅₄S₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅Y₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁；

所述‘垂丝’海棠(Malus halliana)的所述DNA区域的核苷酸分子式为>49G₅₄G₁₁₈R₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅T₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁；

其中，M表示A和C；W表示A和T；K表示G和T；Y表示T和C；R表示A和G；S表示G和 C；D表示G、A和T(即所述待测海棠品种的相应位点为杂合型)。

本发明以海棠品种的鉴定过程为例，实验证明，本发明所提供的利用该分子式鉴定植物(如海棠品 种)的方法较为精确、操作简捷，可以提高相关产业的生产效率和质量监测水平，有效弥补以往方法的不 足；另外，该方法同时实现了非花期果期(如苗期)的精准鉴定。本方法对于促进海棠品种的育种、海棠 花木产业的发展及环境保护具有重要意义。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

海棠品种：钟诺斯海棠(Malus tschonoskii)、‘金胡蜂’珠美海棠(Malus×zumi‘Golden Hornet’)、‘鲁道 夫’海棠(Malus‘Rudolph’)、‘粉屋顶’海棠(Malus‘Pink Spire’)、‘火焰’海棠(Malus‘Flame’)、‘钻石’海棠 (Malus‘Sparkler’)、‘斯普伦教授’珠美海棠(Malus×zumi‘Professor Sprenger’)、‘奈微利考伯曼’海棠(Malus ‘Neville Copeman’)、‘红久’海棠(Malus‘Red Long’)、‘垂丝’海棠(Malus halliana)的幼叶采自山东省林 木种质资源中心种质资源库。

实施例1、利用核苷酸分子式鉴定海棠品种的方法的建立及其应用

为了构建能够用于有效鉴定海棠品种的核苷酸分子式，本发明的发明人从以下海棠品种系列中获得一 段非保守区DNA序列，并对其中的多态位点进行了统计分析。作为供试材料的海棠品种共10个品种，具 体如下：钟诺斯海棠(Malus tschonoskii)、‘金胡蜂’珠美海棠(Malus×zumi‘Golden Hornet’)、‘鲁道夫’海 棠(Malus‘Rudolph’)、‘粉屋顶’海棠(Malus‘Pink Spire’)、‘火焰’海棠(Malus‘Flame’)、‘钻石’海棠(Malus ‘Sparkler’)、‘斯普伦教授’珠美海棠(Malus×zumi‘Professor Sprenger’)、‘奈微利考伯曼’海棠(Malus‘Neville Copeman’)、‘红久’海棠(Malus‘Red Long’)、‘垂丝’海棠(Malus halliana)。

一、引物设计

根据一段非保守区DNA序列两端的保守区，设计如下引物：

正向引物：5’-GATTATGCCGAACATAGGAGT-3’(序列1)；

反向引物：5’-CCAGTGCCCACTTCACC-3’(序列2)。

二、PCR扩增及PCR产物的序列测定

以作为供试材料的10份海棠品种的幼嫩叶片为实验材料，采用植物基因组DNA提取试剂盒(中国天 根生物技术(北京)有限公司产品，其产品目录号为DP305)提取各样品材料的基因组DNA。以所得基 因组DNA为模板，采用步骤一设计的引物对进行PCR扩增。结果显示，每份海棠品种均可得到一条长度 约为lkb的PCR产物。

对纯化后的各PCR产物进行测序，获得了含有若干多态位点的长度为786bp的DNA序列。根据供试 的10份海棠品种的测序结果，将DNA序列定义为所述PCR产物的核苷酸序列自5’端起的第20-805位 (786bp)。将所述PCR产物的核苷酸序列自5’端起的第20个核苷酸记为第1位。(这个变异的高频率发 生区域，未来也可能出现较长或较短的序列变化，可能会因待测样品的不同而略有变化，届时可根据实际 情况获得比对序列矩阵，确定后面的多态位点的位置顺序编号。)

10份海棠品种分别是钟诺斯海棠(Malus tschonoskii)、‘金胡蜂’珠美海棠(Malus×zumi‘Golden Hornet’)、 ‘鲁道夫’海棠(Malus‘Rudolph’)、‘粉屋顶’海棠(Malus‘Pink Spire’)、‘火焰’海棠(Malus‘Flame’)、‘钻石’ 海棠(Malus‘Sparkler’)、‘斯普伦教授’珠美海棠(Malus×zumi‘Professor Sprenger’)、‘奈微利考伯曼’海棠 (Malus‘Neville Copeman’)、‘红久’海棠(Malus‘Red Long’)、‘垂丝’海棠(Malus halliana)。

结果显示，钟诺斯海棠(Malus tschonoskii)的DNA序列为序列表中序列3；

‘金胡蜂’珠美海棠(Malus×zumi‘Golden Hornet’)的DNA序列为序列表中序列4；

‘鲁道夫’海棠(Malus‘Rudolph’)的DNA序列为序列表中序列5；

‘粉屋顶’海棠(Malus‘Pink Spire’)的DNA序列为序列表中序列6；

‘火焰’海棠(Malus‘Flame’)的DNA序列为序列表中序列7；

‘钻石’海棠(Malus‘Sparkler’)的DNA序列为序列表中序列8；

‘斯普伦教授’珠美海棠(Malus×zumi‘Professor Sprenger’)的DNA序列为序列表中序列9；

‘奈微利考伯曼’海棠(Malus‘Neville Copeman’)的DNA序列为序列表中序列10；

‘红久’海棠(Malus‘Red Long’)的DNA序列为序列表中序列11；

‘垂丝’海棠(Malus halliana)的DNA序列为序列表中序列12。

三、序列比对

将步骤二所得的10份海棠品种的DNA序列进行比对，获得DNA比对序列矩阵(aligned sequence matrix)。进而获得如表1中的海棠品种鉴定用12个单核苷酸多态位点。

表1 10份海棠品种的DNA序列中的单核苷酸多态位点

注：M表示A和C；W表示A和T；K表示G和T；Y表示T和C；R表示A和G；S表示G和C； D表示G、A和T(即所述待测海棠品种的相应位点为杂合型)。在测序时相应杂合位点会检测到明显的叠 加的套峰。“多态位点的位置编号”为在所述DNA比对序列矩阵中的位置编号。

只有通过比对排序，才能显示出样品间序列差异的规律性，这是生物信息学理论和原理的组成部分。

四、用于海棠品种鉴定的核苷酸分子式的构建

根据表1中所列的海棠品种的每个多态位点的核苷酸字母及其在DNA比对序列矩阵中的位置，列出 各海棠品种相应的核苷酸分子式，具体如下：

钟诺斯海棠(Malus tschonoskii)、‘金胡蜂’珠美海棠(Malus×zumi‘Golden Hornet’)、‘鲁道夫’海棠(Malus ‘Rudolph’)、‘粉屋顶’海棠(Malus‘PinkSpire’)、‘火焰’海棠(Malus‘Flame’)、‘钻石’海棠(Malus‘Sparkler’)、 ‘斯普伦教授’珠美海棠(Malus×zumi‘Professor Sprenger’)、‘奈微利考伯曼’海棠(Malus‘Neville Copeman’)、 ‘红久’海棠(Malus‘Red Long’)、‘垂丝’海棠(Malus halliana)。

钟诺斯海棠(Malus tschonoskii)的核苷酸分子式为A₄₉G₅₄G₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅C₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁；

‘金胡蜂’珠美海棠(Malus×zumi‘Golden Hornet’)的核苷酸分子式为>49G₅₄G₁₁₈G₂₁₅Y₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅C₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁；

‘鲁道夫’海棠(Malus‘Rudolph’)的核苷酸分子式为G₄₉G₅₄G₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅C₅₇₆A₅₇₇Y₆₉₁；

‘粉屋顶’海棠(Malus‘Pink Spire’)的核苷酸分子式为G₄₉R₅₄G₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄R₅₁₅C₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁；

‘火焰’海棠(Malus‘Flame’)的核苷酸分子式为G₄₉G₅₄S₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂W₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅Y₅₇₆W₅₇₇T₆₉₁；

‘钻石’海棠(Malus‘Sparkler’)的核苷酸分子式为G₄₉R₅₄G₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅Y₅₇₆W₅₇₇T₆₉₁；

‘斯普伦教授’珠美海棠(Malus×zumi‘Professor Sprenger’)的核苷酸分子式为>49G₅₄G₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈R₄₇₄G₅₁₅C₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁；

‘奈微利考伯曼’海棠(Malus‘Neville Copeman’)的核苷酸分子式为>49G₅₄G₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅M₃₄₈R₄₇₄G₅₁₅C₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁；

‘红久’海棠(Malus‘Red Long’)的核苷酸分子式为G₄₉R₅₄S₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅Y₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁；

‘垂丝’海棠(Malus halliana)的核苷酸分子式为G₄₉G₅₄G₁₁₈R₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅T₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁。

以上各核苷酸分子式中的M均表示A和C；K均表示G和T；Y均表示T和C；R均表示A和G。 即核苷酸分子式中含有的M、K、Y或R为海棠品种基因组内的杂合位点，在测序时会得到明显的叠加的 套峰。

五、用核苷酸分子式鉴定海棠品种

(1)以待测海棠品种的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA 分子组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；

(2)将所述PCR产物测序后，截掉所述PCR产物的核苷酸序列自5’末端起的前19个核苷酸(所 述19个核苷酸为PCR产物5’端的保守区序列；当然也可以同时截掉PCR产物3’端的第806个(含)以 后的核苷酸)，剩余序列作为待比对序列(非保守区)；

(3)将所述待比对序列与DNA序列库中的全部序列放在一起进行比对，得到DNA比对序列矩阵；

所述DNA序列库为如下(a1)：

(a1)由序列表中序列3至序列12中的至少一种组成；

(4)根据所述DNA比对序列矩阵列出所述待测海棠品种的核苷酸分子式；

所述待测海棠品种的核苷酸分子式的通式为：

B₄₉B₅₄B₁₁₈B₂₁₅B₃₂₂B₃₃₅B₃₄₈B₄₇₄B₅₁₅B₅₇₆B₅₇₇B₆₉₁；

在所述通式中，所述B₄₉、所述B₅₄、所述B₁₁₈、所述B₂₁₅、所述B₃₂₂、所述B₃₃₅、所述B₃₄₈、所述>474、所述B₅₁₅、所述B₅₇₆、所述B₅₇₇和所述B₆₉₁，依次表示在所述DNA序列比对数据矩阵中的第49、>

在所述通式中，每一个B为A、T、C和G中的任一种或两种(当所述待测海棠品种的具体核苷酸 位点为纯合型位点时，在所述通式中，每一个B为A、T、C和G中的任一种，在测序时显示单一峰；当 所述待测海棠品种的具体核苷酸位点为杂合型位点时，在所述通式中，每一个B为A、T、C和G中的两 种，在测序时会得到明显的叠加的套峰。

(5)按照如下方法对所述待测海棠品种进行鉴定：

钟诺斯海棠(Malus tschonoskii)、‘金胡蜂’珠美海棠(Malus×zumi‘Golden Hornet’)、‘鲁道夫’海棠(Malus ‘Rudolph’)、‘粉屋顶’海棠(Malus‘Pink Spire’)、‘火焰’海棠(Malus‘Flame’)、‘钻石’海棠(Malus‘Sparkler’)、 ‘斯普伦教授’珠美海棠(Malus×zumi‘Professor Sprenger’)、‘奈微利考伯曼’海棠(Malus‘Neville Copeman’)、 ‘红久’海棠(Malus‘Red Long’)、‘垂丝’海棠(Malus halliana)。

若所述待测海棠品种的核苷酸分子式为A₄₉G₅₄G₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅C₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁，则所述待测>

若所述待测海棠品种的核苷酸分子式为G₄₉G₅₄G₁₁₈G₂₁₅Y₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅C₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁，则所述待测>

若所述待测海棠品种的核苷酸分子式为G₄₉G₅₄G₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅C₅₇₆A₅₇₇Y₆₉₁，则所述待测>

若所述待测海棠品种的核苷酸分子式为G₄₉R₅₄G₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄R₅₁₅C₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁，则所述待测海>

若所述待测海棠品种的核苷酸分子式为G₄₉G₅₄S₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂W₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅Y₅₇₆W₅₇₇T₆₉₁，则所述待测>

若所述待测海棠品种的核苷酸分子式为G₄₉R₅₄G₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅Y₅₇₆W₅₇₇T₆₉₁，则所述待测>

若所述待测海棠品种的核苷酸分子式为G₄₉G₅₄G₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈R₄₇₄G₅₁₅C₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁，则所述待测海>

若所述待测海棠品种的核苷酸分子式为G₄₉G₅₄G₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅M₃₄₈R₄₇₄G₅₁₅C₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁，则所述待测>

若所述待测海棠品种的核苷酸分子式为G₄₉R₅₄S₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅Y₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁，则所述待测海>

若所述待测海棠品种的核苷酸分子式为G₄₉G₅₄G₁₁₈R₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅T₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁，则所述待测海>

六、海棠品种的新分类检索表

根据步骤五所得各样品的核苷酸分子式编制出10份海棠品种的新分类检索表，见表2。

表210份海棠品种的新分类检索表

1a.A₄₉型.................................钟诺斯海棠

1b.G₄₉型.................................本检索表内的其它样品

3a.Y₃₂₂型.................................‘金胡蜂’珠美海棠

3b.T₃₂₂型.................................本检索表内的其它样品

4a.Y₆₉₁型.................................‘鲁道夫’海棠

4b.T₆₉₁型.................................本检索表内的其它样品

5a.R₅₁₅型.................................‘粉屋顶’海棠

5b.G₅₁₅型.................................本检索表内的其它样品

6a.W₅₇₇型

7a.G₅₄S₁₁₈W₃₃₅型........................‘火焰’海棠

7b.R₅₄G₁₁₈T₃₃₅型........................‘钻石’海棠

6b.A₅₇₇型..............................本检索表内的其它样品

8a.G₄₇₄型

9a.C₃₄₈R₆₆₀R₇₆₀型.....................‘斯普伦教授’珠美海棠

9b.M₃₄₈G₆₆₀G₇₆₀型.....................‘奈微利考伯曼’海棠

8b.R₄₇₄型..............................本检索表内的其它样品

10a.S₁₁₈型

11a.G₅₄W₃₃₅Y₃₇₄W₅₇₇R₇₆₀型............‘火焰’海棠

11b.R₅₄T₃₃₅C₃₇₄A₅₇₇G₇₆₀型............‘红久’海棠

10b.G₁₁₈型..............................本检索表内的其它样品

12a.R₂₁₅型..............................‘垂丝’海棠

12b.G₂₁₅型.................................本检索表内的其它样品

实施例2、鉴定苹果属的其他海棠品种

为了验证实施例1建立的核苷酸分子式对于海棠品种鉴定的有效性和特异性，本发明的发明人还采集 了西府海棠(Malus×micromalus)、‘范爱赛尔亭’海棠(Malus‘Van Eseltine’)、‘王族’海棠(Malus‘Royalty’)、 ‘绚丽’海棠(Malus‘Radiant’)、‘乌红’海棠(Malus‘BlackRed’)，这5份海棠品种的叶片，并按照实施例1 的方法，提取其基因组DNA，用由序列1和序列2所示的两条单链DNA分子构成的引物对进行PCR扩 增和测序，获得了5份海棠品种的DNA序列。其中，西府海棠(Malus×micromalus)的DNA序列为序列 表中序列13所示；‘范爱赛尔亭’海棠(Malus‘Van Eseltine’)的DNA序列为序列表中序列14所示；‘王 族’海棠(Malus‘Royalty’)的DNA序列为序列表中序列15所示；‘绚丽’海棠(Malus‘Radiant’)的DNA 序列为序列表中序列16所示；‘乌红’海棠(Malus‘Black Red’)的DNA序列为序列表中序列17所示。

将序列13-17这5份海棠品种的DNA序列与前述10份海棠品种的序列放在一起，利用软件(如Mega 软件)进行比对，获得DNA比对序列矩阵，进一步列出西府海棠(Malus×micromalus)的核苷酸分子式， 为：G₄₉G₅₄G₁₁₈R₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅Y₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁；‘范爱赛尔亭’海棠(Malus‘Van>49R₅₄G₁₁₈R₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅C₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅Y₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁；‘王族’海棠(Malus‘Royalty’)的核苷酸分子式，>49G₅₄G₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅A₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅C₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁；‘绚丽’海棠(Malus‘Radiant’)的核苷酸分子式，为：>49R₅₄G₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅M₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅C₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁；‘乌红’海棠(Malus‘Black Red’)的核苷酸分子式，为：>49G₅₄G₁₁₈G₂₁₅T₃₂₂T₃₃₅M₃₄₈G₄₇₄G₅₁₅C₅₇₆A₅₇₇T₆₉₁。

可见，西府海棠(Malus×micromalus)、‘范爱赛尔亭’海棠(Malus‘Van Eseltine’)、‘王族’海棠(Malus ‘Royalty’)、‘绚丽’海棠(Malus‘Radiant’)、‘乌红’海棠(Malus‘Black Red’)，这5份海棠品种的核苷酸分 子式各不相同，且与实施例1中的10份海棠品种对应的10种核苷酸分子式均不相同。从而，证实了本发 明方法的有效性和特异性。预示着本方法在未来分类应用方面仍然具有巨大的价值和潜力。