一种从茯苓中制备猪苓酸C的方法

摘要

本发明公开了从茯苓中制备猪苓酸C的方法，以茯苓为原料，经粉碎、提取、过滤、浓缩、萃取，萃取物首先经过真空液相层析进行粗分，制得猪苓酸C粗产物，猪苓酸C粗产物再经动态轴向压缩色谱技术进行分离纯化，制得猪苓酸C较纯品，最后经重结晶得到猪苓酸C。与现有的工艺方法相比，本发明方法具有工作效率高、粗提溶剂成本低、填料分离精度高、可反复利用、层析溶剂成本低、对环境污染相对较轻、猪苓酸C纯度高等优点，适合工业型制备。

说明书

技术领域

本发明属于中药现代化领域，具体涉及一种从茯苓中制备猪苓酸C的方法。

背景技术

茯苓又称玉灵、茯灵、万灵桂、茯菟，为多菌科真菌Poriacocos(Schw.)Wolf的菌核，性平，味甘、淡，具有利水渗湿，健脾宁心作用，用于水肿尿少、痰饮眩悸、脾虚食少、便溏泄泻、心神不安、惊悸失眠。

现代药理研究表明，茯苓具有增强免疫、延缓衰老、抗肿瘤、抗病毒、抗炎等作用。目前，从茯苓中分离出多种化学成分，主要包括多糖类及萜类化合物，除此之外，还含有甾体类化合物、脂肪酸、蛋白质、腺嘌呤、氨基酸及多种无机元素等。已有研究表明从茯苓中分离得到的猪苓酸C具有抗肿瘤及增强免疫功能的作用，现有分离纯化猪苓酸C的方法，大多采用传统的常压硅胶色谱分离，普遍产率低，纯度差，针对不强，不能满足大批量制备的需求。

发明内容

本发明的目的在于一种从茯苓中制备猪苓酸C的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种从茯苓中制备猪苓酸C的方法，它以茯苓为原料，经粉碎、提取、过滤、浓缩、萃取，萃取物首先经真空液相层析进行粗分制得猪苓酸C粗产物，猪苓酸C粗产物再经动态轴向压缩色谱技术进行分离纯化，制得猪苓酸C较纯品，最后经重结晶得到高纯度猪苓酸C。

本发明所述的一种从茯苓中制备猪苓酸C的方法，具体包括以下步骤：

(1)茯苓块粉粹成粉末，加入茯苓粉末10～20倍重量体积的提取溶剂，回流提取3～5次，每次1～3小时，得提取液；

(2)合并提取液，过滤，得到的滤液减压浓缩，得到浓缩液；

(3)浓缩液用等体积的乙酸乙酯萃取3～5次，乙酸乙酯萃取层减压浓缩，得到乙酸乙酯部位稠浸膏；

(4)乙酸乙酯部位稠浸膏加入硅胶拌样，得到样品硅胶A；

(5)样品硅胶A采用真空液相层析进行粗分，得到猪苓酸C粗产品；

条件为：层析柱规格为100×800mm，填料为200～300目柱层析硅胶，真空压力为0.04-0.08MPa，以石油醚:乙酸乙酯＝5:1为洗脱剂洗脱4BV除杂，再以石油醚:乙酸乙酯＝3:1～1:1为洗脱剂洗脱，收集洗脱液，减压浓缩干燥，得到猪苓酸C粗产品；

(6)猪苓酸C粗产品用甲醇溶解，加入硅胶拌样，得到样品硅胶B；

(7)样品硅胶B采用动态轴向压缩色谱技术(DAC)进行分离纯化得到猪苓酸C较纯品；

条件为：色谱柱为正相色谱柱，规格为(50-150)×(300-1000)mm，填料为柱层析硅胶200～300目；气压表设置为50-80psi，油压表设置为1500-2000psi；检测波长为238nm；

以石油醚:乙酸乙酯:冰醋酸＝65:10:1～55:10:1为起始洗脱剂，流速为30～100mL/min，充分洗脱3～5个保留体积，除杂；再以石油醚:乙酸乙酯:冰醋酸＝55:10:1～35:10:1为洗脱剂，进行洗脱，流速为30～100mL/min，于238nm波长下监视流出曲线以指导产品收集，收集液经浓缩干燥后，得到猪苓酸C较纯品；

(8)步骤(7)获得的猪苓酸C较纯品用无水乙醇溶解完全，过滤，滤液在温度-4～5℃结晶，过滤得到猪苓酸C晶体。

步骤(1)中，所述的提取溶剂为80～100％的乙醇或甲醇。

步骤(2)中，所述的浓缩液在60℃时比重为1.1～1.3。

步骤(3)中，浓缩液用乙酸乙酯萃取3～5次，每次萃取时乙酸乙酯的体积与浓缩液体积相同。

步骤(4)中，乙酸乙酯部位稠浸膏加入60-80目硅胶拌样，得到样品硅胶A。

步骤(6)中，猪苓酸C粗产品用甲醇溶解，加入200-300目硅胶拌样，得到样品硅胶B。

步骤(8)中，步骤(7)获得的猪苓酸C较纯品用无水乙醇溶解完全得到饱和溶液；过滤，滤液装入洁净的烧杯，放入冰箱-4～5℃冷藏，直到晶体数量不再增加时，过滤得到纯度为98％以上猪苓酸C晶体。

本发明中，猪苓酸C粗产品中猪苓酸C的纯度不高于30％；猪苓酸C较纯品中猪苓酸C的纯度不低于90％，在91～93％之间；高纯度猪苓酸C的纯度不低于98％。

发明人通过理化性质和现代波谱学手段(¹H>13C>1H>5)δ：5.57(1H,d,J＝6.6Hz,H-7),5.32(1H,s,H-11),4.98,4.85(各1H,s,H-31),4.53(1H,t,J＝6.3Hz,H-16),1.44(3H,s,H-30),1.12(3H,s,H-29),1.12(3H,s,H-19),1.05(6H,s,H-18,28),0.99,0.97(各3H,d,J＝6.5Hz,H-26,H-27).¹³C>5)δ：215.6(C-3),178.3(-COOH,信号非常弱),156.2(C-24),144.9(C-9),142.7(C-8),120.8(C-7),117.5(C-11),107.2(C-31),76.4(C-16),57.7(C-17),51.0(C-5),49.6(C-14),48.9(C-20),47.2(C-4),45.1(C-13),44.1(C-15),37.4(C-10),36.9(C-1),36.2(C-12),34.8(C-2)。综上所述，证实该化合物为猪苓酸C。

本发明的有益效果：

本发明以茯苓为原料，经过粉碎、醇提、萃取、真空液相层析等工艺制得粗产物，粗产物再经动态轴向压缩色谱技术进行分离纯化，得到猪苓酸C。与现有的工艺方法相比，具有工作效率高、粗提溶剂成本低、填料分离精度高可反复利用、层析溶剂成本低、对环境污染相对较轻、猪苓酸C纯度高等优点，采用动态轴向压缩柱系统一次制备量大，适合工业型制备。

附图说明

图1为实施例1真空液相层析后猪苓酸C粗产品HPLC色谱图。

图2为实施例1动态轴向压缩色谱纯化后猪苓酸C较纯品HPLC色谱图。

图3为实施例1猪苓酸C晶体HPLC色谱图。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1

一种从茯苓中制备猪苓酸C的方法，具体包括以下步骤：

(1)茯苓块120kg粉粹成粉末，加入茯苓粉末15倍重量体积的85％乙醇(即茯苓粉末和85％乙醇的重量体积比为1kg:15L)，回流提取3次，每次1小时，得提取液；

(2)合并提取液，过滤，得到的滤液减压浓缩，得到60℃时比重为1.2的浓缩液；

(3)浓缩液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯萃取层减压浓缩，得到乙酸乙酯部位稠浸膏；

(4)乙酸乙酯部位稠浸膏加入1.5-2倍重量的60-80目硅胶拌样，得到样品硅胶A；

(5)样品硅胶A采用真空液相层析进行粗分，得到猪苓酸C粗产品；

条件：层析柱规格为100×800mm，填料为200～300目柱层析硅胶，真空压力为0.04-0.08MPa，先用石油醚:乙酸乙酯＝5:1(体积比)洗脱，馏分减压浓缩干燥后干物质由少变多，再由多变少，直至干物质很少，此时除杂，共洗脱4BV；再用石油醚:乙酸乙酯＝3:1洗脱，收集洗脱液，减压浓缩干燥，即为猪苓酸C粗产品，纯度为25.6％(见图1)；

(6)猪苓酸C粗产品用甲醇溶解，加入1.5-2倍重量的200-300目硅胶拌样，得到样品硅胶B；

(7)样品硅胶B采用动态轴压缩色谱技术进行分离纯化；

动态轴向压缩色谱技术分离纯化的条件为：色谱柱为正相色谱柱，规格为80×400mm，填料为柱层析硅胶200～300目；气压表设置为60psi，油压表设置为1500psi；检测波长为238nm；

以石油醚:乙酸乙酯:冰醋酸＝55:10:1为起始洗脱剂，流速为30mL/min，充分洗脱3个保留体积，除杂；再以石油醚：乙酸乙酯：冰醋酸＝35:10:1为洗脱剂，进行洗脱，流速为30mL/min，于238nm波长下监视流出曲线以指导产品收集，收集液经浓缩干燥后，得到纯度为92.1％的猪苓酸C较纯品(见图2)；

(8)将获得的猪苓酸C较纯品用无水乙醇溶解完全得到饱和溶液，过滤，滤液装入洁净的烧杯，放入冰箱冷藏，在温度-4～5℃结晶，直到晶体数量不再增加，过滤，得到纯度为99.3％的猪苓酸C晶体15.3g(见图3)。

实施例2

一种从茯苓中制备猪苓酸C的方法，具体包括以下步骤：

(1)茯苓块150kg粉粹成粉末，加入茯苓粉末20倍重量体积的70％乙醇，回流提取4次，每次2小时，得提取液；

(2)合并提取液，过滤，得到的滤液减压浓缩至60℃时比重为1.1的浓缩液；

(3)浓缩液用等体积的乙酸乙酯萃取4次，乙酸乙酯萃取层减压浓缩，得到乙酸乙酯部位稠浸膏；

(4)乙酸乙酯部位稠浸膏加入1.5-2倍60-80目硅胶拌样，得到样品硅胶A；

(5)样品硅胶A采用真空液相层析进行粗分；

条件：层析柱规格为100×800mm，填料为200～300目柱层析硅胶，真空压力为0.04-0.08MPa，先用石油醚:乙酸乙酯＝5:1洗脱，馏分减压浓缩干燥后干物质由少变多，再由多变少，直至干物质很少时，共洗脱4BV；再用石油醚:乙酸乙酯＝2:1洗脱，收集洗脱液，减压浓缩干燥，得到猪苓酸C粗产品，纯度为23.2％；

(6)猪苓酸C粗产品用甲醇溶解，加入1.5-2倍200-300目硅胶拌样，得到样品硅胶B；

(7)样品硅胶B采用动态轴压缩色谱技术进行分离纯化；

动态轴向压缩色谱技术分离纯化的条件为：色谱柱为正相色谱柱，规格为50×800mm，填料为柱层析硅胶200～300目，气压表设置为65psi，油压表设置为1700psi；流速为50mL/min，检测波长为238nm；

以石油醚:乙酸乙酯:冰醋酸＝60:10:1为起始洗脱剂，流速为50mL/min，充分洗脱4个保留体积，除杂；再以石油醚：乙酸乙酯：冰醋酸＝45:10:1为洗脱剂，进行洗脱，流速为50mL/min，于238nm波长下监视流出曲线以指导产品收集，收集液经浓缩干燥后，得到纯度为91.3％的猪苓酸C较纯品；

(8)将获得的猪苓酸C较纯品用无水乙醇溶解完全得到饱和溶液，过滤，滤液装入洁净的烧杯，放入冰箱冷藏，在温度-4～5℃结晶，直到晶体数量不再增加，过滤，得到纯度为98.8％的猪苓酸C晶体18.6g。

实施例3

一种从茯苓中制备猪苓酸C的方法，具体包括以下步骤：

(1)茯苓块200kg粉粹成粉末，加入茯苓粉末10倍重量体积的95％乙醇，回流提取5次，每次3小时，得提取液；

(2)合并提取液，过滤，得到的滤液减压浓缩至60℃时比重为1.3的浓缩液；

(3)浓缩液用等体积的乙酸乙酯萃取5次，乙酸乙酯萃取层减压浓缩，得到乙酸乙酯部位稠浸膏；

(4)乙酸乙酯部位稠浸膏加入1.5-2倍60-80目硅胶拌样，得到样品硅胶A；

(5)样品硅胶A采用真空液相层析进行粗分；

条件：层析柱规格为100×800mm，填料为200～300目柱层析硅胶，真空压力为0.04-0.08MPa，先用石油醚:乙酸乙酯＝5:1洗脱，馏分减压浓缩干燥后干物质由少变多，再由多变少，直至干物质很少时，共洗脱4BV；再用石油醚:乙酸乙酯＝1:1洗脱，收集洗脱液，减压浓缩干燥，得到猪苓酸C粗产品，纯度为21.3％。

(6)猪苓酸C粗产品用甲醇溶解，加入1.5-2倍200-300目硅胶拌样，得到样品硅胶B；

(7)样品硅胶B采用动态轴压缩色谱技术进行分离纯化；

动态轴向压缩色谱技术分离纯化的条件为：色谱柱为正相色谱柱，规格为60×700mm，填料为柱层析硅胶200～300目，气压表设置为80psi，油压表设置为2000psi；检测波长为238nm；

以石油醚:乙酸乙酯:冰醋酸＝65:10:1为起始洗脱剂，流速为80mL/min，充分洗脱5个保留体积，除杂；再以石油醚:乙酸乙酯:冰醋酸＝55:10:1为用洗脱剂，流速为80mL/min，进行洗脱，于238nm波长下监视流出曲线以指导产品收集，收集液经浓缩干燥后，得到纯度为91.8％的猪苓酸C较纯品；

(8)将获得的猪苓酸C较纯品用无水乙醇溶解完全得到饱和溶液，过滤，滤液装入洁净的烧杯，放入冰箱冷藏，在温度-4～5℃结晶，直到晶体数量不再增加，过滤，得到纯度为99.2％的猪苓酸C晶体20.7g。